Existem diferentes abordagens de cristalização para a obtenção de cristais de grande e alta qualidade tanto para a cristalografia de raios-X quanto para o cristalismo de nêutrons. Uma dessas abordagens é o uso do método de diálise. Nesta técnica, a solução proteica é separada de uma solução precipitante por uma membrana semi-permeável.
As moléculas precipitantes se difundem através da membrana na câmara de proteínas. Quando a supersaturação correta para uma nucleação espontânea é alcançada, os primeiros núcleos aparecerão. Aqui, demonstraremos um protocolo que pode ser usado pelo OptiCrys um instrumento totalmente automatizado desenvolvido em nosso laboratório que usa cristalização de diálise controlada por temperatura, e nossos botões de microdiálise para o crescimento de grandes cristais de alta qualidade para cristalografia macromolecular natural com base no conhecimento do diagrama de fase de cristalização.
Para um botão de micro diálise com certa pipeta de volume microliter 35 microliters de solução de lise na câmara de diálise. Este volume extra cria uma forma ligeiramente de cúpula em cima da câmara de diálise e impede a formação de bolhas de ar. Pegue um aplicador e coloque o elástico ou anel na extremidade dele.
Coloque a membrana na parte superior da câmara e fixe-a transferindo o elástico ou anel do aplicador para o sulco do botão de diálise. Transfira o botão para o poço que contém a solução de cristalização. Cubra o poço com um deslizamento de tampa de vidro ou um pedaço de fita.
Mantenha a amostra em 293 Kelvin em uma incubadora reguladora térmica livre de vibração. Sabendo que a cristalização da diálise oferece vantagens do ponto de vista do crescimento cristalino, o banco de cristalização chamado OptiCrys foi projetado e desenvolvido em nosso laboratório para oferecer um controle combinado totalmente automatizado da temperatura e composição química do experimento de cristalização biomolecular. A otimização do crescimento do cristal pelo OptiCrys é baseada nos diagramas de fase de concentração precipitantes de temperatura.
A nucleação ocorre na zona de nucleação nas proximidades da zona metastável e o crescimento cristalino ocorre então na zona metastável após o diagrama de fase, até que a concentração proteica atinja a curva de solubilidade representando o equilíbrio termodinâmico entre solução e cristais. Ao diminuir a temperatura em caso de proteína com solubilidade direta ou aumentando a concentração precipitante em caso de salgamento, a solução de cristalização permanece na zona metastável e não ocorre nucleação. Os cristais crescem até que o equilíbrio da segunda solução cristalina alcance e, depois disso, não é observado mais aumento no tamanho dos cristais.
Diminuir a temperatura ou aumentar a concentração precipitada é repetido várias vezes até que os cristais atinjam o tamanho desejado. Adicione a solução proteica à câmara de diálise da configuração de fluxo controlado pela temperatura, cubra a câmara sobre com a membrana de diálise e fixe a membrana com o elástico ou anel. Vire a câmara e coloque-a em cima da câmara de diálise.
Pressione-o suavemente e lentamente para remover todo o ar preso entre duas peças, fixar o reservatório em sua posição, aparafusando-o suavemente em cima da câmara. Adicione a solução de cristalização à câmara do reservatório e cubra-a pela tampa hermética. Transfira este conjunto e inseri-lo no suporte mamário do banco de cristalização OptiCrys Crystal growth é um software de supervisão do Cristalização Bench OptiCrys.
Ele inclui quatro interfaces gráficas ou visualizações diferentes. A visão inicial contém botões para navegar para as outras visualizações. O objetivo da interface de configuração é definir um cenário de experimento que pode ser executado automaticamente na exibição do teste.
A última vista é a visão de manutenção. Para reiniciar um experimento, a visão de manutenção deve estar aberta onde todos os parâmetros essenciais para o funcionamento suave dos experimentos de cristalização são encontrados. Aumente a luminosidade da seção de luz, a luz pode aumentar de zero, sem luz para 100 brilho máximo.
Para controlar e monitorar a temperatura, a seção reguladora de temperatura é usada. Clique no botão para ligá-lo. Coloque a temperatura na seção de ponto de configuração e pressione enter.
Abaixo deste botão, há dois gráficos. O vermelho mostra a final, a temperatura da ordem e o gráfico amarelo mostra a temperatura atual. Misturando soluções de estoque, uma injeção da solução de cristalização para a câmara do reservatório é controlada pela seção Palm.
Adicione a concentração da solução de estoque na primeira etapa. Em seguida, encontre a concentração final de cada nova solução de garoupador e adicione-as à seção de concentração final. Depois de pressionar o botão de cálculo, descubra que o volume da solução de estoque será calculado e adicionará no painel de volume na frente de cada painel de concentração.
Pressione o botão de preparação de lançamento e aguarde até que a nova solução premier esteja pronta. Para trocar a solução de cristalização, clique no botão Entrada de solução. Para interromper o processo, pressione o botão Stop Distribution.
No lado direito da seção de microscópio, existem vários painéis para registro de informações importantes de cada experimento de crescimento de cristal. Adicione o nome das proteínas correspondentes, o peso molecular e a condição de cristalização nesta seção. Defina um nome para seus experimentos simplesmente digitando-o no nome da pasta.
A partir da seção nb imagens, selecione o número de imagens que devem ser tiradas durante o experimento. Adicione o número das imagens e, a partir do painel à direita, escolha a escala do temporizador. Clique no botão pasta para abrir a pasta.
Nesta pasta, há um arquivo de texto contendo todas as informações que você definiu anteriormente para o seu experimento. Imagens prontas para qualquer tratamento adicional também são salvas nesta pasta. O zoom do microscópio também pode ser variado automaticamente.
Altera o zoom usando o botão mais e menos na parte superior da seção microscópio para aumentar ou diminuir a ampliação, respectivamente. Existem três maneiras diferentes de medir o tamanho do cristal. Para medir o comprimento ou largura, use o vetor de largura.
Dependendo da forma cristalina, as ferramentas específicas da parte esquerda da seção de microscópio podem ser escolhidas. Como um retangular ou polígono. Os valores aparecerão na seção de medida.
No primeiro conjunto de experimentos, os botões de microdiálise foram imersos nas soluções de cristalização com diferentes concentrações de sal. Neste simples experimento de rede de cristalização, a única variável é a concentração precipitante. enquanto a temperatura é mantida constante.
Pequenas variações na concentração de sal permitem investigar o diagrama da fase de cristalização aumentando a concentração de sal de 0,7 para 1,2 aumentos de supersaturação molar e a solução na zona de nucleação está se afastando da zona metastável. Consequentemente, observa-se uma variação de tamanho e número de cristais com o aumento do número de cristais e seu tamanho diminuindo. No primeiro experimento com OptiCrys sob a condição experimental dada, uma vez que o equilíbrio na câmara de diálise alcance, a solução de cristalização está na zona de nucleação nas proximidades da zona metastável do diagrama de fase de cristalização.
Como resultado, apenas alguns núcleos são gerados durante a primeira fase do experimento. A fim de manter o crescimento de cristais na zona metastável e controlar o processo de crescimento de cristal, a temperatura foi alterada em intervalos de tempo diferentes. Cada vez que o equilíbrio da solução cristalina era concluído, a temperatura era variada.
Portanto, a temperatura diminuiu para 291 Kelvin, 288 Kelvin e finalmente 275 Kelvin para manter o crescimento do cristal selecionado na zona de metastável. O resultado deste experimento é um único cristal grande, com o volume necessário para a cristalografia macromolecular natural. Os dois próximos experimentos demonstram a reversibilidade dos experimentos de diálise controladas pela temperatura para nucleação, crescimento cristalino, dissolução e recrescimento.
No segundo experimento com o OptiCrys a composição química da solução de cristalização foi mantida constante durante o experimento e a temperatura variou. A temperatura inicial foi fixada em 291 Kelvin. Por causa da alta supersaturação, um grande número de pequenos cristais apareceu na câmara de cristalização.
De acordo com o conceito de solubilidade direta da proteína, aumentando gradualmente a temperatura para 313 Kelvin todos os cristais foram dissolvidos. Finalmente, baixando a temperatura para 295 Kelvin, a segunda nucleação iniciou-se nas proximidades da zona metastável e permitiu controlar o processo de nucleação resultando na formação de menor número de núcleos. Um crescimento mais cristalino permitiu gerar a população uniforme de cristais maiores.
Neste experimento, alterar a composição química da solução de cristalização a temperatura constante leva a obter uma população uniforme de cristais maiores. A condição de cristalização foi semelhante ao experimento anterior. A dissolução dos cristais foi alcançada reduzindo gradualmente a concentração de NaCl de 0,9 molar para zero.
A redução da concentração de sal mantém a solução na zona subsaturada do diagrama de fase que leva à dissolução dos cristais. Em seguida, a nova solução de cristalização com menor resistência iônica do que anteriormente foi injetada na câmara do reservatório. Nesta concentração precipitante o menor número de cristais aparecem e os cristais atingem um volume maior do que antes.
Aqui fornecemos um protocolo detalhado descrevendo a preparação da amostra e ajustando o software de controle para o cultivo de cristais de grande e alta qualidade para a cristalografia macromolecular natural usando um instrumento totalmente automatizado desenvolvido em nosso laboratório. Este procedimento passo a passo foi projetado e beneficiado com o conhecimento do diagrama de fase de cristalização, a fim de separar a nucleação e o crescimento cristalino. Além disso, um protocolo para o cultivo de cristais com padrões de microcitose também é apresentado usando botões de macrocitose como alternativa quando o OptiCrys não está disponível.
Além das estratégias que mencionei para o OptiCrys alterando a composição química da solução de cristalização e temperatura e tirar imagens deve ser feita manualmente. Utilizando a vibração térmica regulada para a incubadora para manter a temperatura constante é necessário, o que é um passo crítico na metodologia demonstrada.
