Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (NO.81860413, 81960455), Fundo do Departamento de Ciência e Tecnologia de Yunnan (202001AY070001-080), Fundação de Pesquisa Científica do Departamento de Educação da Província de Yunnan (2019J1274).

A pesquisa foi aprovada pelo comitê de ética médica do Yunnan Cancer Hospital/Third Affiliated Hospital da Kunming Medical University. Todos os sujeitos/responsáveis assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido.
1. Preparação do slide
<ol><li>Cortes de blocos de parafina pareados contendo células de metástases cerebrais de tumor primário de pulmão ou câncer de pulmão com espessura de 4 μm usando micrótomo. Retire as seções para regar e separe com uma pinça, escolha a melhor e cole-a na lâmina revestida de polilisina.</li>
	<li>Coloque as lâminas dos tecidos em estufa a 65 °C durante 30 minutos para aumentar a adesão tecidual.</li>
	<li>Mergulhe as lâminas em xileno através de três mudanças, cada uma com duração de 10 min.</li>
	<li>Reduzir gradualmente a concentração de álcool e incubar as lâminas em etanol 100% por 5 min, etanol 90% por 5 min, etanol 75% por 5 min e em água deionizada por 3 min.</li>
</ol>2. Recuperação de epítopo induzida pelo calor (HIER)
<ol><li>Diluir 100x solução tampão citrato de sódio (pH 6,0) a 1x (10 mM) em água deionizada, preparando solução tampão suficiente para submergir completamente as lâminas.</li>
	<li>Coloque as corrediças em uma panela de pressão, submetendo-as a fogo alto (100 °C) e pressão (~30 psi) por 2 min. Após o aquecimento, deixe as lâminas arrefecerem até à temperatura ambiente em água destilada durante 3 min.</li>
	<li>Dissolver um pacote de 52 g de solução salina tamponada com fosfato (PBS; em pó) em 5 L de água deionizada para preparar solução tampão PBS (pH 7,0). Coloque as lâminas em solução tampão PBS por 5 min, com 3 trocas.</li>
</ol>3. Bloqueio da peroxidase
<ol><li>Cobrir as secções com peróxido de hidrogénio a 3% e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente. Enxágue as lâminas em PBS, 3x por 5 min cada.</li>
	<li>Use papel filtro para absorver o excesso de água longe do perímetro do tecido. Enquanto isso, certifique-se de que o tecido esteja úmido.</li>
</ol>4. Incubação primária de anticorpos para a primeira rodada
<ol><li>Preparar uma mistura funcional dos anticorpos primários para CD8 (anticorpo monoclonal de coelho, clone SP16) e CD20 (anticorpo monoclonal de camundongo, clone L26), diluídos 1:50 em diluente primário de anticorpos Bond.</li>
	<li>Adicione o complexo de anticorpos às secções e incube durante 1 h à temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparar uma solução de solução salina tamponada com tpolo 0,1% de Tween/fosfato: 1 ml de Tween em 1 L de solução tampão PBS.</li>
	<li>Lavar os cortes com solução salina tamponada com tpolo 0,1%, 3x por 5 min cada. Use papel filtro para retirar o excesso de água do perímetro do tecido, enquanto isso, certifique-se de que o tecido esteja úmido.</li>
</ol>5. Incubação de anticorpos secundários para a primeira rodada
<ol><li>Preparar uma mistura de anticorpo anti-coelho de cabra marcado com fluorescência (Excitação (Ex): 495 nm) e anticorpo anti-rato de cabra (Ex: 578 nm), diluído 1:50 em solução salina tampão fosfato. O anticorpo de cabra anti-coelho liga-se ao anticorpo primário de CD8, e o anticorpo de cabra anti-camundongo liga-se ao anticorpo primário de CD20.</li>
	<li>Adicione a mistura de anticorpos secundários gota a gota e incube à temperatura ambiente durante 1 h.</li>
</ol>6. Recuperação de epítopos induzida pelo calor e bloqueio da peroxidase
<ol><li>Diluir 100x citrato de sódio (pH 6,0) a 1x (10 mM) em água deionizada, preparando solução tampão suficiente para submergir completamente as lâminas.</li>
	<li>Coloque as corrediças em uma panela de pressão e submeta-as a fogo alto (100 °C) e pressão (~30 psi) por 1 min. Após o aquecimento, coloque as lâminas em água destilada para arrefecer até à temperatura ambiente durante 3 min.</li>
	<li>Execute o bloqueio da peroxidase conforme descrito na etapa 3.</li>
</ol>7. Incubação de anticorpos primários para segunda rodada
<ol><li>Preparar uma mistura funcional dos anticorpos primários para CD3 (anticorpo monoclonal de coelho, clone SP7) e CK (anticorpo monoclonal de camundongo, MX005), diluídos 1:50 em diluente primário de anticorpos.</li>
	<li>Adicione o complexo de anticorpos às secções e incube durante 1 h à temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavar com solução salina tamponada com tpolo 0,1%, 3x por 5 min cada. Use papel filtro para retirar o excesso de água do perímetro do tecido, enquanto isso, certifique-se de que o tecido esteja úmido.</li>
</ol>8. Incubação de anticorpos secundários para segunda rodada
<ol><li>Preparar a mistura de anticorpos anti-coelho (Ex: 652 nm) e anticorpo anti-rato de cabra (Ex: 590 nm), diluindo 1:50 em solução salina tampão fosfato. O anticorpo de cabra anti-coelho liga-se ao anticorpo primário de CD3, e o anticorpo de cabra anti-camundongo liga-se ao anticorpo primário de CK.</li>
	<li>Adicionar mistura de anticorpos secundários gota a gota, incubar à temperatura ambiente por 1 h. Lavar com solução salina tamponada com tpolo 0,1%, 3x por 5 min cada.</li>
</ol>9. Têmpera de autofluorescência e coloração DAPI
<ol><li>Adicionar reagente (0,15 M/L KMnO4) ao corte de tecido por 1 min. Enxágue com água corrente por 5 min. CUIDADO: KMnO4 é tóxico e danifica a pele. Certifique-se de usar luvas ao manusear os slides. Se o líquido pingar na pele, limpe-o rapidamente com guardanapos limpos e lave com água corrente.</li>
	<li>Secar a lâmina com concentrações crescentes de álcool (70%, 90%, 100%), por 3 min em cada concentração.</li>
	<li>Adicione DAPI e lamínula para imagens multiespectrais. A quantidade de DAPI depende do tamanho do tecido. Certifique-se de que o tecido está completamente coberto por DAPI após a adição da lamínula.</li>
</ol>10. Digitalização de slides
<ol><li>Coloque as corrediças em uma bandeja e empurre até que não possa ser empurrada mais.</li>
	<li>Para iniciar o programa, clique duas vezes no ícone do programa na área de trabalho. Durante a inicialização, a janela de seleção de modo é exibida. A janela de seleção exibe dois modos de campo brilhante e fluorescente: modo automático e modo manual. No modo de varredura fluorescente, clique em Modo Automático.</li>
	<li>Mover o cursor do mouse sobre ? para exibir as informações sobre as configurações. Clique em Configuração do Filtro > Canal de Filtro para escolher o Número do Canal > Pseudocor. Defina a cor e salve.</li>
	<li>Clique em Trabalho de rotina > modo de varredura > Automático completo. Clique em Trabalho de Rotina > Nome do Slide para definir o nome do slide para a saída. Clique em Configurações de Canal > de Trabalho de Rotina para escolher filtros.</li>
	<li>Clique em Opções de Rotina de Trabalho > Verificação para determinar a qualidade resultante e o local de armazenamento do slide virtual.</li>
	<li>Clique em Visualizar para configuração de limite e seleção do intervalo a ser verificado.</li>
	<li>Clique em Filtros de > de Hardware > Foco Automático de > ao Vivo > Exposição Automática > Ganho Digital > Tick use tempo de exposição manual > Tick limitando o intervalo > Definir Corrente.</li>
	<li>Clique em Trabalho de rotina > Iniciar varredura. Selecione o nível de ampliação como 20x ou 40x. Escolha 20x para tamanhos de arquivo apropriados. A extensão MRXS é definida pelo scanner MIDI pannorâmico 3D. A extensão de imagem também pode ser alterada para imagem TIFF.</li>
	<li>Clique em Visualizador de Slides > Caixa de Ferramentas Multiview para escolher a imagem para confocal e, em seguida, alinhe e integre a imagem.</li>
</ol>11. Avaliação quantitativa da densidade celular
<ol><li>Quantifique porcentagens de células imunes positivas (CD3+, CD3+CD8+, CD20+) em áreas tumorais e estromas com o software de scanner Halo 10. Validar a coloração de CK para definir o tecido tumoral.</li>
</ol>

Detecção imuno-histoquímica in situ de marcadores de células imunes em tecidos cancerígenos

<ol>
	<li>Wanleenuwat, P., Iwanowski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastases+to+the+central+nervous+system:+Molecular+basis+and+clinical+considerations.">Metastases to the central nervous system: Molecular basis and clinical considerations.</a> J Neurol Sci. 412, 116755 (2020).</li><li>Schoenmaekers, J., Dingemans, A. C., Hendriks, L. E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+imaging+in+early+stage+non-small+cell+lung+cancer:+still+a+controversial+topic.">Brain imaging in early stage non-small cell lung cancer: still a controversial topic.</a> J Thorac Dis. 10, S2168-S2171 (2018).</li><li>Vilari&#241;o, N., Bruna, J., Bosch-Barrera, J., Valiente, M., Nadal, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunotherapy+in+NSCLC+patients+with+brain+metastases.+Understanding+brain+tumor+microenvironment+and+dissecting+outcomes+from+immune+checkpoint+blockade+in+the+clinic.">Immunotherapy in NSCLC patients with brain metastases. Understanding brain tumor microenvironment and dissecting outcomes from immune checkpoint blockade in the clinic.</a> Cancer Treat Rev. 89, 102067 (2020).</li><li>Babar, Q., Saeed, A., Tabish, T. A., Sarwar, M., Thorat, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+tumor+microenvironment:+Potential+strategy+for+cancer+therapeutics.">Targeting the tumor microenvironment: Potential strategy for cancer therapeutics.</a> Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1869 (6), 166746 (2023).</li><li>Goldberg, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pembrolizumab+for+management+of+patients+with+NSCLC+and+brain+metastases:+long-term+results+and+biomarker+analysis+from+a+non-randomised,+open-label,+phase+2+trial.">Pembrolizumab for management of patients with NSCLC and brain metastases: long-term results and biomarker analysis from a non-randomised, open-label, phase 2 trial.</a> Lancet Oncol. 21 (5), 655-663 (2020).</li><li>Sukswai, N., Khoury, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+Innovations+for+Diagnosis+and+Tissue-Based+Biomarker+Detection.">Immunohistochemistry Innovations for Diagnosis and Tissue-Based Biomarker Detection.</a> Curr Hematol Malig Rep. 14 (5), 368-375 (2019).</li><li>Janardhan, K. S., Jensen, H., Clayton, N. P., Herbert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+in+Investigative+and+Toxicologic+Pathology.">Immunohistochemistry in Investigative and Toxicologic Pathology.</a> Toxicol Pathol. 46 (5), 488-510 (2018).</li><li>Torlakovic, E. E., Nielsen, S., Vyberg, M., Taylor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+controls+under+control:+the+time+is+now+for+immunohistochemistry.">Getting controls under control: the time is now for immunohistochemistry.</a> J Clin Pathol. 68 (11), 879-882 (2015).</li><li>Tan, W. C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+multiplex+immunohistochemistry/immunofluorescence+techniques+in+the+era+of+cancer+immunotherapy.">Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy.</a> Cancer Commun (Lond). 40 (4), 135-153 (2020).</li><li>Wong, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+quantitative+analysis+of+tumor-infiltrating+lymphocytes+and+immunotherapy+outcome+in+metastatic+melanoma.">Multiplex quantitative analysis of tumor-infiltrating lymphocytes and immunotherapy outcome in metastatic melanoma.</a> Clin Cancer Res. 25 (8), 2442-2449 (2019).</li><li>Sanchez, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+immunofluorescence+to+measure+dynamic+changes+in+tumor-infiltrating+lymphocytes+and+PD-L1+in+early-stage+breast+cancer.">Multiplex immunofluorescence to measure dynamic changes in tumor-infiltrating lymphocytes and PD-L1 in early-stage breast cancer.</a> Breast Cancer Res. 23 (1), 2 (2021).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+immunohistochemistry+indicates+biomarkers+in+colorectal+cancer.">Multiplex immunohistochemistry indicates biomarkers in colorectal cancer.</a> Neoplasma. 68 (6), 1272-1282 (2021).</li><li>Salameh, S., Nouel, D., Flores, C., Hoops, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+immunohistochemistry+protocol+for+detecting+the+guidance+cue+Netrin-1+in+neural+tissue.">An optimized immunohistochemistry protocol for detecting the guidance cue Netrin-1 in neural tissue.</a> MethodsX. 5, 1-7 (2018).</li><li>McClellan, P., Jacquet, R., Yu, Q., Landis, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+for+the+immunohistochemical+identification+and+localization+of+Osterix+in+periosteum-wrapped+constructs+for+tissue+engineering+of+bone.">A Method for the immunohistochemical identification and localization of Osterix in periosteum-wrapped constructs for tissue engineering of bone.</a> J Histochem Cytochem. 65 (7), 407-420 (2017).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sudan+black+B+reduces+autofluorescence+in+murine+renal+tissue.">Sudan black B reduces autofluorescence in murine renal tissue.</a> Arch Pathol Lab Med. 135 (10), 1335-1342 (2011).</li><li>Taube, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Society+for+Immunotherapy+of+Cancer+statement+on+best+practices+for+multiplex+immunohistochemistry+(IHC)+and+immunofluorescence+(IF)+staining+and+validation.">The Society for Immunotherapy of Cancer statement on best practices for multiplex immunohistochemistry (IHC) and immunofluorescence (IF) staining and validation.</a> J Immunother Cancer. 8 (1), 000155 (2020).</li><li>Clarke, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+automated+technology+for+multiplex+biomarker+imaging+and+application+to+breast+cancer.">A novel, automated technology for multiplex biomarker imaging and application to breast cancer.</a> Histopathology. 64 (2), 242-255 (2014).</li><li>Oliveira, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sudan+Black+B+treatment+reduces+autofluorescence+and+improves+resolution+of+in+situ+hybridization+specific+fluorescent+signals+of+brain+sections.">Sudan Black B treatment reduces autofluorescence and improves resolution of in situ hybridization specific fluorescent signals of brain sections.</a> Histol Histopathol. 25 (8), 1017-1024 (2010).</li><li>Ahrens, M. J., Dudley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+pretreatment+of+growth+plate+cartilage+increases+immunofluorescence+sensitivity.">Chemical pretreatment of growth plate cartilage increases immunofluorescence sensitivity.</a> J Histochem Cytochem. 59 (4), 408-418 (2011).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+characteristics+of+autofluorescence+in+renal+tissue+and+methods+for+reducing+fluorescence+background+in+confocal+laser+scanning+microscopy.">Spectral characteristics of autofluorescence in renal tissue and methods for reducing fluorescence background in confocal laser scanning microscopy.</a> J Fluoresc. 28 (2), 561-572 (2018).</li></ol>

Os autores declaram não ter interesses financeiros ou relações pessoais concorrentes conhecidos que possam ter influenciado o trabalho relatado neste artigo.

Descrevemos o processo para coloração imunoistoquímica por fluorescência cíclica multiplex. A seleção primária de anticorpos é um aspecto crucial do ensaio imunohistoquímico de fluorescência, e anticorpos monoclonais são recomendados para melhor especificidade e repetibilidade. Para otimizar a concentração de trabalho do anticorpo primário, uma série de diluições tem sido testada através de experimentos de imunohistoquímica. Tanto os controles positivos (para avaliar a expressão do antígeno alvo) qu...

As metástases cerebrais (MB) representam os tumores mais comuns do sistema nervoso central (SNC), ocorrendo em quase metade dos casos de câncer de pulmão não pequenas células (CPNPC), com mau prognóstico1. Estima-se que 10%-20% dos pacientes com CPNPC já apresentam MB no momento do diagnóstico inicial, e aproximadamente 40% dos casos de CPNPC desenvolverão MB durante o curso do tratamento2. O microambiente tumoral (TME) está intimamente associado à ocorrência de CPNPC e MB, incluindo vários componentes, como vasos sanguíneos, fibroblastos, macrófagos, matriz extracelular (MEC), células imunes linfoides, derivadas da medula óssea e moléculas sinalizadoras 3,4. As células imunes microambientais desempenham um papel crucial na influência do crescimento e desenvolvimento de células cancerosas. Metástases cerebrais apresentam inúmeros alvos potenciais de tratamento caracterizados por microambientes imunológicos complexos e processos de sinalização. Por exemplo, os inibidores de PD-1 demonstraram eficácia clínica para pacientes com metástase cerebral de câncer de pulmão (MBCL) como um inibidor de ponto de verificação imunológica (ICI). No entanto, a frequência de respostas à terapia com PD-1 varia entre CPNPC primário e MCCBL5, sugerindo que o microambiente imune tumoral atua como um regulador crítico da ICI.
A imuno-histoquímica (IHQ) é uma ferramenta valiosa nos campos da biologia, medicina de fundação e patologia6. Esse método de detecção visualiza a expressão antigênica através da interação antígeno-anticorpo em uma lâminatecidual7. A imunoistoquímica é utilizada para diagnosticar marcadores preditivos, avaliar marcadores prognósticos, orientar terapias-alvo e explorar as funções biológicas das célulastumorais8. No entanto, o método tradicional de IHQ só pode detectar um biomarcador de cada vez. Para suprir essa limitação, a inovação da tecnologia imunoistoquímica levou ao desenvolvimento da imunohistoquímica por fluorescência multiplex (mfIHC), que permite a identificação simultânea de múltiplos marcadores proteicos na mesma lâmina tecidual, tanto em campo claro quanto em campofluorescente9. Esse avanço fornece uma análise precisa da composição celular e das interações moleculares entre células estromais, células imunes e células cancerosas dentro da TME.
Neste estudo, apresentamos um protocolo de imunohistoquímica cíclica multiplex para analisar a distribuição espacial das células imunes. Dois anticorpos primários de espécies diferentes, como coelho e rato, são escolhidos para incubação simultaneamente, seguidos por anticorpos secundários marcados com fluorescência. A recuperação do antígeno é realizada após cada rodada de reação antígeno-anticorpo. A autofluorescência é bloqueada e 4', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) é usado para colorir os núcleos. O painel inclui detecção sequencial de CD3, CD8, CD20 e CK, as células são categorizadas de acordo com os marcadores: células tumorais (CK+), células T maduras (CD3+), células T citotóxicas (CD3+CD8+), células B (CD20+)10,11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.15 mol/L KmnO4</td>
			<td>Maixin Biotechnology Co. Ltd.</td>
			<td>MST-8005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x sodium citrate&#160;</td>
			<td>Maixin Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>MVS-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% hydrogen peroxide</td>
			<td>Maixin Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>SP KIT-A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Pannoramic MIDI</td>
			<td>3D histech Ltd</td>
			<td>Pannoramic MIDI 1.18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab175701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bond primary antibody diluent</td>
			<td>Lecia</td>
			<td>AR9352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD20</td>
			<td>Maixin Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>kit-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>Maixin Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>&#160;kit-0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8&#160;</td>
			<td>Maixin Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>RMA-0514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CK</td>
			<td>Maixin Biotechnology Co. Ltd.</td>
			<td>MAB-0671,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>sig-ma</td>
			<td>D8417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD</td>
			<td>10009218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histocore Multicut</td>
			<td>lecia</td>
			<td>2245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS(powder)</td>
			<td>Maixin Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>PBS-0061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>slide viwer&#160;</td>
			<td>3D histech Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xylene</td>
			<td>Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD</td>
			<td>10023418</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplex cyclic fluorescent immunohistochemistry

O microambiente tumoral envolve interações entre células hospedeiras, células tumorais, células imunes, células estromais e vasculatura. Caracterizar e organizar espacialmente subgrupos de células imunes e proteínas-alvo são cruciais para fins prognósticos e terapêuticos. Isso levou ao desenvolvimento de métodos de coloração imunoistoquímica multiplexada. A imunohistoquímica por fluorescência multiplex permite a detecção simultânea de múltiplos marcadores, facilitando uma compreensão abrangente da função celular e das interações intercelulares. Neste trabalho, descrevemos um fluxo de trabalho para o ensaio de imunohistoquímica fluorescente cíclica multiplex e sua aplicação na análise de quantificação de subgrupos de linfócitos. A coloração por imunoistoquímica fluorescente cíclica multiplex segue etapas e reagentes semelhantes aos da imunohistoquímica padrão, envolvendo recuperação de antígenos, incubação cíclica de anticorpos e coloração em lâmina de tecido fixada em formalina e emblocada em parafina (FFPE). Durante a reação antígeno-anticorpo, uma mistura de anticorpos de diferentes espécies é preparada. Condições, como tempo de recuperação de antígenos e concentração de anticorpos, são otimizadas e validadas para aumentar a relação sinal-ruído. Esta técnica é reprodutível e serve como uma ferramenta valiosa para pesquisas em imunoterapia e aplicações clínicas.

Brain metastases (BM) represent the most common central nervous system (CNS) tumors, occurring in nearly half of non-small cell lung cancer cases (NSCLC), with a poor prognosis1. An estimated 10%-20% of NSCLC patients already have BM at the time of initial diagnosis, and approximately 40% of NSCLC cases will develop BM during the course of treatment2. The tumor microenvironment (TME) is closely associated with NSCLC occurrence and BM, including various components, such as blood vessels, fibroblasts, macrophages, extracellular matrix (ECM), lymphoid, bone marrow-derived immune cells, and signaling molecules3,4. Microenvironmental immune cells play a crucial role in influencing cancer cell growth and development. Brain metastases present numerous potential treatment targets characterized by complex immunological microenvironments and signaling processes. For instance, PD-1 inhibitors have shown clinical efficacy for patients with lung cancer brain metastasis (LCBM) as an immune-checkpoint inhibitor (ICI). However, the frequency of responses to PD-1 therapy varies between primary NSCLC and LCBM5, suggesting that the tumor immune microenvironment acts as a critical ICI regulator.
Immunohistochemistry (IHC) is an invaluable tool in the fields of biology, foundation medicine, and pathology6. This detection method visualizes antigen expression through the interaction of antigen-antibody on a tissue slide7. IHC is used for diagnosing predictive markers, evaluating prognostic markers, guiding targeted therapies, and exploring the biological functions of tumor cells8. However, the traditional IHC method can only detect one biomarker at a time. To address this limitation, the innovation of immunohistochemical technology has led to the development of multiplex fluorescence immunohistochemistry (mfIHC), which allows for the simultaneous identification of multiple protein markers on the same tissue slide, both in bright field and fluorescent field9. This advancement provides accurate analysis of cell composition and molecular interactions among stromal cells, immune cells, and cancer cells within the TME.
In this study, we present a protocol for multiplex cyclic immunohistochemistry to analyze the spatial distribution of immune cells. Two primary antibodies of different species, such as rabbit and rat, are chosen for incubation simultaneously, followed by fluorescence-labeled secondary antibodies. Antigen retrieval is performed after each round of antigen-antibody reaction. Autofluorescence is blocked, and 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) is used for staining the nuclei. The panel includes sequential detection of CD3, CD8, CD20, and CK, cells are categorized according to the markers: tumor cells (CK+), mature T cells (CD3+), cytotoxic T cells (CD3+CD8+), B cells (CD20+)10,11.

Autor em destaque: Detecção eficiente de infiltração de células imunes em tecidos cancerígenos usando imuno-histoquímica fluorescente

Imunohistoquímica Fluorescente Cíclica Multiplex

The challenge for immunohistochemistry is to choose the species of primary and secondary monoclonal antibodies to avoid cross-reactivity and obtain better specificity and repeatability. Gender decision is necessary to optimize the antibody dilution ratio. Meanwhile, another challenge is to align the localization of and the sub structures.The use of this protocol meet the technical evolution of the distribution of three lymphocytic subpopulations, such as CT three, positive CT three, and CT eight positive and CT 20 positive based on in cell counts and the protein expression in conserv tissues, the level of infiltration can be observed too. In our protocol, the parameter Antibodies and the Fluor secondary antibodies derive from different species at the iso mixture making us a efficient. This measure also shows a specific measure between antibody and antigen.

Apresentamos um protocolo para detecção cíclica de antígenos usando fluorescência multiplex de 5 cores em uma única lâmina. Através da otimização do ensaio, possibilitamos a incubação de dois anticorpos de espécies diferentes (Figura 1). Os dispositivos necessários para o procedimento experimental incluem panela de pressão e caixa de imunomarcação (Figura 2A).
Após o término do ensaio, definimos a pseudocor dos quat...

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A imunohistoquímica cíclica multiplex permite a detecção in situ de múltiplos marcadores simultaneamente usando incubação antígeno-anticorpo repetida, varredura de imagens e alinhamento e integração de imagens. Aqui, apresentamos o protocolo operacional para identificação de substratos de células imunes com essa tecnologia em amostras de câncer de pulmão e metástases cerebrais pareadas.

The tumor microenvironment involves interactions between host cells, tumor cells, immune cells, stromal cells, and vasculature. Characterizing and ...

O desafio para a imuno-histoquímica é escolher as espécies de anticorpos monoclonais primários e secundários para evitar reatividade cruzada e obter melhor especificidade e repetibilidade. A decisão de gênero é necessária para otimizar a razão de diluição de anticorpos. Enquanto isso, outro desafio é alinhar a localização e as subestruturas.A utilização deste protocolo atende à evolução técnica da distribuição de três subpopulações linfocíticas, como TC três, TC três positiva, TC oito positiva e TC 20 positiva com base na contagem celular e na expressão proteica em tecidos conservadores, o nível de infiltração também pode ser observado. Em nosso protocolo, o parâmetro Anticorpos e os anticorpos secundários de flúor derivam de espécies diferentes na mistura iso, tornando-nos eficientes. Essa medida também mostra uma medida específica entre anticorpo e antígeno.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Multiplex Cyclic Fluorescent Immunohistochemistry

466 visualizações.  The Third Affiliated Hospital of Kunming Medical University & Yunnan Cancer Hospital. O desafio para a imuno-histoquímica é escolher as espécies de anticorpos monoclonais primários e secundários para evitar reatividade cruzada e obter melhor especificidade e repetibilidade. A decisão de gênero é necessária para otimizar a razão de diluição de anticorpos. Enquanto isso, outro desafio é alinhar a localização e as subestruturas.A utilização deste protocolo atende à evolução técnica da distribuição de três subpopulações linfocíticas, como TC três...

Vídeo: Autor em destaque: Detecção eficiente de infiltração de células imunes em tecidos cancerígenos usando imuno-histoquímica fluorescente

The tumor microenvironment involves interactions between host cells, tumor cells, immune cells, stromal cells, and vasculature. Characterizing and spatially organizing immune cell subsets and target proteins are crucial for prognostic and therapeutic purposes. This has led to the development of multiplexed immunohistochemistry staining methods. Multiplex fluorescence immunohistochemistry allows the simultaneous detection of multiple markers, facilitating a comprehensive understanding of cell function and intercellular interactions. In this paper, we describe a workflow for the multiplex cyclic fluorescent immunohistochemistry assay and its application in the quantification analysis of lymphocyte subsets. The multiplex cyclic fluorescent immunohistochemistry staining follows similar steps and reagents as standard immunohistochemistry, involving antigen retrieval, cyclic antibody incubation, and staining on a formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue slide. During the antigen-antibody reaction, a mixture of antibodies from different species is prepared. Conditions, such as antigen retrieval time and antibody concentration, are optimized and validated to increase the signal-to-noise ratio. This technique is reproducible and serves as a valuable tool for immunotherapy research and clinical applications.

Multiplex cyclic immunohistochemistry allows in situ detection of multiple markers simultaneously using repeated antigen-antibody incubation, image scanning, and image alignment and integration. Here, we present the operating protocol for identifying immune cell substrates with this technology in lung cancer and paired brain metastasis samples.