Agradecemos a Susan Gerbi, Heidi Smith e David Lambert para o fornecimento de material para teste in vivo de centrifugação em Sciara coprophila e obsoleta Ilyanassa, respectivamente. Agradecemos a membros do laboratório Welte para comentários sobre a técnica e manuscrito. Desenvolvimento e aperfeiçoamento do ensaio de centrifugação in-vivo foi apoiada por NIGMS conceder GM64687 para o PMA. As imagens apresentadas na figura. 1 e fig. 5E, F 2 foram publicados anteriormente, que reproduzimos aqui com permissão.

<ol>
	<li>Wieschaus, E., N&#252;sslein-Volhard, C., Roberts, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Looking+at+embryos.">Looking at embryos.</a> Drosophila: A Practical Approach. , 179-214 (1998).</li><li>Cermelli, S., Guo, Y., Gross, S. P., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lipid+droplet+proteome+reveals+that+droplets+are+a+protein+storage+depot.">The lipid droplet proteome reveals that droplets are a protein storage depot.</a> Curr Biol. 16, 1783-1795 (2006).</li><li>Kiehart, D. P., Crawford, J. M., Montague, R. A., Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. 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Não há conflitos de interesse declarados.

Etapas críticas Certifique-se que a concentração de agar é alta o suficiente. Se for muito baixo, o agar irá se desintegrar durante a centrifugação, e os embriões vai estourar ou ser orientados aleatoriamente. Se a concentração de agar é apenas um pouco baixo demais ou se o agar estiver molhado (remoção insuficientemente secas ou insuficiente de TSS excesso no passo 4.3), os embriões irá flutuar para fora de seus buracos durante a centrifugação e tornar-se indevidamente orientados. Se o agar é derramado muito finas, que também irá colapso ou crack durante a centrifugação. Certifique-se de que os embriões não tenham avançado além estágios celularização. Caso contrário, a separação de organelas não vai funcionar (Fig. 5C) desde organelas será seqüestrado dentro de milhares de células individuais. Em embriões jovens em fase de uma célula, organelas são livres para migrar grandes distâncias e acumular de acordo com sua densidade característica. Para evitar analisar embriões que são muito antigas, certifique-se de (i) incluem uma coleção pré-para permitir que as fêmeas põem ovos de idade (passo 2.4), (ii) coletar embriões por 3 horas ou menos (passo 2.5), (iii) visualmente selecionar embriões antes de estágios celularização para a incorporação em agar (passo 4.2), (iv) manter a incorporação de pouco tempo para impedir o desenvolvimento até o final de celularização (passo 4.6) e (v) descarte embriões que não camada corretamente (passo 5.6) . Não economize no tempo de centrifugação. Embora alguns dos embriões vai mostrar camadas agradável, mesmo depois de apenas 10 minutos de centrifugação, a separação é inconsistente do embrião ao embrião. 30 giros min dar resultados altamente consistentes. Além disso, quanto maior o tempo de centrifugação, mais as camadas são estáveis ​​após a centrifugação foi encerrada. Isso é importante para as aplicações em que é preciso tempo para processar os embriões ainda antes do uso (por exemplo, se eles precisam ser tratados para experimentos de transplante ou montado para a análise confocal). Possíveis modificações Ovo de coleta e remoção córion Muitos protocolos diferentes existem para as etapas 2 e 3 1, 3, 9, e vai trabalhar, bem como as descritas aqui, desde que os embriões utilizados são jovens, produção de ovos é alta, ea fração de mis- embriões encenado é minimizado. Ântero-posterior alinhamento O protocolo orienta todos os embriões de modo que a extremidade posterior é enterrado no ágar e no final é até anterior (Fig. 3). Esta orientação é bom para a consistência, de modo que é possível usar a micrópila como um marco que apontou acabar durante a centrifugação (Fig. 1, 5). No entanto, com a prática, é fácil escolher a orientação de embriões centrifugado pela aparência distinta da gota lipídica e camadas gema brilhante por microscopia de campo. Então torna-se possível montar embriões com ou acabam; esta flexibilidade acelera o processo de montagem. Centrifugação unoriented O aspecto mais demorado e tecnicamente desafiador do protocolo é a montagem da embriões em agar (passo 4). Ela exige tocar cada embrião duas vezes (uma para inseri-la no furo e uma vez para recuperá-la após a centrifugação). Como alternativa, pode-se transferir embriões no passo 4,1 em tubos de microcentrífuga cheio de TSS. Quando estes tubos são centrifugados em microcentrífuga (13.000 rpm, 10-30 min), embriões também tipicamente camada bem 10-13. Esta variação permite processar centenas de embriões, ao mesmo tempo muito rapidamente. No entanto, em camadas não é tão consistente; uma fração dos embriões não se desenvolve camadas distintas, apesar força centrífuga muito maior (~ 16.000 g) do que aplicado no protocolo acima. Mais desafiador é o fato de que a orientação dos embriões é variável, e pode-se observar a separação em vários ângulos com o eixo do embrião principais. Esta variabilidade exige o pesquisador classificar para fora após a centrifugação como um embrião especial foi organizado no tubo de ensaio. Com o uso da autofluorescência gema como um marcador para a parte mais densa do embrião, este muitas vezes é possível, embora requer muita prática e mais juízo para fazê-lo de forma confiável. Se houver embriões suficientes na amostra, pode-se ser capaz de resolver os casos em que os embriões passou a ser dispostos como na figura. 1. Centrifugação de embriões em sua casca de ovo É possível incorporar embriões em agar para o passo 4 sem remover o córion 2 primeiros. Nesta abordagem, os embriões a coleta do dízimo são cobertos com óleo de halocarbonos em vez de lixívia 50% no passo 3.2 (halocarbono transforma o córion translúcido). Embriões de estágios apropriados são selecionados e transferidos para uma placa de agar nova usando uma pinça, pegando apenas os filamentos de ovo com a pinça, danoso próprio embrião é evitado. Embriões são incorporados como no passo 4,4 por 4,8, com os filamentos de ovo anterior degola para fora do buraco no agar. A casca do ovo é removido por tratamento lixívia 50% após os embriões foram centrifugadas e cavada na agar como no passo 5.4. Centrifugação, na presença da casca do ovo pode melhorar a taxa de devitellinization após a fixação (passo 6.2), mas a seleção das etapas corretas para a centrifugação (passo 4.2) é mais desafiador. Aplicações Centrifugação embrião é particularmente útil para experiências co-localização, ou seja, para testar se uma determinada proteína localiza-se uma organela alguns grandes. Por exemplo, a proteína está presente em Klar início gotículas lipídicas embrionárias, mas a localização desta é um desafio para demonstrar em embriões intactos. Em parte, isso ocorre porque tanto Klar puncta e gotículas lipídicas são abundantes na periferia de embriões 10, fazendo co-localização espúria difícil de descartar. No entanto, concentra-se centrifugação gotículas lipídicas em uma camada distinta e, portanto, co-localização com sinal Klar torna-se evidente 10. Análise similar foi demonstrado de forma inequívoca a localização de outras proteínas de gotículas lipídicas 8, 13-15, incluindo exemplos surpreendentes como histonas determinados 2 e nos casos em que uma proteína está presente onipresente, mas enriquecido em gotículas lipídicas 8. Como os embriões podem ser selecionados visualmente por estágio de desenvolvimento (passo 4.2), é possível até mesmo detectar o aliciamento developmentally regulada de proteínas de gotículas lipídicas 8, 15. Teste para co-localização com gotículas lipídicas é particularmente fácil, já que acumulam gotículas lipídicas em um visualmente distinto &quot;cap&quot;, de modo nenhum marcador mais ou mancha é necessário para identificar essa camada. Na verdade, devido à sua facilidade surpreendente e potencialmente resultados visuais (Fig. 1, Fig. 5. D, E), nosso laboratório emprega esta técnica rotineiramente como um teste primeiro se uma proteína candidato é localizada gotículas lipídicas. Em princípio, os estudos de co-localização semelhante deve trabalhar para as organelas outras mostrado na figura. 1, e provavelmente para outros (incluindo parasitas intracelulares), cuja distribuição em embriões centrifugado ainda tem que ser documentada. Desde centrifugação concentra organelas em faixas apertadas, facilita o isolamento de uma fração enriquecida nessas organelas. Esta abordagem já foi utilizada para recuperar gotículas lipídicas para transplante em embriões de doadores 2. Também pode ser possível bioquimicamente analisar a fração enriquecida (por exemplo, cortando as camadas off embriões após a fixação 15). O método descrito aqui tem aplicações além de embriões Drosophila, como a centrifugação pode ser usado para estratificar os ovos de diferentes espécies (incluindo sapos, nematóides, tunicados, anelídeos, ouriços, moluscos e cnidários) 16. Em nosso próprio laboratório, temos utilizado o protocolo acima de embriões da mosca doméstica Musca domestica 2 e empregaram centrifugação unoriented na análise dos embriões do mosquito fungo Sciara coprophila 17 e do caracol Ilyanassa obsoleta 17. Finalmente, este método não é restrito aos embriões: Centrifugação também pode ser útil para estratificar outras células grandes, como oócitos (por exemplo, em Drosophila 2, 18 e milkweed bug Oncopeltus fasciatus 17). Para amostras diferentes, as condições de centrifugação exata precisa ser otimizada: Por exemplo, 10 minutos a 3000 g é suficiente para estratificar de forma eficiente embriões de Musca domestica 2, e se centrifugada por muito mais tempo, os embriões tendem a quebrar durante a fixação e imunomarcação.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>60x15 mm Petri dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>#35-1007</td>
<td>From Falcon</td>
</tr>
<tr>
<td>Wire mesh</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Small Parts</td>
<td>CX-0150</td>
<td>stainless steel type 304; mesh size #150 x150, wire diameter: 0.0026 inches</td>
</tr>
<tr>
<td>Tungsten needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>10130-10</td>
<td>0.25 mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Moria Nickel Plated Pin/Needle Holder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>26016-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fly Cages</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Genesee Scientific</td>
<td>59-100 or 59-101</td>
<td>For 65 mm or 100 mm diameter Petri dishes, respectively</td>
</tr>
<tr>
<td>Halocarbon Oil 27</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H8773</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

in-vivo centrifugation of drosophila embryos

Uma importante estratégia para purificar e isolar diferentes tipos de organelas intracelulares é separá-las umas das outras com base em diferenças na densidade flutuante. No entanto, quando as células são rompidas antes da centrifugação, proteínas e organelas neste ambiente não-nativos, muitas vezes de forma inadequada ficar uns aos outros. Aqui nós descrevemos um método para separar organelas pela densidade no intacta, embriões vivos Drosophila. Embriões antes celularização são colhidos a partir de gaiolas população, e suas cascas de ovos exterior são removidos por tratamento com água sanitária a 50%. Embriões são depois transferidos para uma placa de agar pequenas e inserido final, posterior em primeiro lugar, em pequenos furos verticais no agar. As placas contendo embriões incorporados são centrifugados por 30 min a 3000g. O agar suporta os embriões e os mantém em uma orientação definida. Depois, os embriões são escavadas na agar com uma agulha sem corte. Centrifugação separa principais organelas em camadas distintas, uma estratificação facilmente visíveis por microscopia de campo brilhante. Uma série de marcadores fluorescentes estão disponíveis para confirmar a estratificação de sucesso em embriões vivos. Proteínas associadas com certas organelas será enriquecido em uma camada específica, demonstrando co-localização. Camadas individuais podem ser recuperados para análise bioquímica ou transplante em ovos de doadores. Esta técnica é aplicável para organela separação em outras grandes células, incluindo os ovos e oócitos de diversas espécies.

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In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

Nós descrevemos um método para separar organelas pela densidade na vida<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriões. Embriões são incorporados em agar e centrifugado. Esta técnica produz a separação reprodutível de organelas importantes ao longo do eixo ântero-posterior do embrião. Este método facilita experiências co-localização e frações rendimentos organela para análise bioquímica e experimentos de transplante.

In vivo Centrifugação de Embriões Drosophila

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

in-vivo-centrifugation-of-drosophila-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

18.3K visualizações.  University of Rochester. Nós descrevemos um método para separar organelas pela densidade na vida Drosophila Embriões. Embriões são incorporados em agar e centrifugado. Esta técnica produz a separação reprodutível de organelas importantes ao longo do eixo ântero-posterior do embrião. Este método facilita experiências co-localização e frações rendimentos organela para análise bioquímica e experimentos de transplante.