O modelo de retina de primata estabelecido neste estudo oferece a investigação do mecanismo abrangente e o desenvolvimento terapêutico da deterioração retiniana dependente de GMPc-PKG. Este modelo individual de primatas não humanos reserva a confirmação do tecido retiniano e interações intercelulares, o que permite uma melhor simulação das condições in vivo. Também reduz o uso de animais e encurta a duração experimental.
Fornecer uma abordagem experimental de controle para investigar o desenvolvimento ou degeneração da retina. Comece a preparação dos explantes da retina lavando os globos oculares isolados de macacos selvagens com 10 mililitros de iodo a 5% de povidona por 30 segundos. Para evitar a contaminação bacteriana, mergulhe os globos oculares em uma solução PBS de estreptomicina de penicilina a 5% por um minuto antes da incubação em 10 mililitros de meio R16 por cinco minutos.
Em seguida, mergulhe os globos oculares em 10 mililitros de solução de proteína Ace-K pré-aquecida a 37 graus Celsius e incubada por dois minutos. Realizar a próxima incubação em 10 mililitros de um a um R16 mais soro fetal bovino por cinco minutos. Dê uma lavagem final em 10 mililitros de R16 fresco.
Uma vez feito, separe a esclera, córnea, íris, cristalino e vítreo do corpo. Em seguida, corte a retina de quatro lados com pinça e tesoura. Em seguida, use uma lâmina fina de árvore de quatro mililitros para cortar o explante da retina a 1,5 milímetro do lado nasal, quatro milímetros do lado temporal e dois milímetros dos lados superior e inferior da cabeça do nervo óptico.
Em seguida, usando uma lâmina fina de árvore de seis milímetros, corte o lado central do explante da retina contendo o disco óptico e a mácula. Usando uma pipeta larga, puxe o explante de retina contendo a retina e a coroide e coloque-o no meio da inserção com o lado do fotorreceptor para cima. Submergir totalmente a retina em um mililitro do meio completo na placa abaixo da membrana.
Cultivar os explantes da retina e colocá-los em uma incubadora de 37 graus Celsius com dióxido de carbono umidificado a 5%. Dê o tratamento de concentração de droga apropriado para explantes por quatro dias. Usar pelo menos três explantes por condição de tratamento e usar os explantes sem a droga como controle positivo.
Para fixação e criossecção, tratar os explantes da retina com um mililitro de aldeído paraforme por 45 minutos. Após uma breve lavagem com um mililitro de PBS, incubar os explantes em 10% de sacarose por 10 minutos, 20% de sacarose por 20 minutos e 30% de sacarose por 30 minutos. Cortar os explantes da retina uniformemente com quatro quadrantes na periferia e seis milímetros no centro.
Em seguida, transfira os explantes da retina para uma caixa de estanho de cerca de 1,5 por 1,5 por 1,5 centímetros com um meio de incorporação composto de temperatura de corte ideal cobrindo o explante. Imediatamente, congele as seções de tecido em nitrogênio líquido e coloque-as em uma geladeira de 20 graus para armazenamento. Em seguida, corte o ágar em um pequeno bloco contendo a amostra de tecido.
Sepasse os blocos em blocos de 10 micrômetros e coloque os cortes em lâminas de microscópio de adesão usando uma escova macia. Em seguida, seque as seções por 45 minutos a 40 graus Celsius e guarde-as a 80 graus Celsius negativos até usar. Para coloração de monofosfato de guanosina cíclica ou GMPc, desenhe um anel hidrofóbico ao redor das seções secas da retina com uma caneta bloqueadora de líquidos e cubra as amostras.
Imergir as lâminas em 200 microlitros de PBS 0,3% e Triton-X100 ou PBST por 10 minutos, seguido de um tratamento de uma hora em 200 microlitros de solução de bloqueio à temperatura ambiente. Em seguida, incube a lâmina de amostra durante a noite com os 200 microlitros de anticorpo primário preparados na solução de bloqueio a quatro graus Celsius e lave-a três vezes com PBS por 10 minutos. Incubar a lâmina em 200 microlitros de anticorpo secundário por uma hora à temperatura ambiente.
Após três lavagens de PBS por 10 minutos, cubra as amostras com um meio de montagem antifade contendo DAPI e armazene a quatro graus Celsius por pelo menos 30 minutos antes da obtenção de imagens. Seque a lâmina à temperatura ambiente por 15 minutos e desenhe um anel de barreira repelente de água ao redor do espécime de tecido da retina com uma caneta bloqueadora de líquidos. Após incubação com 40 mililitros de PBS por 15 minutos, tratar os cortes com 42 mililitros de tris-tampão 0,05 molar ou TBS a 37 graus Celsius.
Aspirar a TBS, incubar as amostras com seis microlitros de proteinase K por cinco minutos e lavar as lâminas três vezes com PBS por cinco minutos cada. Expor as lâminas a 40 mililitros de solução de etanol ácido acético no chaplin. Cubra com uma folha transparente e incube a menos 20 graus Celsius por cinco minutos.
Lave as lâminas três vezes com TBS por cinco minutos cada vez. Expor as lâminas a 200 a 300 microlitros de solução de bloqueio ou BSA a 1% e incubá-las em uma câmara de umidade por uma hora. A aproximadamente 130 microlitros de solução vermelha TMR por lâmina e após uma hora, dê duas lavagens de 200 microlitros de PBS por cinco minutos cada.
Coloque lâminas contendo uma a duas gotas de meio de montagem antifade com DAPI sobre as amostras e incube as lâminas a quatro graus Celsius por pelo menos 30 minutos antes da obtenção de imagens. Após a coloração sequencial com túnel e GMPc, proceda à microscopia de luz e fluorescência, ajustando os parâmetros da câmera. Capture as imagens de quatro campos de cada seção usando o software com uma câmera digital em aumento de 20x.
Obtenha imagens representativas das áreas centrais da retina usando DAPI, EGFP e TMR com varredura z-stack e um intervalo de um micrômetro e opcional em 1.251 micrômetros. Nos explantes retinianos tratados com diferentes concentrações dos inibidores da PDE6 Zaprinast, o número de células positivas para túnel e GMPc aumentou fortemente na camada nuclear externa em comparação com o grupo controle. A alta proporção de células positivas para túnel sugeriu que o aumento na atividade do GMPc pode aumentar a degeneração celular da retina pré-ninho e o acúmulo de GMPc desempenha um papel na degeneração dos fotorreceptores.
A preparação dos explantes deve ser efectuada o mais rapidamente possível. Op animal espalhar cinco e qualquer acumulação, porque melhora a sobrevivência celular e melhorar o status da fibra da série de pilha a granel. Até certo ponto, visível, o vítreo deve ser limpo com esteroides.
Evite entrar em contato com as camadas de fibras nervosas da retina ao transferir explantes da retina para evitar lesão celular mecânica. Por favor, tome nota, para emitir uma transferência suave de explantes da retina para inserções de cultura, o animal de estimação pode ser pré-embebido em algo para mantê-lo úmido antes de transferir os tecidos da retina. Além disso, todo o processo deve ser realizado na atmosfera de esteroides para evitar a contaminação durante o processo.
