Gli autori ringraziano Emilie Josse per la revisione critica del manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dalla fondazione "La Ligue contre le Cancer", dalla "Fondation ARC pour la Recherche sur le Cancer" e dal "Centre National de la Recherche Scientifique" (CNRS).

1. Preparazione di grandi vescicole unilamellari (LUV)
<ol><li>Preparare i ROV per il loro uso come membrana cellulare mimica per il test di perdita di fluorescenza.</li>
	<li>Mescolare con una siringa di vetro Hamilton fosfatidilcolina (DOPC, 786,11 g / mol), sfingomielina (SM, 760,22 g / mol) e colesterolo (Chol, 386,65 g / mol) al rapporto molare 4: 4: 2. La soluzione lipidica è ottenuta da una soluzione stock di ciascun lipide solubilizzato in un solvente a metanolo/cloroformio (3/1; volume/volume) a 25 mg/mL in un pallone a fondo tondo di vetro da 25 ml. Sulla base di 4 μmol di DOPC, 4 μmol di SM e 2 μmol di Chol, la soluzione lipidica è ottenuta da soluzione stock mescolando rispettivamente 126 μL, 117 μL e 31 μL. ATTENZIONE: Il metanolo è un solvente tossico e infiammabile e il cloroformio è tossico e cancerogeno. Entrambi devono essere maneggiati con la protezione appropriata sotto un cappuccio.</li>
	<li>Evaporare metanolo/cloroformio utilizzando un evaporatore rotativo sotto vuoto per 45-60 minuti a 60 °C fino alla formazione di un film lipidico essiccato.</li>
	<li>Preparare due soluzioni tampone HEPES di serie. Preparare il tampone HEPES 1 mescolando 20 mM HEPES (238,3 g/mol) e 75 mM NaCl (58,44 g/mol) e regolare il pH a 7,4. Preparare il tampone HEPES 2 mescolando 20 mM HEPES e 145 mM NaCl e regolare il pH a 7,4. I tamponi HEPES possono essere conservati a 4 °C per 1 mese. NOTA: Si consiglia di verificare l'osmolarità dei buffer utilizzando un osmometro.</li>
	<li>Preparare la soluzione di idratazione lipidica sciogliendo la coppia colorante-quencher fluorescente impermeabile alla membrana, 8-aminonaftalene-1, 3, acido 6-trisolfonico, sale disodico a 12,5 mM (ANTS, 427,33 g/mol) e p-xilene-bispyridinium bromuro a 45 mM (DPX, 422,16 g/mol) in soluzione tampone HEPES. La miscelazione di ANTS con DPX porta a una soluzione di colore giallo. Per raggiungere le concentrazioni di 12,5 mM di ANTS e 45 mM di DPX, sciogliere 21,4 mg e 76 mg, rispettivamente in 4 mL di tampone HEPES 1. NOTA: La soluzione di idratazione lipidica può essere conservata per 2 settimane a 4 °C avvolgendo il tubo con un foglio di alluminio.</li>
	<li>Ricostituire le vescicole multilamellari (MLV) riconsesciendo il film lipidico essiccato con 1 mL della soluzione di idratazione lipidica e vorticosamente fino alla dissoluzione del film lipidico essiccato. Assicurarsi che la soluzione sia completamente solubilizzata poiché piccoli aggregati lipidici avranno un impatto negativo sui passaggi precedenti. Inoltre, controllare la parete del pallone di vetro a fondo tondo per assicurarsi che non vi sia alcun film lipidico rimanente. NOTA: La soluzione apparirà opalescente e giallo chiaro dopo la solubilizzazione.</li>
	<li>Sottoporre le vescicole a cinque cicli di congelamento/disgelo per ottenere vescicole unilamellari. Eseguire ogni ciclo mettendo il pallone di vetro a fondo tondo per 30 s in azoto liquido per la fase di congelamento, quindi lasciandolo a bagnomaria per 2 minuti per la fase di scongelamento. NOTA: La temperatura dell'acqua del bagno deve essere superiore di 5-10°C alla temperatura di fusione dei lipidi.</li>
	<li>Preparare l'estrusore lipidico inserendo due supporti filtranti preliminarmente umidificati con tampone HEPES in ciascun pezzo di estrusore in politetrafluoroetilene (PTFE) posto nel contenitore dell'estrusore metallico.</li>
	<li>Mettere una membrana in policarbonato umidificato HEPES (dimensione dei pori di 0,1 μm, diametro 25 mm) sulla parte superiore di un supporto del filtro.</li>
	<li>Assemblate i due monti per estrusori metallici e avvitali.</li>
	<li>Posizionare l'estrusore assemblato nel supporto e introdurre una siringa da 1 mL nel foro appropriato all'estremità di ciascun pezzo di estrusore di politetrafluoroetilene. L'estrusione corrisponde al passaggio del liquido testato da una siringa all'altra attraverso la membrana in policarbonato.</li>
	<li>Testare l'estrusore con 1 mL di buffer HEPES caricato in una delle siringhe da 1 mL per assicurarsi che non vi siano perdite o problemi.</li>
	<li>Sostituire il buffer HEPES da 1 mL con il campione MLV.</li>
	<li>Eseguire l'estrusione facendo passare il campione MLV da una siringa all'altra attraverso la membrana in policarbonato almeno 21 volte per ottenere LUT uniformi delle stesse dimensioni. NOTA: L'estrusione deve essere eseguita a una temperatura superiore alla temperatura di fusione della miscela lipidica.</li>
</ol>2. Purificazione dei UV
<ol><li>Preparare una purificazione della colonna per rimuovere l'eccesso di ANTS e DPX non incapsulato.</li>
	<li>Introdurre gel destro reticolato (G-50) risospenso in mezzo acquoso con 0,01% NaN3 (65 g/mol) in una colonna per cromatografia liquida (Luer Lock, non rivestita, 1,0 cm x 20 cm, volume letto 16 mL) fino a 1 cm sotto la parte superiore della parte incolore della colonna.</li>
	<li>Aprire il rubinetto e lasciare scorrere il liquido per depositare il gel destrorso reticolato.</li>
	<li>Lavare la colonna eluita con 20 mL di buffer HEPES 2 ed eliminare il flusso di uscita della colonna.</li>
	<li>Chiudere il rubinetto una volta che il volume morto di solvente sopra la colonna è ridotto al minimo (<100 μL) ma sufficiente per evitare qualsiasi essiccazione del gel destrone reticolato.</li>
	<li>Posizionare i ROV appena estrusi (gialli) sulla colonna e farli entrare nel gel destrorso reticolato.</li>
	<li>Aggiungere continuamente il buffer HEPES 2 alla colonna per eseguire la purificazione LUV.</li>
	<li>Eluire circa 2 mL di tampone HEPES 2 (non dimenticare di riempire regolarmente la parte superiore della colonna per evitare di asciugare il gel destrolare reticolato): la soluzione libera gialla ANTS e DPX migra più lentamente dei liposomi.</li>
	<li>Inizia a raccogliere ROV purificati in tubi (1,5 ml).</li>
	<li>Osserva le gocce di eluente dalla colonna e quando diventano opalescenti, contengono liposomi. Cambiare il tubo per recuperare la frazione contenente LUV.</li>
	<li>Eluire fino a quando le gocce non sono più opalescenti (~1 mL). Successivamente, eluire altri 0,5 ml in una frazione separata e quindi interrompere l'eluizione. NOTA: Gli standard sono ora disponibili in una vasta gamma di pesi molecolari, come kit o singoli pesi molecolari per calibrare il volume di eluizione dei LUN.</li>
	<li>Avvolgere i tubi con i ROV in un foglio di alluminio per evitare lo sbiancamento del colorante a fluorescenza.</li>
	<li>Lavare la colonna con un buffer HEPES da 20 ml 2.</li>
	<li>I LUN possono quindi essere conservati per una settimana a 4 °C. NOTA: Poiché la stabilità LUV potrebbe dipendere dalla concentrazione e dalla composizione di LUV, nonché dalla forza ionica, la dimensione dei UV deve essere controllata utilizzando uno strumento di diffusione dinamica della luce (DLS) (vedere paragrafo 4. Caratterizzazione delle dimensioni e dell'omogeneità LUV) prima di ogni test.</li>
</ol>3. Quantificare la concentrazione di ROV
<ol><li>Stimare la concentrazione di LUV mediante un kit di quantificazione dei fosfolipidi, che consente la valutazione della concentrazione di colina19. Questo test potrebbe essere applicato quando i fosfolipidi con colina contenente testa polare sono sostanziali (>50% dei LUV).</li>
	<li>Preparare il reagente colorante sciogliendo 18 mg di substrato cromogeno in 3 mL di tampone fornito.</li>
	<li>Caricare una cuvetta di polistirene, 10 x 10 x 45 mm, con 3 ml di reagente di colore.</li>
	<li>Utilizzare il reagente di colore puro come condizione vuota (Blank). Aggiungere 20 μL di campione LUV (Test) o 20 μL di soluzione standard di concentrazione nota di colina (Standard).</li>
	<li>Mescolare bene e incubare per 5 minuti a 37 °C tutte le condizioni (Blank, Test e Standard).</li>
	<li>Misurare l'assorbanza (densità ottica, OD) del campione di prova e della soluzione standard con la soluzione in bianco come controllo a 600 nm con uno spettrofotometro.</li>
	<li>Controllare i valori OD che consentono di stimare la concentrazione lipidica dei LUD, C[LUV], in equivalente colina rispetto allo standard di concentrazione nota.</li>
	<li>Eseguire il calcolo utilizzando la seguente equazione: C[LUV] (mol / l) = (Campione OD / Standard OD) x C[Standard] (mol / l) NOTA: Il kit di quantificazione dei fosfolipidi ha fornito una soluzione standard di cloruro di colina (139,6 mg/l) a 54 mg/dL corrispondente alla concentrazione molare di C[Standard] = 3,87 mmol/L. OD Sample e OD Standard sono le assorbanze misurate a 600 nm per le soluzioni LUV e Colina, rispettivamente.</li>
</ol>4. Caratterizzazione delle dimensioni e dell'omogeneità del LUV
<ol><li>Eseguire una misurazione utilizzando uno strumento DLS per determinare la dimensione LUV (in nm) e l'indice di polidispersità (PdI).</li>
	<li>Programmare la "procedura operativa standard" (SOP) appropriata indicando la viscosità del solvente/tampone e della cuvetta utilizzata.</li>
	<li>Posizionare 500 μL della soluzione di LUV in una semi-micro cuvetta di polistirene.</li>
	<li>Inserire la semi-micro cuvetta in polistirene in uno strumento DLS.</li>
	<li>A temperatura ambiente, misurare la distribuzione dimensionale in termini di dimensione media (Z-media) della distribuzione delle particelle e di omogeneità (indice di polidispersità, PdI).</li>
	<li>Tutti i risultati sono ottenuti da due misurazioni indipendenti eseguite ciascuna in tre cicli ripetitivi. NOTA: i valori standard per i LUV saranno una dimensione media di 137 ± 7 nm con un PdI di 0,149 ± 0,041.</li>
</ol>5. Preparazione di soluzioni peptidiche
<ol><li>Preparare una soluzione stock del peptide, che deve essere analizzata per il test di perdita.</li>
	<li>Sciogliere la polvere peptidica (purezza >95%) in acqua pura (ad esempio, 1 mg di peptide in 500 μL di acqua pura). NOTA: Si raccomanda di diluire i peptidi in acqua pura e di evitare la solubilizzazione del dimetilsolfossido (DMSO), che potrebbe indurre artefatti (ad esempio, permeabilizzazione della membrana20).</li>
	<li>Vortice la soluzione peptidica per 5 s.</li>
	<li>Sonicare la soluzione peptidica in un bagno di sonicazione in acqua per 5 minuti e quindi centrifugare per 5 minuti a 12.225 x g. Raccogliere il surnatante per la determinazione della concentrazione.</li>
	<li>Misurare l'assorbanza a 280 nm di tre diluizioni peptidiche indipendenti e quindi calcolare la concentrazione peptidica utilizzando il suo coefficiente di estinzione molare ε (a seconda del contenuto di triptofano e tirosina nella sequenza peptidica) e la regola di Beer-Lambert. NOTA: Se il peptide contiene triptofano e tirosina, il coefficiente di estinzione molare ε viene calcolato sulla base di triptofano ε = 5.690 M-1cm-1 e tirosina ε = 1.280 M-1cm-1. Se la sequenza peptidica non contiene triptofano o tirosina, è possibile eseguire altri test colorimetrici per misurare la concentrazione (ad esempio, BCA o Bradford).</li>
	<li>Diluire la soluzione peptidica in acqua pura fino a una soluzione finale di 100 μM e conservare a 4 °C. NOTA: In acqua pura, non si verifica alcuna degradazione peptidica durante lo stoccaggio a 4 °C. Tuttavia, la concentrazione di peptidi deve essere misurata ogni 2 settimane per garantire che non si verifichi alcuna evaporazione dell'acqua.</li>
</ol>6. Saggio di perdita di fluorescenza
<ol><li>Il saggio di perdita di fluorescenza viene misurato su uno spettrofluorometro a temperatura ambiente. La lunghezza d'onda di eccitazione ed emissione è fissata rispettivamente a Ex = 360 nm ± 3 nm ed Em = 530 nm ± 5 nm.</li>
	<li>Diluire i ROV in tampone HEPES 2 da 1 mL fino a una concentrazione finale di 100 μM in una cuvetta a fluorescenza al quarzo. Aggiungere un agitatore magnetico per omogeneizzare la soluzione durante l'esperimento.</li>
	<li>Misurare i SOLI ROV durante i primi 100 s, tra t = 0 s e t = 99 s per accedere alla fluorescenza di fondo. NOTA: I SOLI VUV potrebbero anche essere misurati durante l'intero esperimento (15 min) per accedere alla fluorescenza di fondo e alle potenziali perdite.</li>
	<li>Successivamente, misurare la perdita come un aumento dell'intensità di fluorescenza dopo l'aggiunta di aliquote di soluzione peptidica per i successivi 900 s (15 min). Questo protocollo viene eseguito per ogni concentrazione di peptide testata da 0,1 μM a 2,5 μM.</li>
	<li>Infine, la fluorescenza al 100% è stata ottenuta solubilizzando i UV con l'aggiunta di 1 μL di Triton X-100 (0,1%, v/v), risultando nella sonda completamente inestinguibile tra t = 1.000 s e t = 1.100 s.</li>
</ol>7. Quantificazione della perdita
<ol><li>Sopprimere i valori ottenuti dopo t = 1.090 s per mantenere lo stesso numero di punti per ogni condizione testata.</li>
	<li>Calcola la fluorescenza minima, Fmin, facendo la media di 50 punti tra t = 0 s e t = 49 s (solo LUV).</li>
	<li>Calcola la fluorescenza massima, Fmax, facendo la media di 50 punti tra t = 1.041 s e t = 1.090 s (LUN con Triton X-100).</li>
	<li>Calcola la percentuale di perdita (%Perdita) in ogni punto temporale (t = x), secondo la seguente equazione: %Perdita(t=x) = (F(t=x) - Fmin) / (Fmax - Fmin) x 100</li>
	<li>Calcolare la deviazione media e standard per i valori ottenuti con diversa preparazione LUV (n ≥ 2) per la stessa condizione.</li>
	<li>Traccia la percentuale di perdita, %Perdita(t=x), in funzione del tempo (i).</li>
</ol>

<ol>
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G., Persson, D., Karlsson, M., Nord&#233;n, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Antennapedia+peptide+penetratin+translocates+across+lipid+bilayers+-+the+first+direct+observation.">The Antennapedia peptide penetratin translocates across lipid bilayers - the first direct observation.</a> FEBS Letters. 482 (3), 265-268 (2000).</li><li>Mishra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+HIV+TAT+peptide+and+analogues+induced+by+multiplexed+membrane+and+cytoskeletal+interactions.">Translocation of HIV TAT peptide and analogues induced by multiplexed membrane and cytoskeletal interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (41), 16883-16888 (2011).</li><li>Rouser, G., Fleischer, S., Yamamoto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+dimensional+thin+layer+chromatographic+separation+of+polar+lipids+and+determination+of+phospholipids+by+phosphorus+analysis+of+spots.">Two dimensional thin layer chromatographic separation of polar lipids and determination of phospholipids by phosphorus analysis of spots.</a> Lipids. 5 (5), 494-496 (1970).</li><li>Bartlett, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorus+assay+in+column+chromatography.">Phosphorus assay in column chromatography.</a> Journal of Biological Chemistry. 234 (3), 466-468 (1959).</li><li>Stewart, J. C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+determination+of+phospholipids+with+ammonium+ferrothiocyanate.">Colorimetric determination of phospholipids with ammonium ferrothiocyanate.</a> Analytical Biochemistry. 104 (1), 10-14 (1980).</li><li>Spinella, S. A., Nelson, R. B., Elmore, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+peptide+translocation+into+large+unilamellar+vesicles.">Measuring peptide translocation into large unilamellar vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3571 (2012).</li><li>Wimley, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+effects+of+membrane-interacting+peptides+on+membrane+integrity.">Determining the effects of membrane-interacting peptides on membrane integrity.</a> Cell-Penetrating Peptides. 1324, 89-106 (2015).</li><li>B&#225;r&#225;ny-Wallje, E., Gaur, J., Lundberg, P., Langel, U., Gr&#228;slund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+membrane+perturbation+caused+by+the+cell+penetrating+peptide+Tp10+depending+on+attached+cargo.">Differential membrane perturbation caused by the cell penetrating peptide Tp10 depending on attached cargo.</a> FEBS Letters. 581 (13), 2389-2393 (2007).</li><li>van Rooijen, B. D., Claessens, M. M. A. E., Subramaniam, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+permeabilization+by+oligomeric+&#945;-Synuclein:+in+search+of+the+mechanism.">Membrane permeabilization by oligomeric &#945;-Synuclein: in search of the mechanism.</a> PloS One. 5 (12), 14292 (2010).</li><li>Hassane, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+cellular+trafficking+of+splice+redirecting+oligonucleotides+complexed+with+chemically+modified+cell-penetrating+peptides.">Insights into the cellular trafficking of splice redirecting oligonucleotides complexed with chemically modified cell-penetrating peptides.</a> Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 153 (2), 163-172 (2011).</li><li>Asciolla, J. J., Renault, T. T., Chipuk, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examining+BCL-2+family+function+with+large+unilamellar+vesicles.">Examining BCL-2 family function with large unilamellar vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (68), e4291 (2012).</li><li>Grewer, C., Gameiro, A., Mager, T., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+characterization+of+membrane+transport+proteins.">Electrophysiological characterization of membrane transport proteins.</a> Annual Review of Biophysics. 42 (1), 95-120 (2013).</li></ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse.

Il test di perdita di fluorescenza presentato è un metodo semplice e veloce per affrontare la destabilizzazione della membrana da parte del peptide che penetra nelle cellule. Facile da fare, consente anche un confronto indiretto tra diversi peptidi che interagiscono con la membrana o altre molecole che interagiscono con la membrana. Per quanto riguarda le fasi critiche del protocollo, poiché questo test fornisce valori relativi tra il basale (SOLO LUV) e il massimo rilascio di fluorescenza (condizione di Triton), di so...

Dopo la loro scoperta negli anni novanta, sono stati sviluppati peptidi penetranti nelle cellule (CPP) per promuovere un efficiente trasporto cellulare di carichi attraverso la membranaplasmatica 1,2. I CPP sono di solito peptidi corti, generalmente da 8 a 30 amminoacidi, con un'ampia varietà di origini. Sono stati inizialmente definiti come portatori "traslocanti diretti", il che significa che erano in grado di attraversare la membrana plasmatica e di trasferire un carico nelle cellule indipendentemente da qualsiasi via endocitotica né dal fabbisogno energetico né dal coinvolgimento del recettore. Tuttavia, ulteriori indagini hanno rivelato che queste prime osservazioni provenivano principalmente da sovrastima di fluorescenza dovuta all'artefatto sperimentale e / o ai protocolli di fissazione che utilizzavano metanolo3. Al giorno d'oggi, è ampiamente accettato che l'assorbimento di CPP avviene sia per endocitosi che per traslocazione indipendente dall'energia4,5,6,7 a seconda di diversi parametri come la natura del carico, il collegamento utilizzato tra CPP e carico, la linea cellulare studiata, ecc.
I CPP possono essere utilizzati come agenti di trasfezione secondo due strategie, che coinvolgono un legame chimico (strategia covalente) o interazioni elettrostatiche / idrofobiche (strategia non covalente) tra il CPP e il suo carico8,9,10,11. Sebbene entrambe le strategie abbiano dimostrato la loro efficienza nel trasferimento cellulare di diversi carichi, la comprensione del meccanismo di internalizzazione da parte dei CPP è ancora controversa e l'equilibrio tra vie di endocitosi o penetrazione diretta è ancora difficile da misurare12,13. Sebbene sia disponibile una serie di strumenti e strategie sperimentali per affrontare chiaramente il coinvolgimento dei processi endocitici, la traslocazione diretta sembra, tuttavia, più difficile da caratterizzare poiché implica interazioni più discrete con i componenti della membrana plasmatica. Le membrane biologiche sono solitamente composte da numerosi componenti, dai fosfolipidi alle proteine di membrana, che possono variare a seconda del tipo cellulare e/o dell'ambiente (condizioni di stress, divisione cellulare, ecc.). Questa diversità di composizione, e di conseguenza l'assenza di un modello di membrana cellulare universale, non consente studi in un unico modo. Tuttavia, per aggirare queste limitazioni sono stati sviluppati approcci passo-passo con estratti di membrana o membrana artificiali. Dalle piccole vescicole unilamellari agli approcci monostrato, ogni modello era chiaramente pertinente per rispondere alle domande specifiche14,15. Tra questi, le grandi vescicole unilamellari (LUV) costituiscono un modello appropriato di imitazione della membrana per studiare le interazioni peptide/ membrana come punto chiave nel processo di internalizzazione.
In questo contesto, il seguente protocollo descrive lo studio degli effetti dei peptidi e delle interazioni peptidi/membrana sull'integrità dei LUD attraverso il monitoraggio sia di un colorante fluorescente anionico che del corrispondente quencher policanica incapsulato in liposomi. Questo strumento viene utilizzato per studiare le interazioni CPP/membrana al fine di capire se sono in grado di eseguire una traslocazione diretta della membrana. Sebbene di solito applicato per confrontare diversi peptidi che interagiscono con la membrana, questo saggio di perdita di fluorescenza LUV potrebbe anche essere utilizzato per studiare sia i coniugati CPP-cargo (strategia covalente) che i complessi CPP:cargo (strategia non covalente).
Il presente protocollo sarà quindi prima esemplificato con i peptidi anfipatici ricchi di triptofano (W) e arginina (R) (WRAP)16recentemente sviluppati. WRAP è in grado di formare nanoparticelle a base di peptidi per fornire rapidamente ed efficacemente piccoli RNA interferenti (siRNA) in diverse linee cellulari16. Le proprietà di perdita di fluorescenza del peptide WRAP da solo o delle nanoparticelle a base di WRAP caricate con siRNA sono state monitorate per caratterizzare il loro meccanismo di internalizzazione cellulare. La Corte ha dimostrato che il loro meccanismo di internalizzazione riguardava principalmente la traslocazione diretta7. In un secondo esempio, il peptide WRAP è stato coniugato covalentemente al peptide interferente proteina/proteina iCAL36 (WRAP-iCAL36)17 e la sua capacità di destabilizzare le membrane è stata confrontata in un saggio di perdita di fluorescenza con iCAL36 accoppiato a Penetratin18 (Penetratin-iCAL36), un altro CPP.
Infine, verranno discussi i vantaggi e i limiti del metodo sia dal punto di vista tecnologico che rispetto alla rilevanza biologica.

<table><tbody><tr><td>25 mL glass round-bottom flask</td><td>Pyrex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8-aminonaphthalene-1, 3, 6-trisulfonic acid, disodium salt (ANTS)</td><td>Invitrogen</td><td>A350</td><td>Protect from light&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Chloroform&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>288306</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>DOPC (dioleoylphosphatidylcholine)</td><td>Avanti Polar</td><td>850375P</td><td>Protect from air</td></tr><tr><td>Extruder</td><td>Avanti Polar</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>Fluorimeter</td><td>PTI Serlabo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 &amp;micro;L glass syringe</td><td>Hamilton</td><td>705N</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>LabAssay Phospholipid&amp;nbsp;</td><td>WAKO&amp;nbsp;</td><td>296-63801</td><td></td></tr><tr><td>liquid chromatography column</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Carlo Erba</td><td>414902</td><td></td></tr><tr><td>Nuclepore polycarbonate membrane (0.1 &amp;micro;m pore size, 25 mm diameter)</td><td>Whatman</td><td>800309</td><td></td></tr><tr><td>polystyrene cuvette, 10 x 10 x 45 mm</td><td>Grener Bio-One</td><td>614101</td><td></td></tr><tr><td>polystyrene semi-micro cuvette, DLS</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB55924</td><td></td></tr><tr><td>p-xylene-bispyridinium bromide (DPX)</td><td>Invitrogen</td><td>X1525</td><td>Protect from light&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>quartz fluorescence cuvette</td><td>Hellma</td><td>109.004F-QS</td><td></td></tr><tr><td>rotavapor system&amp;nbsp;</td><td>Heidolph</td><td>Z334898</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-50 resin</td><td>Amersham</td><td>17-0042-01</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide (NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chlorid (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator bath USC300T</td><td>VWR</td><td>142-6001</td><td></td></tr><tr><td>Sphingomyelin</td><td>Avanti Polar</td><td>860062P</td><td>Protect from air</td></tr><tr><td>Triton X-100&amp;nbsp;</td><td>Eromedex</td><td>2000-B</td><td></td></tr><tr><td>Zetaziser NanoZS&amp;nbsp;</td><td>Malvern</td><td>ZEN3500</td><td></td></tr></tbody></table>

fluorescent leakage assay to investigate membrane destabilization by cell-penetrating peptide

I peptidi penetranti nelle cellule (CPP) sono definiti come vettori in grado di attraversare la membrana plasmatica e di trasferire un carico nelle cellule. Una delle principali caratteristiche comuni richieste per questa attività deriva dalle interazioni dei CPP con la membrana plasmatica (lipidi) e più in particolare con componenti della matrice extracellulare della membrana stessa (eparano solfato). Infatti, indipendentemente dalla traslocazione diretta o dall'internalizzazione endocitosi-dipendente, i doppi strati lipidici sono coinvolti nel processo di internalizzazione sia a livello della membrana plasmatica che a livello del traffico intracellulare (vescicole endosomiali). In questo articolo, presentiamo un protocollo dettagliato che descrive le diverse fasi di una formulazione, purificazione, caratterizzazione e applicazione di vescicole unilamellari di grandi dimensioni (LUV) nel saggio di perdita di fluorescenza al fine di rilevare possibili destabilizzazioni / interazioni CPP-membrana e affrontare il loro ruolo nel meccanismo di internalizzazione. I LUV con una composizione lipidica che riflette il contenuto della membrana plasmatica vengono generati per incapsulare sia un colorante fluorescente che un quencher. L'aggiunta di peptidi nel mezzo extravesicolare e l'induzione di interazioni peptido-membrana sui UV potrebbero quindi indurre in modo dose-dipendente un significativo aumento della fluorescenza rivelando una perdita. Esempi sono forniti qui con i peptidi anfipatici ricchi di triptofano (W) e arginina (R) (WNAP) ricchi di recente, che hanno mostrato una consegna rapida ed efficiente di siRNA in varie linee cellulari. Infine, la natura di queste interazioni e l'affinità per i lipidi sono discusse per comprendere e migliorare la traslocazione della membrana e/o la fuga endosomiale.

Il principio del saggio di dispersione in fluorescenza è mostrato nella Figura 1. In dettaglio, le grandi vescicole unilamellari (LUV) che incapsulano un colorante fluorescente e un quencher (nessun segnale di fluorescenza) sono trattate con la biomolecola di interesse. A causa dell'interazione del peptide con le membrane lipidiche, che potrebbe implicare permeabilità della membrana, riorganizzazione o addirittura rottura, il colorante a fluorescenza e il q...

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Fluorescent Leakage Assay to Investigate Membrane Destabilization by Cell-Penetrating Peptide

Il test di perdita di fluorescenza è un metodo semplice che consente di studio delle interazioni peptidi/membrana al fine di comprendere il loro coinvolgimento in diversi processi biologici e in particolare la capacità dei peptidi penetranti nelle cellule di disturbare i doppio strati dei fosfolipidi durante un processo di traslocazione cellulare diretta.

Saggio di perdita fluorescente per studiare la destabilizzazione della membrana da parte di peptidi a penetrazione cellulare

Cell-penetrating peptides (CPPs) are defined as carriers that are able to cross the plasma membrane and to transfer a cargo into cells. One of the main ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

6.1K Views.  INSERM U1046 - CNRS UMR 9214 - University of Montpellier. Il test di perdita di fluorescenza è un metodo semplice che consente di studio delle interazioni peptidi/membrana al fine di comprendere il loro coinvolgimento in diversi processi biologici e in particolare la capacità dei peptidi penetranti nelle cellule di disturbare i doppio strati dei fosfolipidi durante un processo di traslocazione cellulare diretta.

Video: Fluorescent Leakage Assay to Investigate Membrane Destabilization by Cell-Penetrating Peptide

Construction of Cyclic Cell-Penetrating Peptides for Enhanced Penetration of Biological Barriers

Cancer has been a grand challenge in global health. However, the complex tumor microenvironment generally limits the access of therapeutics to deeper tumor cells, leading to tumor recurrence. To conquer the limited penetration of biological barriers, cell-penetrating peptides (CPPs) have been discovered with excellent membrane translocation ability and have emerged as useful molecular transporters for delivering various cargoes into cells. However, conventional linear CPPs generally show compromised proteolytic stability, which limits their permeability across biological barriers. Thus, the development of novel molecular transporters that can penetrate biological barriers and exhibit enhanced proteolytic stability is highly desired to promote drug delivery efficiency in biomedical applications. We have previously synthesized a panel of short cyclic CPPs with aromatic crosslinks, which exhibited superior permeability in cancer cells and tissues compared to their linear counterparts. Here, a concise protocol is described for the synthesis of the fluorescently labeled cyclic polyarginine R8 peptide and its linear counterpart, as well as key steps for investigating their cell permeability.

This protocol describes the synthesis of cyclic cell-penetrating peptides with aromatic cross-links and the evaluation of their permeability across biological barriers.

Costruzione di peptidi ciclici che penetrano nelle cellule per una maggiore penetrazione delle barriere biologiche

Cancer has been a grand challenge in global health. However, the complex tumor microenvironment generally limits the access of therapeutics to deeper ...

Ricerca

Chimica

Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope

Numerous pathophysiological insults can cause damage to cell membranes and, when coupled with innate defects in cell membrane repair or integrity, can result in disease. Understanding the underlying molecular mechanisms surrounding cell membrane repair is, therefore, an important objective to the development of novel therapeutic strategies for diseases associated with dysfunctional cell membrane dynamics. Many in vitro and in vivo studies aimed at understanding cell membrane resealing in various disease contexts utilize two-photon laser ablation as a standard for determining functional outcomes following experimental treatments. In this assay, cell membranes are subjected to wounding with a two-photon laser, which causes the cell membrane to rupture and fluorescent dye to infiltrate the cell. The intensity of fluorescence within the cell can then be monitored to quantify the cell's ability to reseal itself. There are several alternative methods for assessing cell membrane response to injury, as well as great variation in the two-photon laser wounding approach itself, therefore, a single, unified model of cell wounding would beneficially serve to decrease the variation between these methodologies. In this article, we outline a simple two-photon laser wounding protocol for assessing cell membrane repair in vitro in both healthy and dysferlinopathy patient fibroblast cells transfected with or without a full-length dysferlin plasmid.

Cell membrane wounding via two-photon laser is a widely used method for assessing membrane resealing ability and can be applied to multiple cell types. Here, we describe a protocol for in vitro live-imaging of membrane resealing in dysferlinopathy patient cells following two-photon laser ablation.

Analisi di riparazione della membrana cellulare usando un microscopio a due fotoni Laser

Numerous pathophysiological insults can cause damage to cell membranes and, when coupled with innate defects in cell membrane repair or integrity, can ...

Immunologia e infezioni

Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1. Many of these are referred to as cell-penetrating peptides, which are frequently noted for their potential as drug delivery vectors1-3. Moreover, there is increasing interest in antimicrobial peptides that operate via non-membrane lytic mechanisms4,5, particularly those that cross bacterial membranes without causing cell lysis and kill cells by interfering with intracellular processes6,7. In fact, authors have increasingly pointed out the relationship between cell-penetrating and antimicrobial peptides1,8. A firm understanding of the process of membrane translocation and the relationship between peptide structure and its ability to translocate requires effective, reproducible assays for translocation. Several groups have proposed methods to measure translocation into large unilamellar lipid vesicles (LUVs)9-13. LUVs serve as useful models for bacterial and eukaryotic cell membranes and are frequently used in peptide fluorescent studies14,15. Here, we describe our application of the method first developed by Matsuzaki and co-workers to consider antimicrobial peptides, such as magainin and buforin II16,17. In addition to providing our protocol for this method, we also present a straightforward approach to data analysis that quantifies translocation ability using this assay. The advantages of this translocation assay compared to others are that it has the potential to provide information about the rate of membrane translocation and does not require the addition of a fluorescent label, which can alter peptide properties18, to tryptophan-containing peptides. Briefly, translocation ability into lipid vesicles is measured as a function of the Foster Resonance Energy Transfer (FRET) between native tryptophan residues and dansyl phosphatidylethanolamine when proteins are associated with the external LUV membrane (Figure 1). Cell-penetrating peptides are cleaved as they encounter uninhibited trypsin encapsulated with the LUVs, leading to disassociation from the LUV membrane and a drop in FRET signal. The drop in FRET signal observed for a translocating peptide is significantly greater than that observed for the same peptide when the LUVs contain both trypsin and trypsin inhibitor, or when a peptide that does not spontaneously cross lipid membranes is exposed to trypsin-containing LUVs. This change in fluorescence provides a direct quantification of peptide translocation over time.

This protocol details a method for the quantitative measure of peptide translocation into large unilamellar lipid vesicles. This method also provides information about the rate of membrane translocation and can be used to identify peptides that efficiently and spontaneously cross lipid bilayers.

Misurazione Traslocazione Peptide in grandi vescicole unilamellari

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1.  Many of these are referred ...

Biologia

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein-base Espressione Proiezione di proteine ​​di membrana in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established for many membrane proteins. A simple technique called fluorescence protease protection (FPP) is presented, which permits the determination of membrane protein topology in living cells. This technique has numerous advantages over other methods for determining protein topology, in that it does not require the availability of multiple antibodies against various domains of the membrane protein, does not require large amounts of protein, and can be performed on living cells. The FPP method employs the spatially confined actions of proteases on the degradation of green fluorescent protein (GFP) tagged membrane proteins to determine their membrane topology and orientation. This simple approach is applicable to a wide variety of cell types, and can be used to determine membrane protein orientation in various subcellular organelles such as the mitochondria, Golgi, endoplasmic reticulum and components of the endosomal/recycling system. Membrane proteins, tagged on either the N-termini or C-termini with a GFP fusion, are expressed in a cell of interest, which is subject to selective permeabilization using the detergent digitonin. Digitonin has the ability to permeabilize the plasma membrane, while leaving intracellular organelles intact. GFP moieties exposed to the cytosol can be selectively degraded through the application of protease, whereas GFP moieties present in the lumen of organelles are protected from the protease and remain intact. The FPP assay is straightforward, and results can be obtained rapidly.

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection FPP

Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP.

Determinazione Membrane Protein Topologia Usando fluorescenza Protease Protection (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established ...

Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded proteins may serve as potential therapeutic targets. To distinguish degradation of misfolding-prone proteins from other mechanisms that regulate their levels, one important method is to measure protein half-life in cells. However, this can be challenging because misfolding-prone proteins may exist in different forms, including the native form and misfolded forms of distinct characteristics. Here we describe assays to examine the half-life of misfolded proteins in mammalian cells using a highly aggregation-prone protein, Ataxin-1 with an extended polyglutamine (polyQ) stretch, and a conformationally unstable luciferase mutant as models. Cycloheximide chase is combined with cell fractionation to examine the turnover rate of misfolding-prone proteins in various cellular fractions. We further depict a fluorescence-based assay using an enhanced green fluorescence protein (EGFP)-fusion of the luciferase mutant, which can be adapted for high throughput screening on a microplate-reader.

This report describes protocols for measuring degradation rates of misfolded proteins by either western blot or fluorescence-based assays. The methods can be applied to analysis of other misfolded proteins and for high throughput screening.

Saggi per la degradazione delle proteine ​​nelle cellule mal ripiegate

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded ...

Utilizing pHluorin-tagged Receptors to Monitor Subcellular Localization and Trafficking

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular organelles and those localized on the plasma membrane. Traditional fluorescence-based measurements lack the capability to distinguish membrane proteins residing in different organelles. Cutting edge methodologies transcend traditional methods by coupling pH-sensitive fluorophores with total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). TIRF illumination excites the sample up to approximately 150 nm from the glass-sample interface, thus decreasing background, increasing the signal to noise ratio, and enhancing resolution. The excitation volume in TIRFM encompasses the plasma membrane and nearby organelles such as the peripheral ER. Superecliptic pHluorin (SEP) is a pH sensitive version of GFP. Genetically encoding SEP into the extracellular domain of a membrane protein of interest positions the fluorophore on the luminal side of the ER and in the extracellular region of the cell. SEP is fluorescent when the pH is greater than 6, but remains in an off state at lower pH values. Therefore, receptors tagged with SEP fluoresce when residing in the endoplasmic reticulum (ER) or upon insertion in the plasma membrane (PM) but not when confined to a trafficking vesicle or other organelles such as the Golgi. The extracellular pH can be adjusted to dictate the fluorescence of receptors on the plasma membrane. The difference in fluorescence between TIRF images at neutral and acidic extracellular pH for the same cell corresponds to a relative number of receptors on the plasma membrane. This allows a simultaneous measurement of intracellular and plasma membrane resident receptors. Single vesicle insertion events can also be measured when the extracellular pH is neutral, corresponding to a low pH trafficking vesicle fusing with the plasma membrane and transitioning into a fluorescent state. This versatile technique can be exploited to study localization, expression, and trafficking of membrane proteins.

Labeling the extracellular domain of a membrane protein with a pH sensitive fluorophore, superecliptic pHluorin (SEP), allows subcellular localization, expression, and trafficking to be determined. Imaging SEP-labeled proteins with total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) enables the quantification of protein levels in the peripheral ER and plasma membrane.

Utilizzando Recettori pHluorin-tag per il monitoraggio subcellulare localizzazione e il traffico

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular ...

Fluorescence Microplate-Based Cycloheximide Chase Assay: A Technique to Monitor the Degradation Kinetics of Fluorescent Nuclear Misfolded Proteins

Source: Guo, L. et. al., <a href="https://app.jove.com/v/54266">Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells.</a> J. Vis. Exp. (2016)
This video describes an in vitro fluorescence-based microplate assay to study the degradation kinetics of a fluorescently-labeled misfolded luciferase mutant protein expressed in the nuclei of transfected mammalian cells. The assay involves the treatment of cells expressing the fluorescent mutant protein with a translation inhibitor and a proteasome inhibitor to assess the proteasome-mediated degradation of the misfolded protein.

Saggio di inseguimento della cicloesimide basato su micropiastre a fluorescenza: una tecnica per monitorare la cinetica di degradazione delle proteine nucleari mal ripiegate fluorescenti

Source: Guo, L. et. al., Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells. J. Vis. Exp. (2016)
This video describes an in vitro ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biological Techniques

Assay Techniques

Biochemical assays

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen the Proteolytic Activity of Proteases

Source: Jaimes, J. A., et al. <a href="https://app.jove.com/v/58892">A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation.</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video demonstrates an assay to screen for the proteolytic activity of proteases using fluorogenic peptides. The protease recognizes its cleavage site on the peptide, cleaving it and separating the quencher from the fluorophore, enabling its fluorescence emission. The fluorescence signal is detected and analyzed to check for the cleavage efficiency of different peptide variants.

Un saggio di scissione del peptide fluorogenico per lo screening dell'attività proteolitica delle proteasi

1. Designing and Preparing the Peptides

	Acquire the sequence of the fusion protein of interest from a public database such as NCBI ...

Immunology

Immunodiagnostics

Specialized Assays

Fluorescence Leakage Assay to Study Cell-Penetrating Peptide Interaction with Membrane

Source: Konate, K. et al. <a href="https://app.jove.com/v/62028">Fluorescent Leakage Assay to Investigate Membrane Destabilization by Cell-Penetrating Peptide.</a> J. Vis. Exp. (2020)
This video discusses the fluorescence leakage assay to study the interactions of cell-penetrating peptides with cell membranes using cell membrane mimics &#8212; large unilamellar vesicles, or LUVs, encapsulated with a fluorescent dye and a quencher.

Saggio di perdita di fluorescenza per studiare l'interazione del peptide che penetra nelle cellule con la membrana

Source: Konate, K. et al. Fluorescent Leakage Assay to Investigate Membrane Destabilization by Cell-Penetrating Peptide. J. Vis. Exp. (2020)
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Saggio di perdita fluorescente per studiare la destabilizzazione della membrana da parte di peptidi a penetrazione cellulare

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Costruzione di peptidi ciclici che penetrano nelle cellule per una maggiore penetrazione delle barriere biologiche

Analisi di riparazione della membrana cellulare usando un microscopio a due fotoni Laser

Misurazione Traslocazione Peptide in grandi vescicole unilamellari

Green Fluorescent Protein-base Espressione Proiezione di proteine di membrana in

Determinazione Membrane Protein Topologia Usando fluorescenza Protease Protection (FPP)

Saggi per la degradazione delle proteine nelle cellule mal ripiegate

Utilizzando Recettori pHluorin-tag per il monitoraggio subcellulare localizzazione e il traffico

Saggio di inseguimento della cicloesimide basato su micropiastre a fluorescenza: una tecnica per monitorare la cinetica di degradazione delle proteine nucleari mal ripiegate fluorescenti

Un saggio di scissione del peptide fluorogenico per lo screening dell'attività proteolitica delle proteasi

Saggio di perdita di fluorescenza per studiare l'interazione del peptide che penetra nelle cellule con la membrana

Saggio di perdita fluorescente per studiare la destabilizzazione della membrana da parte di peptidi a penetrazione cellulare

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Analisi di riparazione della membrana cellulare usando un microscopio a due fotoni Laser

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Green Fluorescent Protein-base Espressione Proiezione di proteine ​​di membrana in

Determinazione Membrane Protein Topologia Usando fluorescenza Protease Protection (FPP)

Saggi per la degradazione delle proteine ​​nelle cellule mal ripiegate

Utilizzando Recettori pHluorin-tag per il monitoraggio subcellulare localizzazione e il traffico

Saggio di inseguimento della cicloesimide basato su micropiastre a fluorescenza: una tecnica per monitorare la cinetica di degradazione delle proteine nucleari mal ripiegate fluorescenti

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Saggio di perdita di fluorescenza per studiare l'interazione del peptide che penetra nelle cellule con la membrana

Green Fluorescent Protein-base Espressione Proiezione di proteine di membrana in

Saggi per la degradazione delle proteine nelle cellule mal ripiegate