Os autores gostariam de agradecer a Eleanor Fleming e Jessica Chen para discussões úteis. O financiamento foi fornecido pelo Instituto Nacional de Alergias e Doenças Infecciosas (NIH-NIAID) Award e um R15AI079685 Research Corporation Cottrell Prêmio Faculdade de Ciências. Apoio ao estudante adicional foi fornecido pelo Instituto Médico Howard Hughes e do fundo de Staley.

1. Preparação de grandes vesículas lipídicas Unilamelares (luvs) <ol><li> Prepare luvs para servir como membrana celular imita para o ensaio 19. </li><li> Fosfatidilcolina Mix (POPC, 760,10 g / mol), fosfatidilglicerol (POPG. 770,99 g / mol), 5-dimethylaminonaphthalene-1-sulfonil fosfatidiletanolamina (DNS-PAPA, 994,350 g / mol) (Avanti Polar Lipids) dissolvido em clorofórmio a 50 : taxa de 45:5. Como todo ensaio requer a preparação separada de luvs tanto experimental e controle, dois frascos de bolo de lipídios deve ser preparado. 0,376 mg de lipídio total (0,188 mg POPC, 0,169 mg POPG e 0,019 mg DNS-POPE) é geralmente suficiente para fazer vesículas suficientes para um julgamento translocação único. </li><li> Evaporar o clorofórmio através de um fluxo de gás N 2. </li><li> Secar o bolo de lipídios 14/09 horas num exsicador de vácuo. </li><li> Prepare um estoque de 10 mM tampão HEPES (10 mM HEPES, 238,3 g / mol, 45 mM NaCl, 58,44 g / mol, 1 mM EDTA, 372,24 g / mol pH 7,4). Tampão HEPES é stORed a 4 ° C. </li><li> Prepare uma solução estoque de 0,4 mM de tripsina suína (23,3 kg / mol) em 10 mM tampão HEPES preparado acima. Tripsina é armazenada a -20 ° C e, em nossa prática, geralmente não passam por mais de dois ciclos de congelamento e descongelamento antes de usar. </li><li> Prepare uma solução estoque de 4,0 mM Bowman-Birk inibidor de tripsina (8 kg / mol) em 10 mM tampão HEPES e armazenar a -20 ° C. Em nosso uso, esse estoque é reabastecido mensais e, normalmente, não sofre mais de 3 congelamento / degelo antes que seja feita novamente. </li><li> Reconstituir experimental vesículas multilamelares (MLVs) em uma solução de tripsina 0,2 mM, adicionando um volume igual de 0,4 mM de ações de tripsina e 10 mM tampão HEPES para o bolo de lipídios secas. Para uma única amostra de 0,376 mg de lipídeos totais, uma mistura de 150 mL de solução de tripsina e 150 mL de tampão HEPES é suficiente. </li><li> Reconstituir MLVs controle em uma solução com 0,2 mM e 2,0 mm de tripsina Bowman-Birk inibidor de tripsina, adicionando um volume igual a 0.4 mM estoque de tripsina e 4,0 mM inibidor de tripsina para os bolos secos de lipídios. Para uma única amostra de 0,376 mg de lipídeos totais, uma mistura de 150 mL de solução de tripsina e 150 mL de inibidor de tripsina é suficiente. </li><li> Soluções de transferência de MLV de frascos de vidro com 1,7 ml tubo de microcentrífuga. </li><li> Assunto MLV soluções a 5 congelamento / descongelamento em nitrogênio líquido. </li><li> Prepare lipídica extrusora (Avanti Polar Lipids), colocando dois suportes de filtro umedecido em solução tampão HEPES em cada pedaço extrusora Teflon. Coloque uma membrana track Nuclepore gravado com 0,1 mM poros (Whatman, Reino Unido), entre as duas peças Teflon extrusora, e coloque os pedaços dentro do canister extrusora extrusor metal. Coloque o espaçador donut sobre as duas peças extrusora antes de apertar a tampa de metal da caixinha extrusora e colocando-o no suporte. </li><li> Preencher o volume vazio dentro da extrusora com 500 10 mM tampão HEPES mL usando uma seringa de vidro 250 mL para evitar perda de amostra de vesícula. &lt;/ Li&gt; <li> Carga cada amostra MLV na extrusora e empurre a amostra através da membrana pelo menos 21 vezes para garantir o tamanho das vesículas unilamelares uniforme. Luvs são obtidos a partir da extrusão seguinte solução MLV. </li><li> Luvs armazenar a 4 ° C e usar dentro de 48 horas. </li></ol> 2. Quantificar LUV Concentração <ol><li> LUV concentração foi quantificada através da determinação do teor total de fósforo na amostra 20. </li><li> Prepare 8,9 NH 2 SO 4 em água NanoPure e armazenar em temperatura ambiente. </li><li> Prepare um w 2,5% / v molibdato de amônio VI (588,04 g / mol) solução em água NanoPure. Prepare um ácido ascórbico 10% w / v (176,1 g / mol) solução em água NanoPure. Proteger a solução de ácido ascórbico a partir de exposição à luz, cobrindo o tubo com papel alumínio. Loja ambas as soluções a 4 ° C por até 2 meses. </li><li> Prepare 0,65 mM tampão fosfato (fosfato de sódio monobásico anidro, 120 g / mol). </li><li> Prepare seis tu padrãobes. Normas devem conter 0,0 mL, 50 mL (0,0325 μmoles), 100 L (0,065 μmoles), 175 mL (0,114 μmoles), 250 mL (0,163 μmoles), ou 350 mL (0,228 μmoles) de solução de fósforo. </li><li> Prepare LUV tubos de amostra em triplicata. Cada tubo de amostra deve conter cerca de 0,1 μmoles de luvs. Experimental e controle LUV concentrações devem ser medidas separadamente. </li><li> Para corrigir os sais de fósforo secas no pó inibidor Bowman-Birk, um controle LUV em branco deve ser preparado. O espaço em branco deve conter o mesmo volume do 0,2 mM mM trypsin/2.0 solução inibidor Bowman-Birk como foi colocado no controle LUV tubo de amostra. </li><li> ML lugar 450 de 8,9 NH 2 SO 4 em cada uma das amostras, padrão e tubos em branco. </li><li> Amostras de calor, padrões e espaços em branco por 25 minutos a 175-210 ° C em um forno. </li><li> Remova todos os tubos e deixe esfriar. Adicionar 150 mL de 30% H 2 O 2 a cada um dos tubes. </li><li> Amostras de calor, padrões e espaços em branco durante 30 minutos a 175-210 ° C. </li><li> Remove as amostras, padrões e espaços em branco do calor. Se qualquer uma das soluções ainda não são incolor, adicionar 50 mL H 2 O 2 a todos os tubos e calor por mais 15 minutos a 175-210 ° C. </li><li> Adicionar 3,9 mL NanoPure H 2 O, 0,5 mL de solução de molibdato de amônio e 0,5 mL de solução de ácido ascórbico para cada tubo. </li><li> Todos os tubos de calor por 5-7 minutos em um banho de água fervente. </li><li> Medir a absorvância de cada padrão e amostra em 820 nm usando um espectrofotômetro Agilent 8453 UV-Visível. O tubo contendo 0,0 mmoles de fósforo deve ser usado como o espaço em branco para todos os padrões e experimental LUV amostras. O tubo contendo o 0,2 mM mM trypsin/2.0 solução inibidor Bowman-Birk deve ser usado como o espaço em branco para o controle LUV amostra. </li><li> A absorbância linear vs fósforo curva padrão de conteúdo podem ser produzidos e utilizados para calcular o total de phosphOrus conteúdo e LUV concentração das amostras. </li></ol> 3. Preparando Solutions Peptide <ol><li> Dissolver peptídeo em NanoPure H 2 O. Peptídeos usados ​​neste ensaio, como descrito deve conter um resíduo de triptofano. </li><li> Medir a absorvância da solução em 282 nm peptídeo em triplicata. Calcular a concentração de peptídeos usando o coeficiente de extinção molar de triptofano de 5700 M -1 cm -1. </li><li> Dilua em água peptídeo NanoPure a uma concentração final de 30 mM. Armazenar a -20 ° C </li></ol> 4. Quantificação de translocação <ol><li> Preparar amostras experimental e controle em 1,7 mL tubos de microcentrífuga. Adicionar luvs suficiente para cada solução para uma concentração final de 250 mM. Adicionar o suficiente Bowman-Birk solução inibidora de modo que é inibidor de uma concentração final de 10X superior à concentração de tripsina. Adicionar o suficiente 10 mM tampão HEPES para trazer o volume de solução final para 450 mL. </li> &lt;li&gt; Coloque 50 mL de solução de peptídeo em uma célula fluorímetro Starna micro quartzo. A relação entre luvs e peptídeo é alta o suficiente para garantir que praticamente todos os peptídeos intactos são próximas o bastante para um grupo dansyl para dar um sinal FRET mesmo que nenhum deles translocado na vesícula. Isto é consistente com o semelhante FRET observado em condições de controle de peptídeos que fazem e não translocate em vesículas. </li><li> Adicionar a amostra experimental ou de controle para a solução de peptídeo na cuvete. Isso deve reduzir a concentração de peptídeo final, a 3 mM. </li><li> Iniciar um 25 minutos de cinética fluorescentes imediatamente após a adição de experimental ou controle LUV solução, tendo uma leitura de fluorescência pelo menos uma vez por segundo. Definir o comprimento de onda de excitação a 280 nm, o comprimento de onda de emissão a 525 nm, ea temperatura a 25 ° C. Usando um Cary Eclipse Espectrofotômetro de Fluorescência, vamos definir a sensibilidade PMT para alta. </li></ol><html> 5. Gerando um Índice de Translocação Quantitative <ol><li> Definir a fluorescência inicial (F o) como a leitura de fluorescência após quinze segundos de coleta de dados. Em nossa configuração do instrumento, nós descobrimos que os primeiros quinze segundos de dados de fluorescência coletados não são confiáveis ​​devido à mistura, fechando a câmara de amostra, e outras perturbações do sistema após a adição da amostra. Divida cada leitura subseqüente por F o de obter fluorescência relativa (F / F 0) em cada momento. </li><li> Média de todas as leituras relativa de fluorescência de último minuto do experimento para obter uma média final de fluorescência relativa <img alt="[F / Fo] avg" src="/files/ftp_upload/3571/3571eq1.jpg" /> . </li><li> Divida o <img alt="[F / Fo] avg" src="/files/ftp_upload/3571/3571eq1.jpg" /> para amostras de controle pelos <img alt="[F / Fo] avg" src="/files/ftp_upload/3571/3571eq1.jpg" /> para amostras experimentais para obter um valor final corrigido fluorescência. </li></ol>le &quot;&gt; 6. Resultados Representante A Figura 2 mostra os resultados deste ensaio para um peptídeo representante que mostraram translocação robusto. O sinal neste experimento (preto traço) mostra uma queda acentuada no FRET sinal ao longo do tempo. No entanto, é importante para controlar a potencial perda de sinal FRET devido à inibição de tripsina incompleta ou outros fatores não relacionados à capacidade de translocação. Para este fim, nós sempre também medir o FRET sinal entre peptídeos e luvs contendo tanto tripsina Bowman-Birk e inibidor de tripsina (cinza traço, Figura 2). Em nossas mãos, tem sido importante a realização desse controle para cada peptídeo cada vez que um experimento é executado. Isto permite-nos claramente correta para quaisquer alterações no sinal devido a eventuais diferenças entre preparações lipídicas vesícula ou ruído do instrumento, que pode ser significativa para os sinais relativamente fracos fluorescentes normalmente observadas nas concentrações. A importância do controle de expeexperiencia usando luvs contendo inibidor de tripsina é destacada pelos dados mostrados na Figura 3. Neste caso, o sinal peptídeo diminuíram um valor semelhante ao da Figura 2 na amostra experimental (traço preto). No entanto, a amostra de controle mostra uma queda mais rápida para esse peptídeo, por isso sua translocação líquida é menor. Ponto 5 do nosso protocolo descreve um método simples para quantificar a translocação deste experimento. Índices mais elevados são indicativos de translocação de peptídeos que translocar eficientemente; a razão para a translocação de peptídeos célula penetrante mostrado na Figura 2, é de 1,16, enquanto fracamente peptídeos translocação têm relações translocação mais próximo de 1. Em nossa experiência, o erro padrão de três experimentos independentes realizados com preparações diferentes vesícula está na faixa de 0,01 a 0,06. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3571/3571fig1.jpg" /> Figura 1. Esquemática de translocation ensaio. LUV Experimental amostras (A) são dopados com fluorescentes PAPA dansyl (barras pretas) e contêm encapsulado tripsina (tesouras). Inibidor de tripsina (círculo vermelho) é usado para inibir tripsina fora do luvs. O luvs estão expostos a peptídeo (roxo). Peptídeo associação com LUV membranas produz um sinal FRET (verde), que diminui à medida que os peptídeos translocting encontro tripsina interna desinibida. Ambos tripsina e inibidor de tripsina são encapsulados no controle LUV amostras (B) para medir a diminuição do sinal FRET alheios a translocação. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3571/3571fig2.jpg" /> Figura 2. Dados representativos para um peptídeo de células-penetrante. Um representante translocação pepide antimicrobiana mostra uma queda significativa na FRET sinal em comparação com o seu controle. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3571/3571fig3.jpg" /> Figura3. Dados representativos destacando a importância do controle. Inibição incompleta da digestão tríptica de um peptídeo não-translocação leva a uma queda na FRET sinal ao longo do tempo, tanto experimental e controle LUV soluções. Porque a diferença entre o controle e traços experimentais é relativamente pequeno, o mutante é caracterizado como um peptídeo fracamente translocação.

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Não há conflitos de interesse declarados.

O protocolo aqui apresentadas podem ser usados ​​para avaliar a mudança relativa na concentração de peptídeos dentro e fora de vesículas lipídicas. Estas mudanças estão relacionadas à capacidade de translocação. Este protocolo pode ser usado para identificar células-penetrante peptídeos com potencial como vetores de entrega de drogas. Como o interesse na célula-penetrantes peptídeos cresce, ela vai ser interessante ver como os métodos que medem diretamente o evento de translocação são desenvolvida...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> 16:00-18:01 PG </td><td> Lipídeos Avanti Polar </td><td> 840457C </td></tr><tr><td> 01:18 dansyl PE </td><td> Lipídeos Avanti Polar </td><td> 810330C </td></tr><tr><td> 16:00-18:01 PC </td><td> Lipídeos Avanti Polar </td><td> 850457C </td></tr><tr><td> Tripsina suína </td><td> Sigma </td><td> T-0303 </td></tr><tr><td> Bowman-Birk tripsina / quimotripsina inibidor </td><td> Sigma </td><td> T-9777 </td></tr><tr><td> Mini-extrusora </td><td> Lipídeos Avanti Polar </td><td> 610000 </td></tr><tr><td> Molibdato de amônio (para) </td><td> Alfa Aesar </td><td> 10811 </td></tr><tr><td> L-ácido ascórbico </td><td> Sigma </td><td> A1417 </td></tr><tr><td> Peróxido de Hidrogênio, solução 30% </td><td> Mallinckrodt produtos químicos </td><td> 5240-05 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H-3375 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma </td><td> S-9625 &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> E5134 </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> Sigma </td><td> S-0751 </td></tr></tbody></table>

measuring peptide translocation into large unilamellar vesicles

Há um interesse ativo em peptídeos que atravessam facilmente as membranas celulares sem a ajuda de receptores de membrana celular 1. Muitos destes são referidos como célula-penetrantes peptídeos, que são frequentemente conhecida por seu potencial como vetores de entrega de drogas 1-3. Além disso, há interesse crescente em peptídeos antimicrobianos, que funcionam através da membrana não-lítica mecanismos de 4,5, particularmente aqueles que atravessam as membranas bacterianas sem causar lise celular e matar as células, interferindo com processos intracelulares 6,7. De fato, os autores têm apontado cada vez mais o relacionamento entre peptídeos célula-penetrantes e antimicrobianos 1,8. Um firme entendimento do processo de translocação da membrana e da relação entre estrutura de peptídeo e sua capacidade de translocar requer eficaz, reprodutível para ensaios de translocação. Diversos grupos têm proposto métodos para medir a translocação para unilamel grandeslar vesículas lipídicas (luvs) 9-13. Luvs servir como modelos úteis para as membranas celulares bacterianas e eucarióticas e são freqüentemente usados ​​em estudos de peptídeos fluorescentes 14,15. Aqui, descrevemos a nossa aplicação do primeiro método desenvolvido por Matsuzaki e colegas de trabalho a considerar peptídeos antimicrobianos, tais como magainin e II buforin 16,17. Além de fornecer o nosso protocolo para este método, apresentamos também uma abordagem simples para análise de dados que quantifica a capacidade de translocação com este ensaio. As vantagens deste ensaio translocação em relação aos outros é que ela tem o potencial para fornecer informações sobre a taxa de translocação de membrana e não requer a adição de uma etiqueta fluorescente, o que pode alterar as propriedades do peptídeo 18, a triptofano contendo peptídeos. Resumidamente, a capacidade de translocação em vesículas de lipídios é medido como uma função da Transferência de Energia Ressonância Foster (FRET) entre resíduos de triptofano nativas e dansyl fosfatidiletanolamina quando as proteínas estão associadas com a membrana externa LUV (Figura 1). Célula-penetrantes peptídeos são clivadas como eles encontram tripsina desinibida encapsulados com o luvs, levando a dissociação da membrana LUV e uma queda na FRET sinal. A queda na FRET sinal observado por um peptídeo translocação é significativamente maior do que a observada para o peptídeo mesmo quando o luvs contêm tanto tripsina e inibidor de tripsina, ou quando um peptídeo que não espontaneamente atravessar membranas lipídicas é exposto a tripsina contendo luvs. Esta mudança de fluorescência fornece uma quantificação direta de translocação de peptídeos ao longo do tempo.

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Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

Este protocolo de detalhes um método para a medida quantitativa da translocação de peptídeos em grandes vesículas lipídicas unilamelares. Este método também fornece informações sobre a taxa de translocação de membrana e pode ser usado para identificar peptídeos que de forma eficiente e espontânea cruz bicamadas lipídicas.

Medição Translocação Peptide em grandes vesículas Unilamelares

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1.  Many of these are referred ...

measuring-peptide-translocation-into-large-unilamellar-vesicles

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JoVE Journal

Biology

13.8K visualizações.  Wellesley College. Este protocolo de detalhes um método para a medida quantitativa da translocação de peptídeos em grandes vesículas lipídicas unilamelares. Este método também fornece informações sobre a taxa de translocação de membrana e pode ser usado para identificar peptídeos que de forma eficiente e espontânea cruz bicamadas lipídicas.

Vídeo: Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation. Generating a streamlined procedure for creating and screening metagenomic libraries is therefore useful for efficient high-throughput investigations into the genetic and metabolic properties of uncultured microbial assemblages. Here, key protocols are presented on video, which we propose is the most useful format for accurately describing a long process that alternately depends on robotic instrumentation and (human) manual interventions. First, we employed robotics to spot library clones onto high-density macroarray membranes, each of which can contain duplicate colonies from twenty-four 384-well library plates. Automation is essential for this procedure not only for accuracy and speed, but also due to the miniaturization of scale required to fit the large number of library clones into highly dense spatial arrangements. Once generated, we next demonstrated how the macroarray membranes can be screened for genes of interest using modified versions of standard protocols for probe labeling, membrane hybridization, and signal detection. We complemented the visual demonstration of these procedures with detailed written descriptions of the steps involved and the materials required, all of which are available online alongside the video.

Grande Escala Telas de Bibliotecas metagenomic

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

Biologia

Large Insert Environmental Genomic Library Production

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent environmental genomic (i.e. metagenomic) approaches have emerged, enabling researchers to bridge this cultivation gap by capturing the genetic content of indigenous microbial communities directly from the environment. To this end, genomic DNA libraries are constructed using standard albeit artful laboratory cloning techniques. Here we describe the construction of a large insert environmental genomic fosmid library with DNA derived from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord. This protocol is directly linked to a series of connected protocols including coastal marine water sampling [1], large volume filtration of microbial biomass [2] and a DNA extraction and purification protocol [3]. At the outset, high quality genomic DNA is end-repaired with the creation of 5 -phosphorylated blunt ends. End-repaired DNA is subjected to pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) for size selection and gel extraction is performed to recover DNA fragments between 30 and 60 thousand base pairs (Kb) in length. Size selected DNA is purified away from the PFGE gel matrix and ligated to the phosphatase-treated blunt-end fosmid CopyControl vector pCC1 (EPICENTRE <a href="http://www.epibio.com/item.asp?ID=385">http://www.epibio.com/item.asp?ID=385</a>). Linear concatemers of pCC1 and insert DNA are subsequently headfull packaged into phage particles by lambda terminase, with subsequent infection of phage-resistant E. coli cells. Successfully transduced clones are recovered on LB agar plates under antibiotic selection and archived in 384-well plate format using an automated colony picking robot (Qpix2, GENETIX). The current protocol draws from various sources including the CopyControl Fosmid Library Production Kit from EPICENTRE and the published works of multiple research groups [4-7]. Each step is presented with best practice in mind. Whenever possible we highlight subtleties in execution to improve overall quality and efficiency of library production. The whole process of fosmid library production and automated colony picking takes at least 7-10 days as there are many incubation steps included. However, there are several stopping points possible which are mentioned within the protocol.

Construction of a fosmid library with environmental genomic DNA isolated from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord is described. The resulting clone library is picked into 384-well plates and archived for downstream sequencing and functional screening by the application of an automated colony picking system.

Grandes Inserir Produção Ambiental Biblioteca Genômica

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagênese e Análise Funcional de canais iônicos Heterologously Expresso em células de mamíferos

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

Medição quantitativa do GLUT4 translocação para a membrana plasmática por citometria de fluxo

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic development 1, 2. One of the signaling pathways involved in this regulation is the Wnt pathway, which is used many times during embryogenesis and critical for human disease3, 4, 5. Multiple molecular components of this pathway coordinately regulate signaling in a spatially-restricted manner, but the underlying mechanisms are not fully understood. Xenopus embryonic epithelial cells is an excellent system to study subcellular localization of various signaling proteins. Fluorescent fusion proteins are expressed in Xenopus embryos by RNA microinjection, ectodermal explants are prepared and protein localization is evaluated by epifluorescence. In this experimental protocol we describe how subcellular localization of Diversin, a cytoplasmic protein that has been implicated in signaling and cell polarity determination6, 7 is visualized in Xenopus ectodermal cells to study Wnt signal transduction8. Coexpression of a Wnt ligand or a Frizzled receptor alters the distribution of Diversin fused with red fluorescent protein, RFP, and recruits it to the cell membrane in a polarized fashion 8, 9. This ex vivo protocol should be a useful addition to in vitro studies of cultured mammalian cells, in which spatial control of signaling differs from that of the intact tissue and is much more difficult to analyze.

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Xenopus embryonic ectoderm has become an attractive model for studies of cell polarity. An assay is described, in which subcellular distribution of fluorescent proteins is assessed in ectoderm cells. This protocol will help address questions related to spatial control of signaling.

Translocação polarizada de proteínas fluorescentes em Xenopus Ectodérmicas em resposta à sinalização Wnt

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic ...

Examining BCL-2 Family Function with Large Unilamellar Vesicles

The BCL-2 (B cell CLL/Lymphoma) family is comprised of approximately twenty proteins that collaborate to either maintain cell survival or initiate apoptosis1. Following cellular stress (e.g., DNA damage), the pro-apoptotic BCL-2 family effectors BAK (BCL-2 antagonistic killer 1) and/or BAX (BCL-2 associated X protein) become activated and compromise the integrity of the outer mitochondrial membrane (OMM), though the process referred to as mitochondrial outer membrane permeabilization (MOMP)1. After MOMP occurs, pro-apoptotic proteins (e.g., cytochrome c) gain access to the cytoplasm, promote caspase activation, and apoptosis rapidly ensues2.
In order for BAK/BAX to induce MOMP, they require transient interactions with members of another pro-apoptotic subset of the BCL-2 family, the BCL-2 homology domain 3 (BH3)-only proteins, such as BID (BH3-interacting domain agonist)3-6. Anti-apoptotic BCL-2 family proteins (e.g., BCL-2 related gene, long isoform, BCL-xL; myeloid cell leukemia 1, MCL-1) regulate cellular survival by tightly controlling the interactions between BAK/BAX and the BH3-only proteins capable of directly inducing BAK/BAX activation7,8. In addition, anti-apoptotic BCL-2 protein availability is also dictated by sensitizer/de-repressor BH3-only proteins, such as BAD (BCL-2 antagonist of cell death) or PUMA (p53 upregulated modulator of apoptosis), which bind and inhibit anti-apoptotic members7,9. As most of the anti-apoptotic BCL-2 repertoire is localized to the OMM, the cellular decision to maintain survival or induce MOMP is dictated by multiple BCL-2 family interactions at this membrane.
 Large unilamellar vesicles (LUVs) are a biochemical model to explore relationships between BCL-2 family interactions and membrane permeabilization10. LUVs are comprised of defined lipids that are assembled in ratios identified in lipid composition studies from solvent extracted Xenopus mitochondria (46.5% phosphatidylcholine, 28.5% phosphatidylethanoloamine, 9% phosphatidylinositol, 9% phosphatidylserine, and 7% cardiolipin)10. This is a convenient model system to directly explore BCL-2 family function because the protein and lipid components are completely defined and tractable, which is not always the case with primary mitochondria. While cardiolipin is not usually this high throughout the OMM, this model does faithfully mimic the OMM to promote BCL-2 family function. Furthermore, a more recent modification of the above protocol allows for kinetic analyses of protein interactions and real-time measurements of membrane permeabilization, which is based on LUVs containing a polyanionic dye (ANTS: 8-aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic acid) and cationic quencher (DPX: p-xylene-bis-pyridinium bromide)11. As the LUVs permeabilize, ANTS and DPX diffuse apart, and a gain in fluorescence is detected. Here, commonly used recombinant BCL-2 family protein combinations and controls using the LUVs containing ANTS/DPX are described.

Biochemically-defined large unilamellar vesicles (LUVs) are a convenient model system to analyze BCL-2 family interactions with immediate implications in better understanding the mitochondrial pathway of apoptosis. A method to produce LUVs, along with standard BCL-2 family protein combinations and controls to examine LUV permeabilization, are presented.

Examinando BCL-2 Função Família com grandes vesículas unilamelares

The BCL-2 (B cell CLL/Lymphoma) family is comprised of approximately twenty proteins that collaborate to either maintain cell survival or initiate ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow GUVs must be modified in order to form GUVs containing functional transmembrane proteins. This article describes two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation and gel-assisted swelling &#8212; to form GUVs containing the voltage-gated potassium channel, KvAP. In both methods, a solution of protein-containing small unilamellar vesicles is partially dehydrated to form a stack of membranes, which is then allowed to swell in a rehydration buffer. For the electroformation method, the film is deposited on platinum electrodes so that an AC field can be applied during film rehydration. In contrast, the gel-assisted swelling method uses an agarose gel substrate to enhance film rehydration. Both methods can produce GUVs in low (e.g., 5 mM) and physiological (e.g., 100 mM) salt concentrations. The resulting GUVs are characterized via fluorescence microscopy, and the function of reconstituted channels measured using the inside-out patch-clamp configuration. While swelling in the presence of an alternating electric field (electroformation) gives a high yield of defect-free GUVs, the gel-assisted swelling method produces a more homogeneous protein distribution and requires no special equipment.

The reconstitution of the transmembrane protein, KvAP, into giant unilamellar vesicles (GUVs) is demonstrated for two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation, and gel-assisted swelling. In both methods, small unilamellar vesicles containing the protein are fused together to form GUVs that can then be studied by fluorescence microscopy and patch-clamp electrophysiology.

Reconstituição de uma proteína transmembrana, a voltagem-Ion Channel, KvAP, em Gigante Unilamelares Vesicles para microscopia e de Patch Estudos Grampo

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating interactions between DNA and its binding proteins. Here, we report a method that uses fluorescent microscopy for visualizing large DNA molecules tethered on the surface. First, glass coverslips are biotinylated and passivated by coating with biotinylated polyethylene glycol, which specifically binds biotinylated DNA via avidin protein linkers and significantly reduces undesirable binding from non-specific interactions of proteins or DNA molecules on the surface. Second, the DNA molecules are biotinylated by two different methods depending on their terminals. The blunt ended DNA is tagged with biotinylated dUTP at its 3' hydroxyl terminus, by terminal transferase, while the sticky ended DNA is hybridized with biotinylated complimentary oligonucleotides by DNA ligase. Finally, a microfluidic shear flow makes single DNA molecules stretch to their full contour lengths after being stained with fluorescent protein-DNA binding peptide (FP-DBP).

We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows.

A visualização de tethered-grande superfície moléculas de ADN com um ADN de proteína fluorescente Binding Peptide

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating ...

Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many different proteins associate with curved membranes because of their ability to sense or induce membrane curvature. Typically, these processes involve a multitude of proteins making them too complex to study quantitatively in the cell. We describe a protocol to reconstitute a curved membrane in vitro, mimicking a curved cellular structure, such as the endocytic neck. A giant unilamellar vesicle (GUV) is used as a model of a cell membrane, whose internal pressure and surface tension are controlled with micropipette aspiration. Applying a point pulling force on the GUV using optical tweezers creates a nanotube of high curvature connected to a flat membrane. This method has traditionally been used to measure the fundamental mechanical properties of lipid membranes, such as bending rigidity. In recent years, it has been expanded to study how proteins interact with membrane curvature and the way they affect the shape and the mechanics of membranes. A system combining micromanipulation, microinjection, optical tweezers, and confocal microscopy allows measurement of membrane curvature, membrane tension, and the surface density of proteins, concurrently. From these measurements, many important mechanical and morphological properties of the protein-membrane system can be inferred. In addition, we lay out a protocol of creating GUVs in the presence of physiological salt concentration, and a method of quantifying the surface density of proteins on the membrane from fluorescence intensities of labeled proteins and lipids.

Many proteins in the cell sense and induce membrane curvature. We describe a method to pull membrane nanotubes from lipid vesicles to study the interaction of proteins or any curvature-active molecule with curved membranes in vitro.

Puxando a membrana nanotubos de vesículas Unilamellar gigante

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, which leads to subsequent degeneration of vital retinal structures (e.g., photoreceptors) causing severe vision impairment. Similarly, RPE-loss and decrease in visual acuity is seen in long-term follow up of patients with advanced wet age-related macular degeneration (AMD) receiving intravitreal anti-vascular endothelial growth factor (VEGF) treatment. Therefore, on the one hand, it is fundamental to efficiently derive RPE cells from an unlimited source that could serve as replacement therapy. On the other hand, it is important to assess the behavior and integration of the derived cells in a model of the disease entailing surgical and imaging methods as close as possible to those applied in humans. Here, we provide a detailed protocol based on our previous publications that describes the generation of a preclinical model of GA using the albino rabbit eye, for evaluation of the human embryonic stem cell derived retinal pigment epithelial cells (hESC-RPE) in a clinically relevant setting. Differentiated hESC-RPE are transplanted into naive eyes or eyes with NaIO3-induced GA-like retinal degeneration using a 25 G transvitreal pars plana technique. Evaluation of degenerated and transplanted areas is performed by multimodal high-resolution non-invasive real-time imaging.

Retinal pigment epithelial cells could serve as a cell-replacement therapy for the advanced form of dry age-related macular degeneration. This protocol describes the generation of a large-eyed model of geographic atrophy and the subretinal transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells into this model of disease.

Subretinal transplante de células epiteliais de pigmento retinal derivado de células-tronco embrionárias humanas em um modelo de grandes olhos de atrofia geográfica

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, ...