저자는 원고의 비판적 검토에 대한 에밀리 호세에게 감사드립니다. 이 작품은 재단 "라 리그 콘트레 르 암", "퐁디아크 부어 라 레체쉬 쉬르 르 암", 그리고 "센터 국립 드 라 레체쉬 사이엔티피크"(CNRS)에 의해 지원되었다.

1. 대형 유니라멜라 소포 준비 (LUV)
<ol><li>형광 누출 분석에 대 한 모방 세포 막으로 그들의 사용에 대 한 LUV를 준비.</li>
	<li>해밀턴 유리 주사기 인스파디딜콜린(DOPC, 786.11 g/mol), 스핑크고미엘린(SM, 760.22 g/mol) 및 콜레스테롤(철, 386.65 g/mol)과 함께 4:4:2의 어금니비와 섞는다. 지질용 액액은 메탄올/클로로폼(3/1; 부피/부피)에서 25mL 유리 원형 플라스크에서 25 mg/mL의 용매로 용해된 각 지질의 스톡 용액으로부터 얻어진다. DOPC의 4μmol, SM의 4 μmol, 2 μmol, 철의 2 μmol를 기준으로, 지질 용액은 각각 126 μL, 117 μL 및 31 μL을 혼합하여 스톡 용액에서 얻어진다. 주의: 메탄올은 독성 및 인화성 용매이며 클로로폼은 독성및 발암성입니다. 둘 다 후드 아래에서 적절한 보호 기능을 처리해야 합니다.</li>
	<li>건조지질막이 형성될 때까지 60°C에서 45-60분 동안 진공 하에서 회전 증발기하에서 메탄올/클로로포형을 증발시킵니다.</li>
	<li>두 개의 주식 HEPES 버퍼 솔루션을 준비합니다. 20m HEPES(238.3g/mol)와 75m MM NaCl(58.44g/mol)을 혼합하여 HEPES 버퍼 1을 준비하고 pH를 7.4로 조정합니다. 20m HEPES 및 145m NaCl을 혼합하여 HEPES 버퍼 2를 준비하고 pH를 7.4로 조정합니다. HEPES 버퍼는 1개월 동안 4°C로 저장할 수 있습니다. 참고: 진동계를 사용하여 버퍼의 진동을 확인하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>막 불투과성 형광염염수 커플을 용해시켜 지질 수분 공급 용액을 준비하고, 8-aminonaphthalene-1, 3, 6-trisulfonic 산, 디나트륨 소금 12.5 mM (개미, 427.33 g/mol) 및 P 자일렌 바이스파이리디늄 브로마이드 45 mM (DPX, 422.16 g/mol) HEPES 완충액용. 개미와 DPX를 혼합하면 노란색 용액이 나타납니다. 12.5mM의 ANTS와 45mM의 농도를 달성하기 위해, HEPES 버퍼 1의 4mL에서 각각 21.4 mg 및 76 mg을 용해한다. 참고: 지질 수분 용액은 튜브를 알루미늄 호일로 래핑하여 4°C에서 2주 동안 보관할 수 있습니다.</li>
	<li>지질 수분 공급 액액의 1mL로 건조지질필름을 재보습하고 건조지질필름의 용해될 때까지 소용돌이를 통해 다발성지질제(MLV)를 재구성한다. 작은 지질 응집체가 이전 단계에 부정적인 영향을 미치므로 용액이 완전히 용해되었는지 확인합니다. 또한 유리 원형 플라스크의 벽을 확인하여 남은 지질 필름이 없는지 확인하십시오. 참고: 용해도 가루 후 용액이 오팔레스센트와 밝은 노란색으로 나타납니다.</li>
	<li>단알라멜라 소포를 얻기 위해 5개의 동결/해동 사이클로 소포를 가치. 유리 원형 바닥 플라스크를 액체 질소에 30초 동안 넣고 해동 스텝을 위해 2분 동안 수조에 방치하여 각 주기를 수행합니다. 참고: 목욕물의 온도는 지질의 용융 온도보다 5-10°C 높아야 합니다.</li>
	<li>금속 압출기 캐니스터에 배치된 각 폴리테트라플루오로로틸렌(PTFE) 압출기 조각에 HEPES 버퍼로 예비 가습을 지원하는 2개의 필터를 삽입하여 지질 압출기 준비.</li>
	<li>HEPES 가습 폴리카보네이트 멤브레인(0.1 μm 모공 크기, 직경 25mm)을 하나의 필터 지지대 위에 놓습니다.</li>
	<li>두 개의 금속 압출기 캐니스터를 조립하고 나사.</li>
	<li>조립된 압출자를 홀더에 놓고 각 폴리테트라플루오로틸렌 압출기 조각의 사지에 적절한 구멍에 1mL 주사기를 넣습니다. 압출은 폴리카보네이트 멤브레인을 통해 한 주사기에서 다른 주사기로 테스트된 액체의 통과에 해당한다.</li>
	<li>압출기를 1mL 주사기 중 하나에 로드한 HEPES 버퍼 1mL로 압출기를 테스트하여 누출이나 문제가 발생하지 않도록 합니다.</li>
	<li>1mL HEPES 버퍼를 MLV 샘플로 바꿉니까.</li>
	<li>동일한 크기의 균일한 LUV를 얻기 위해 적어도 21회 폴리카보네이트 멤브레인을 통해 한 주사기에서 다른 주사기에서 다른 주사기로 MLV 샘플을 전달하여 압출을 수행합니다. 참고: 압출은 지질 혼합물의 용융 온도보다 높은 온도에서 수행되어야 합니다.</li>
</ol>2. 루브의 정화
<ol><li>캡슐화되지 않은 개미및 DPX 초과를 제거하기 위해 컬럼 정화를 준비합니다.</li>
	<li>액체 크로마토그래피 컬럼(Luer Lock, Non-jacketed, 1.0cm x 20cm, 침대 볼륨 16mL)에서 0.01% NaN 3(65g/mol)로 수성 배지에서 재장매된 크로스 링크 덱스펜 젤(G-50)을 열의 무색 부분의 상단 아래 1cm까지 소개합니다.</li>
	<li>탭을 열고 액체 흐름이 교차 연결된 dextran 젤을 해결하도록 합니다.</li>
	<li>HEPES 버퍼 2의 20mL로 용례하여 컬럼을 세척하고 열의 출력 흐름을 폐기합니다.</li>
	<li>열 위의 용매의 죽은 부피가 최소화되면 탭을 닫지만(<100 μL) 교차 연결된 dextran 젤의 건조를 피하기에 충분합니다.</li>
	<li>새로 압출된 LUV(노란색)를 기둥에 놓고 교차 연결된 덱스펜 젤에 들어갑니다.</li>
	<li>LUV 정제를 수행하기 위해 지속적으로 열에 HEPES 버퍼 2를 추가합니다.</li>
	<li>ELute 약 2 mL의 HEPES 버퍼 2 (정기적으로 교차 연결된 dextran 젤 건조를 피하기 위해 컬럼의 상단을 채우는 것을 잊지 마세요): 무료 노란색 ANTS 및 DPX 용액은 리포솜보다 느리게 마이그레이션됩니다.</li>
	<li>튜브(1.5mL)에서 정제된 LUV를 수집하기 시작합니다.</li>
	<li>기둥에서 용출방울을 관찰하고 오팔레인이 될 때, 그들은 리포솜을 포함합니다. 튜브를 변경하여 LUV 함유 분수를 복구합니다.</li>
	<li>방울이 더 이상 오팔레이트(~1mL)가 될 때까지 엘루트. 그 후, 별도의 분획에 또 다른 0.5 mL을 엘테한 다음 발례를 중지합니다. 참고: 표준은 이제 LUV의 용출 량을 보정하기 위해 키트 또는 개별 분자량으로 광범위한 분자량에서 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>형광 염료의 표백을 피하기 위해 알루미늄 호일에 LUV로 튜브를 감쌉니까.</li>
	<li>20mL HEPES 버퍼 2로 컬럼을 세척합니다.</li>
	<li>그런 다음 LUV를 4°C에서 일주일 동안 저장할 수 있습니다. 참고: LUV 안정성은 LUV 농도 및 컴포지션뿐만 아니라 이온 강도에 따라 달라질 수 있기 때문에 동적 광 산란(DLS) 계측기(섹션 4 참조)를 사용하여 LUV의 크기를 제어해야 합니다. 각 테스트 전에 LUV 크기 및 균질성의 특성화.</li>
</ol>3. LUV의 농도 를 정량화
<ol><li>콜린농도(19)의평가를 가능하게 하는 인지질 정량화 키트에 의한 LUV 농도추정. 이 분석법은 극지 헤드를 포함하는 콜린을 가진 인지질이 상당할 때 적용될 수 있습니다 (>50% LUV의).</li>
	<li>제공된 완충제의 3mL에서 염색체 기판 18 mg을 용해하여 색 시약을 준비합니다.</li>
	<li>폴리스티렌 큐벳, 10 x 10 x 45mm, 3mL의 컬러 시약을 로드합니다.</li>
	<li>순수한 색상 시약을 빈 상태(공백)로 사용합니다. 알려진 콜린 농도(표준)의 표준 용액의 LUV 샘플(Test) 또는 20 μL의 20 μL을 추가합니다.</li>
	<li>잘 섞고 37 °C에서 5 분 동안 배양하십시오 모든 조건 (공백, 테스트 및 표준).</li>
	<li>스펙트로포토미터를 사용하여 600 nm의 제어로서 빈 용액을 사용하여 테스트 샘플 및 표준 용액의 흡광도(광학 밀도, OD)를 측정합니다.</li>
	<li>알려진 농도의 표준에 비해 콜린에 상응하는 LUV, C[LUV]의 지질 농도를 추정할 수 있는 OD 값을 확인합니다.</li>
	<li>다음 방정식을 사용하여 계산을 수행합니다. C[LUV] (mol/l) = (OD 샘플/OD 표준) x C[표준] (mol/l) 참고: 인지질 정량화 키트는 C[표준]= 3.87mmol/L. OD 샘플 및 OD 표준의 어금니 농도에 해당하는 54 mg/dL에서 콜린 염화물(139.6 mg/l) 표준 용액을 제공하였다.</li>
</ol>4. LUV 크기와 균일성의 특성화
<ol><li>LUV 크기(nm) 및 다분산 지수(PdI)를 결정하기 위해 DLS 계측기를 사용하여 측정을 수행합니다.</li>
	<li>용매/버퍼 및 사용된 큐벳의 점도를 표시하여 적절한 "표준 작동 절차"(SOP)를 프로그래밍합니다.</li>
	<li>폴리스티렌 세미 마이크로 큐벳에 LUV 용액의 500 μL을 배치합니다.</li>
	<li>폴리스티렌 세미 마이크로 큐벳을 DLS 기기에 삽입합니다.</li>
	<li>실온에서 입자 분포의 평균 크기(Z-평균) 및 균질성(다분산지수, PdI)의 크기 분포를 측정합니다.</li>
	<li>모든 결과는 세 번의 반복사이클에서 각각 수행되는 두 개의 독립적인 측정에서 얻어진다. 참고: LUV의 표준 값은 137± 7nm의 평균 크기로, PdI는 0.149 ± 0.041입니다.</li>
</ol>5. 펩타이드 솔루션 준비
<ol><li>누설 분석에 대해 분석해야 하는 펩타이드의 스톡 용액을 준비한다.</li>
	<li>퓨어 워터(예: 500 μL 순수 수의 1 mg 펩타이드)에 펩타이드 분말(>95% 순도)을 용해하십시오. 참고: 순수한 물에 펩티드를 희석시키고 디메틸 설옥화물(DMSO) 용용화를 방지하여 유물(예를 들어 막 과미빌라이징20)을유도하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>5s용 펩타이드 용액을 소용돌이시다.</li>
	<li>펩타이드 용액을 5분 간 초음파 처리한 다음 원심분리기는 12,225 x g에서5분 동안 초음파 처리합니다. 농도 측정을 위해 상체를 수집합니다.</li>
	<li>3개의 독립적인 펩티드 희석제의 280nm에서 흡광도를 측정한 다음, 어금니 소멸 계수 ε(펩티드 서열의 트립토판 및 티로신 함량에 따라 다름)과 비어-램버트 규칙을 사용하여 펩티드 농도를 계산한다. 참고: 펩타이드가 트립토판과 티로신을 포함하는 경우, 어금니 소멸 계수 ε 트립토판 ε 기초하여 계산됩니다 = 5,690 M-1cm-1cm 및 티로신 ε = 1,280 M-1cm-1. 펩티드 서열에 트립토판 또는 티로신이 포함되어 있지 않으면 다른 색분석 분석이 농도(예를 들어, BCA 또는 브래드포드)를 측정하기 위해 수행될 수 있다.</li>
	<li>펩티드 용액을 순수 한 물로 희석하여 100 μM의 최종 용액으로 희석하고 4 °C에 저장하십시오. 참고: 순수한 물에서는 4°C 저장 중에 펩티드 분해가 발생하지 않습니다. 그러나, 펩티드 농도는 물 증발이 발생하지 않도록 2주마다 측정되어야 한다.</li>
</ol>6. 형광 누출 분석
<ol><li>형광 누설 분석법은 실온에서 분광성계에서 측정됩니다. 흥분 및 방출 파장은 Ex = 360 nm ± 3 nm 및 Em = 530 nm ± 5 nm로 고정됩니다.</li>
	<li>1 mL HEPES 버퍼 2에서 석영 형광 큐벳에서 100 μM의 최종 농도로 LUV를 희석하십시오. 실험 중에 용액을 균질화하기 위해 자기 교반기를 추가합니다.</li>
	<li>배경 형광에 액세스하기 위해 t = 0 s와 t = 99 s 사이의 첫 100 s 동안 혼자 LUV를 측정합니다. 참고: 배경 형광 및 잠재적 누출에 액세스하기 위해 전체 실험(15분) 중에 LUV만 측정할 수 있습니다.</li>
	<li>그 후, 다음 900s(15분)에 대한 펩타이드 용액의 알리쿼트 첨가 시 형광 강도의 증가로 누설을 측정한다. 이 프로토콜은 0.1 μM에서 2.5 μM로 테스트된 펩티드의 각 농도에 대해 수행됩니다.</li>
	<li>마지막으로, 트리톤 X-100(0.1%, v/v)의 1μL을 추가하여 LUV를 용해시킴으로써 100% 형광을 달성하여 t = 1,000s 및 t = 1,100s 사이의 완전히 압축되지 않은 프로브를 생성하였다.</li>
</ol>7. 누출의 정량화
<ol><li>각 테스트된 조건에 대해 동일한 수의 점을 유지하기 위해 t = 1,090s 후에 얻은 값을 억제합니다.</li>
	<li>t = 0 s와 t = 49 s (혼자 LUV) 사이의 50 점의 평균을 만들어 최소한의 형광, Fmin을계산합니다.</li>
	<li>t = 1,041s와 t = 1,090 s (트리톤 X-100의 LUV) 사이의 평균 50 점을 만들어 최대 형광, F최대를계산합니다.</li>
	<li>다음 방정식에 따라 각 시점(t = x)에서 누설 비율(%누출)을 계산합니다. %누출(t =x) = (F(t = x) - F분) / (F최대 - F분)x 100</li>
	<li>동일한 조건에 대해 다른 LUV 준비(n ≥ 2)로 얻은 값의 평균 및 표준 편차를 계산합니다.</li>
	<li>누설 비율,%누설(t=x)시간 함수를 플롯합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Langel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Cell-Penetrating Peptides. , (2006).</li><li>Deshayes, S., Morris, M. C., Divita, G., Heitz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-penetrating+peptides:+tools+for+intracellular+delivery+of+therapeutics.">Cell-penetrating peptides: tools for intracellular delivery of therapeutics.</a> Cellular and Molecular Life Sciences CMLS. 62 (16), 1839-1849 (2005).</li><li>Richard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-penetrating+peptides.+A+reevaluation+of+the+mechanism+of+cellular+uptake.">Cell-penetrating peptides. A reevaluation of the mechanism of cellular uptake.</a> The Journal of Biological Chemistry. , (2003).</li><li>Jones, A., Sayers, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+entry+of+cell+penetrating+peptides:+tales+of+tails+wagging+dogs.">Cell entry of cell penetrating peptides: tales of tails wagging dogs.</a> Journal of Controlled Release Official Journal of the Controlled Release Society. , (2012).</li><li>T&#252;nnemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+analysis+of+cell+penetration+ability+and+toxicity+of+oligo-arginines.">Live-cell analysis of cell penetration ability and toxicity of oligo-arginines.</a> Journal of Peptide Science. 14 (4), 469-476 (2008).</li><li>Jiao, C. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+and+endocytosis+for+cell-penetrating+peptide+internalization.">Translocation and endocytosis for cell-penetrating peptide internalization.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (49), 33957-33965 (2009).</li><li>Deshayes, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+internalization+mechanism+of+WRAP:siRNA+nanoparticles.">Deciphering the internalization mechanism of WRAP:siRNA nanoparticles.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. Biomembranes. 1862 (6), 183252 (2020).</li><li>Konate, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimisation+of+vectorisation+property:+A+comparative+study+for+a+secondary+amphipathic+peptide.">Optimisation of vectorisation property: A comparative study for a secondary amphipathic peptide.</a> International Journal of Pharmaceutics. 509 (1-2), 71-84 (2016).</li><li>Lehto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+trafficking+determines+the+exon+skipping+activity+of+Pip6a-PMO+in+mdx+skeletal+and+cardiac+muscle+cells.">Cellular trafficking determines the exon skipping activity of Pip6a-PMO in mdx skeletal and cardiac muscle cells.</a> Nucleic Acids Research. 42 (5), 3207-3217 (2014).</li><li>Hoyer, J., Neundorf, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+vectors+for+the+nonviral+delivery+of+nucleic+acids.">Peptide vectors for the nonviral delivery of nucleic acids.</a> Accounts of Chemical Research. 45 (7), 1048-1056 (2012).</li><li>Milletti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-penetrating+peptides:+classes,+origin,+and+current+landscape.">Cell-penetrating peptides: classes, origin, and current landscape.</a> Drug Discovery Today. 17 (15-16), 850-860 (2012).</li><li>Mueller, J., Kretzschmar, I., Volkmer, R., Boisguerin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+cellular+uptake+using+22+CPPs+in+4+different+cell+lines.">Comparison of cellular uptake using 22 CPPs in 4 different cell lines.</a> Bioconjugate Chemistry. 19 (12), 2363-2374 (2008).</li><li>Ramaker, K., Henkel, M., Krause, T., R&#246;ckendorf, N., Frey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+penetrating+peptides:+a+comparative+transport+analysis+for+474+sequence+motifs.">Cell penetrating peptides: a comparative transport analysis for 474 sequence motifs.</a> Drug Delivery. 25 (1), 928-937 (2018).</li><li>Maget-Dana, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+monolayer+technique:+a+potent+tool+for+studying+the+interfacial+properties+of+antimicrobial+and+membrane-lytic+peptides+and+their+interactions+with+lipid+membranes.">The monolayer technique: a potent tool for studying the interfacial properties of antimicrobial and membrane-lytic peptides and their interactions with lipid membranes.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1462 (1-2), 109-140 (1999).</li><li>Alves, A. C., Ribeiro, D., Nunes, C., Reis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysics+in+cancer:+The+relevance+of+drug-membrane+interaction+studies.">Biophysics in cancer: The relevance of drug-membrane interaction studies.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1858 (9), 2231-2244 (2016).</li><li>Konate, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide-based+nanoparticles+to+rapidly+and+efficiently+"Wrap+'n+Roll"+siRNA+into+cells.">Peptide-based nanoparticles to rapidly and efficiently "Wrap 'n Roll" siRNA into cells.</a> Bioconjugate Chemistry. 30 (3), 592-603 (2019).</li><li>Seisel, Q., Pelletier, F., Deshayes, S., Boisguerin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+evaluate+the+cellular+uptake+of+CPPs+with+fluorescence+techniques:+Dissecting+methodological+pitfalls+associated+to+tryptophan-rich+peptides.">How to evaluate the cellular uptake of CPPs with fluorescence techniques: Dissecting methodological pitfalls associated to tryptophan-rich peptides.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. Biomembranes. 1861 (9), 1533-1545 (2019).</li><li>Derossi, D., Joliot, A. H., Chassaing, G., Prochiantz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+third+helix+of+the+Antennapedia+homeodomain+translocates+through+biological+membranes.">The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (14), 10444-10450 (1994).</li><li>Takayama, M., Itoh, S., Nagasaki, T., Tanimizu, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+enzymatic+method+for+determination+of+serum+choline-containing+phospholipids.">A new enzymatic method for determination of serum choline-containing phospholipids.</a> Clinica Chimica Acta; International Journal of Clinical Chemistry. 79 (1), 93-98 (1977).</li><li>Notman, R., Noro, M., O'Malley, B., Anwar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+for+Dimethylsulfoxide+(DMSO)+action+on+lipid+membranes.">Molecular basis for Dimethylsulfoxide (DMSO) action on lipid membranes.</a> Journal of the American Chemical Society. 128 (43), 13982-13983 (2006).</li><li>Konate, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insight+into+the+cellular+uptake+mechanism+of+a+secondary+amphipathic+cell-penetrating+peptide+for+siRNA+delivery.">Insight into the cellular uptake mechanism of a secondary amphipathic cell-penetrating peptide for siRNA delivery.</a> Biochemistry. 49 (16), 3393-3402 (2010).</li><li>Vaissi&#232;re, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+retro-inverso+cell-penetrating+peptide+for+siRNA+delivery.">A retro-inverso cell-penetrating peptide for siRNA delivery.</a> Journal of Nanobiotechnology. 15 (1), 34 (2017).</li><li>Eir&#237;ksd&#243;ttir, E., Konate, K., Langel, &. #. 2. 2. 0. ;., Divita, G., Deshayes, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secondary+structure+of+cell-penetrating+peptides+controls+membrane+interaction+and+insertion.">Secondary structure of cell-penetrating peptides controls membrane interaction and insertion.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1798 (6), 1119-1128 (2010).</li><li>Ziegler, A., Li Blatter, X., Seelig, A., Seelig, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+transduction+domains+of+HIV-1+and+SIV+TAT+interact+with+charged+lipid+vesicles.+Binding+mechanism+and+thermodynamic+analysis.">Protein transduction domains of HIV-1 and SIV TAT interact with charged lipid vesicles. Binding mechanism and thermodynamic analysis.</a> Biochemistry. 42 (30), 9185-9194 (2003).</li><li>Thor&#233;n, P. E. G., Persson, D., Karlsson, M., Nord&#233;n, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Antennapedia+peptide+penetratin+translocates+across+lipid+bilayers+-+the+first+direct+observation.">The Antennapedia peptide penetratin translocates across lipid bilayers - the first direct observation.</a> FEBS Letters. 482 (3), 265-268 (2000).</li><li>Mishra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+HIV+TAT+peptide+and+analogues+induced+by+multiplexed+membrane+and+cytoskeletal+interactions.">Translocation of HIV TAT peptide and analogues induced by multiplexed membrane and cytoskeletal interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (41), 16883-16888 (2011).</li><li>Rouser, G., Fleischer, S., Yamamoto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+dimensional+thin+layer+chromatographic+separation+of+polar+lipids+and+determination+of+phospholipids+by+phosphorus+analysis+of+spots.">Two dimensional thin layer chromatographic separation of polar lipids and determination of phospholipids by phosphorus analysis of spots.</a> Lipids. 5 (5), 494-496 (1970).</li><li>Bartlett, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorus+assay+in+column+chromatography.">Phosphorus assay in column chromatography.</a> Journal of Biological Chemistry. 234 (3), 466-468 (1959).</li><li>Stewart, J. C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+determination+of+phospholipids+with+ammonium+ferrothiocyanate.">Colorimetric determination of phospholipids with ammonium ferrothiocyanate.</a> Analytical Biochemistry. 104 (1), 10-14 (1980).</li><li>Spinella, S. A., Nelson, R. B., Elmore, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+peptide+translocation+into+large+unilamellar+vesicles.">Measuring peptide translocation into large unilamellar vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3571 (2012).</li><li>Wimley, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+effects+of+membrane-interacting+peptides+on+membrane+integrity.">Determining the effects of membrane-interacting peptides on membrane integrity.</a> Cell-Penetrating Peptides. 1324, 89-106 (2015).</li><li>B&#225;r&#225;ny-Wallje, E., Gaur, J., Lundberg, P., Langel, U., Gr&#228;slund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+membrane+perturbation+caused+by+the+cell+penetrating+peptide+Tp10+depending+on+attached+cargo.">Differential membrane perturbation caused by the cell penetrating peptide Tp10 depending on attached cargo.</a> FEBS Letters. 581 (13), 2389-2393 (2007).</li><li>van Rooijen, B. D., Claessens, M. M. A. E., Subramaniam, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+permeabilization+by+oligomeric+&#945;-Synuclein:+in+search+of+the+mechanism.">Membrane permeabilization by oligomeric &#945;-Synuclein: in search of the mechanism.</a> PloS One. 5 (12), 14292 (2010).</li><li>Hassane, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+cellular+trafficking+of+splice+redirecting+oligonucleotides+complexed+with+chemically+modified+cell-penetrating+peptides.">Insights into the cellular trafficking of splice redirecting oligonucleotides complexed with chemically modified cell-penetrating peptides.</a> Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 153 (2), 163-172 (2011).</li><li>Asciolla, J. J., Renault, T. T., Chipuk, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examining+BCL-2+family+function+with+large+unilamellar+vesicles.">Examining BCL-2 family function with large unilamellar vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (68), e4291 (2012).</li><li>Grewer, C., Gameiro, A., Mager, T., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+characterization+of+membrane+transport+proteins.">Electrophysiological characterization of membrane transport proteins.</a> Annual Review of Biophysics. 42 (1), 95-120 (2013).</li></ol>

저자는 이해상충이 없습니다.

제시된 형광 누설 분석법은 세포 관통 펩타이드에 의한 막 불안정화를 해결하는 간단하고 빠른 방법입니다. 쉽게 할 수 있으며, 또한 다른 멤브레인 상호 작용 펩티드 또는 다른 멤브레인 상호 작용 분자 사이의 간접적인 비교를 가능하게합니다. 이 분석이 기준선(LUV 단독으로)과 최대 형광 방출(Triton 조건) 사이의 상대적 값을 제공하기 때문에 프로토콜의 중요한 단계에 대해서는 일반적으로 LUV?...

90년대에 발견된 후, 세포 관통 펩티드(CpP)는 혈장 막1,2를통해 화물의 효율적인 세포 전달을 촉진하기 위해 개발되었다. CpPs는 일반적으로 짧은 펩티드, 일반적으로 8 ~ 30 아미노산, 기원의 다양 한 데. 그(것)들은 처음에 "직접 배분하는" 운반체로 정의되었습니다, 그(것)들이 플라즈마 막을 교차하고 에너지 요구 사항도 수용체 관여도 없는 어떤 내분 통로와 독립적으로 세포로 화물을 전송할 수 있었다는 것을 의미합니다. 그러나, 추가 조사는 이러한 첫 번째 관찰이 주로 실험 동맥 및 /또는 메탄올3을사용하여 고정 프로토콜에 형광 과대 평가에서 온 것으로 나타났다. 요즘CPP 섭취량은 내분세포증과 에너지 독립적인 전좌4,5,6,7 이에 따라 화물의 특성, CPP와 화물 간의 사용 링크, 연구된 세포주 등과 같은 다른 파라미터에 따라 이루어지는 것으로 널리 받아들여지고 있다.
CPP는 CPP와그 화물8,9,10,11사이의 화학 링크(covalent strategy) 또는 정전기/소수성 상호 작용(비-공유 전략)을 포함하는 두 가지 전략에 따라 경전제로서 사용될 수 있다. 두 전략 모두 여러 화물의 세포 전달에 효율성을 보였지만, CPP에 의한 내산화 메커니즘에 대한 이해는 여전히 논란의 여지가 있으며 내분비 경로 또는 직접 침투 사이의 균형은 여전히12,13을측정하기 어렵다. 일련의 실험 도구와 전략이 내막 프로세스의 개입을 명확하게 해결할 수 있지만, 직접 전좌는 플라즈마 멤브레인 구성 요소와의 보다 이산적인 상호 작용을 의미하기 때문에 특성화하기가 더 어려워 보입니다. 생물학적 막은 일반적으로 세포 유형 및/또는 환경(스트레스 조건, 세포 분열 등)에 따라 달라질 수 있는 인지질에서 막 단백질에 이르기까지 수많은 성분으로 구성됩니다. 이러한 구성의 다양성, 따라서 보편적인 세포막 모델의 부재는 한 가지 방법으로 연구를 가능하게 하지 않는다. 그러나 이러한 한계를 우회하기 위해 단계별 접근법은 인공 막 또는 멤브레인 추출물로 개발되었다. 작은 unilamellar 소포에서 단층 접근법에 이르기까지 모든 모델은 특정 질문에14,15에분명히 답하는 데 관련이 있었습니다. 그 중에서도, 큰 unilamellar 소포 (LUV)는 내재화 프로세스의 핵심 포인트인 펩티드 /멤브레인 상호 작용을 연구하기 위한 적절한 멤브레인 모방 모델을 구성한다.
이러한 맥락에서, 다음 프로토콜은 음이온 형광염과 리포솜에 캡슐화된 해당 다양양이온 담수의 모니터링을 통해 LUV 무결성에 대한 펩타이드 및 펩타이드/멤브레인 상호 작용의 영향에 대한 조사를 설명합니다. 이 도구는 직접 멤브레인 전좌를 수행 할 수 있는지 여부를 이해하기 위해 CPP / 멤브레인 상호 작용을 연구하는 데 사용됩니다. 일반적으로 다른 멤브레인 상호 작용 펩티드를 비교하기 위해 적용되었지만,이 LUV 형광 누설 분석은 CPP-화물 공자 (공유 전략)와 CPP :화물 단지 (비 공유 전략)를 조사하는 데 사용할 수 있습니다.
따라서 본 프로토콜은 최근에 개발된 트립토판(W)과 아르기닌(R)이 풍부한 수륙요법 펩타이드(WRAP)16과함께 먼저 예시된다. WRAP은 펩티드 계 나노입자를 형성하여 여러세포주(16)에서소형 간섭 RNA(siRNA)를 신속하고 효율적으로 전달할 수 있다. WRAP 펩티드 단독으로 또는 siRNA-로드 WRAP 계 나노입자의 형광 누설 특성을 모니터링하여 세포 내산화의 메커니즘을 특성화하였다. 우리는 내면화의 그들의 기계장치가 주로 직접 전좌7을관련시키는 것을 보여주었습니다. 두 번째 예에서, WRAP 펩타이드는 단백질/단백질 간섭 펩타이드 iCAL36(WRAP-iCAL36)17에 공유하게 되었고, 그 능력은 형광 누설 분석에서 페네타틴(Penetratin-iCAL36), 또 다른 CPP에 결합하였다.
마지막으로, 방법의 장점과 한계는 기술적 관점에서 생물학적 관련성에 대해 모두 논의될 것입니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >25 mL glass round-bottom flask</td>
			<td >Pyrex</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >8-aminonaphthalene-1, 3, 6-trisulfonic acid, disodium salt (ANTS)</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >A350</td>
			<td>Protect from light&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chloroform&#160;</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >288306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cholesterol</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DOPC (dioleoylphosphatidylcholine)</td>
			<td >Avanti Polar</td>
			<td>850375P</td>
			<td>Protect from air</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Extruder</td>
			<td >Avanti Polar</td>
			<td >610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluorimeter</td>
			<td >PTI Serlabo</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 &#181;L glass syringe</td>
			<td >Hamilton</td>
			<td >705N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEPES</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LabAssay Phospholipid&#160;</td>
			<td >WAKO&#160;</td>
			<td >296-63801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >liquid chromatography column</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Methanol</td>
			<td >Carlo Erba</td>
			<td >414902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nuclepore polycarbonate membrane (0.1 &#181;m pore size, 25 mm diameter)</td>
			<td >Whatman</td>
			<td >800309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >polystyrene cuvette, 10 x 10 x 45 mm</td>
			<td >Grener Bio-One</td>
			<td >614101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >polystyrene semi-micro cuvette, DLS</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >FB55924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >p-xylene-bispyridinium bromide (DPX)</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >X1525</td>
			<td>Protect from light&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >quartz fluorescence cuvette</td>
			<td >Hellma</td>
			<td >109.004F-QS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >rotavapor system&#160;</td>
			<td >Heidolph</td>
			<td >Z334898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sephadex G-50 resin</td>
			<td >Amersham</td>
			<td >17-0042-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium azide (NaN3)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium chlorid (NaCl)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sonicator bath USC300T</td>
			<td >VWR</td>
			<td >142-6001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sphingomyelin</td>
			<td >Avanti Polar</td>
			<td>860062P</td>
			<td>Protect from air</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100&#160;</td>
			<td >Eromedex</td>
			<td >2000-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Zetaziser NanoZS&#160;</td>
			<td >Malvern</td>
			<td >ZEN3500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescent leakage assay to investigate membrane destabilization by cell-penetrating peptide

세포 관통 펩티드(CpP)는 플라즈마 멤브레인을 교차하고 화물을 세포로 이송할 수 있는 운반체로 정의됩니다. 이 활동에 필요한 주요 일반적인 특징 중 하나는 플라즈마 멤브레인 (지질)과 CPP의 상호 작용및 특히 막 자체의 세포 외 매트릭스 (heparan sulphate)의 구성 요소에서 비롯되었습니다. 실제로, 직접적인 전좌 또는 내분비에 의존하는 내재화와는 별개로, 지질 이중층은 혈장 막의 수준과 세포내 교통(내외 소포)의 수준에서 모두 내화 공정에 관여한다. 이 문서에서는 가능한 CPP 멤브레인 불안정화/상호 작용을 감지하고 내부화 메커니즘에서 자신의 역할을 해결하기 위해 형광 누설 분석에서 큰 단음제 소포(LUV) 제제, 정제, 특성화 및 응용 프로그램의 다른 단계를 설명하는 상세한 프로토콜을 제시합니다. 혈장 막 함량을 반영하는 지질 조성물을 가진 루프는 형광염과 담수를 모두 캡슐화하기 위해 생성된다. 루프염증에 대한 펩티드-멤브레인 상호작용의 외과 배지에 펩타이드를 첨가하고 따라서 투여량 의존적 방식으로 유도하여 누설을 드러내는 형광의 현저한 증가를 유도할 수 있다. 최근에 개발된 트립토판(W)과 아르기닌(R)이 풍부한 수륙양용 펩타이드(WRAPP)와 함께 다양한 세포주에서 신속하고 효율적인 siRNA 전달을 보여 준 사례가 여기에 제공된다. 마지막으로, 이러한 상호 작용의 본질과 지질에 대한 친화력은 막 전좌 및/또는 내인성 탈출을 이해하고 개선하기 위해 논의됩니다.

형광 누설 분석의 원리는 도 1에도시된다. 구체적으로, 형광염과 담수(형광 신호 없음)를 캡슐화하는 대형 유니라멜라 소포(LUV)는 관심있는 생체 분자로 처리된다. 막 투과성, 재구성 또는 파열을 암시할 수 있는 지질 막과의 펩타이드의 상호 작용으로 인해 형광염과 담종은 LUV에서 방출됩니다. 버퍼의 후속 희석으로 인해 형광 신호가 증가합니다....

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Fluorescent Leakage Assay to Investigate Membrane Destabilization by Cell-Penetrating Peptide

형광 누설 분석법은 펩타이드/멤브레인 상호작용의 조사를 가능하게 하는 간단한 방법으로, 여러 생물학적 과정에 대한 그들의 관여, 특히 세포 관통 펩타이드의 능력을 이해하기 위해 직접 세포 전좌 과정 동안 인지질을 방해한다.

세포 관통 펩타이드에 의한 막 불안정화를 조사하기 위한 형광 누설 분석

Cell-penetrating peptides (CPPs) are defined as carriers that are able to cross the plasma membrane and to transfer a cargo into cells. One of the main ...

fluorescent-leakage-assay-to-investigate-membrane-destabilization

Research

JoVE Journal

Biochemistry

6.1K 조회수.  INSERM U1046 - CNRS UMR 9214 - University of Montpellier. 형광 누설 분석법은 펩타이드/멤브레인 상호작용의 조사를 가능하게 하는 간단한 방법으로, 여러 생물학적 과정에 대한 그들의 관여, 특히 세포 관통 펩타이드의 능력을 이해하기 위해 직접 세포 전좌 과정 동안 인지질을 방해한다.

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Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a determinant phosphoinositide of the plasma membrane (PM), and it is required to modulate ion channels, actin dynamics, exocytosis, endocytosis, intracellular signaling, and many other cellular processes. However, the spatial organization of PI(4,5)P2 in the PM is controversial, and its nanoscale distribution is poorly understood due to the technical limitations of research approaches. Here by utilizing single molecule localization microscopy and the Pleckstrin Homology (PH) domain based dual color fluorescent probes, we describe a novel method to visualize the nanoscale distribution of PI(4,5)P2 in the PM in fixed membrane sheets as well as live cells.

PI(4,5)P2 regulates various cellular functions, but its nanoscale organization in the cell plasma membrane is poorly understood. By labeling PI(4,5)P2 with a dual-color fluorescent probe fused to the Pleckstrin Homology domain, we describe a novel approach to study the PI(4,5)P2 spatial distribution in the plasma membrane at the nanometer scale.

소설 형광 프로브와 플라즈마 막에서 포스파티딜 이노시톨 -4,5- 비스 포스페이트의 단일 분자 슈퍼 해상도 이미징

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

연구

생화학

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating these studies, reincorporation of detergent-solubilized membrane proteins into liposomes is a stochastic process where protein topology is impossible to enforce. This paper offers an alternative method to these challenging techniques that utilizes a liposome-based scaffold. Protein solubility is enhanced by deletion of the transmembrane domain, and these amino acids are replaced with a tethering moiety, such as a His-tag. This tether interacts with an anchoring group (Ni2+ coordinated by nitrilotriacetic acid (NTA(Ni2+)) for His-tagged proteins), which enforces a uniform protein topology at the surface of the liposome. An example is presented wherein the interaction between Dynamin-related protein 1 (Drp1) with an integral membrane protein, Mitochondrial Fission Factor (Mff), was investigated using this scaffold liposome method. In this work, we have demonstrated the ability of Mff to efficiently recruit soluble Drp1 to the surface of liposomes, which stimulated its GTPase activity. Moreover, Drp1 was able to tubulate the Mff-decorated lipid template in the presence of specific lipids. This example demonstrates the effectiveness of scaffold liposomes using structural and functional assays and highlights the role of Mff in regulating Drp1 activity.

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

비계 리포좀을 사용하여 근위 지질 단백질 - 단백질 상호 작용을 재구성<em&gt; 체외</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the availability of enough area to perform the function. Nanodiscs are used to provide a membrane surface of controlled size and lipid content. In the absence of bound extrinsic proteins, sodium phosphotungstate-stained nanodiscs appear as stacks of coins when viewed from the side by transmission electron microscopy (TEM). This protocol is therefore designed to intentionally promote stacking; consequently, the prevention of stacking can be interpreted as the binding of the membrane-binding protein to the nanodisc. In a further step, the TEM images of the protein-nanodisc complexes can be processed with standard single-particle methods to yield low-resolution structures as a basis for higher resolution cryoEM work. Furthermore, the nanodiscs provide samples suitable for either TEM or non-denaturing gel electrophoresis. To illustrate the method, Ca2+-induced binding of 5-lipoxygenase on nanodiscs is presented.

Many proteins perform their function when attached to membrane surfaces. The binding of extrinsic proteins on nanodisc membranes can be indirectly imaged by transmission electron microscopy. We show that the characteristic stacking (rouleau) of nanodiscs induced by the negative stain sodium phosphotungstate is prevented by the binding of extrinsic protein.

방법은 시각화 및 투과 전자 현미경에 의해 막 상호 작용하는 단백질을 분석하는

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field of 3D templates is rising due to the potential resemblance of those materials to the natural extracellular matrix. Protein-based hydrogels are particularly promising because they can easily be functionalized and can achieve defined structures with adjustable physicochemical properties. However, the production of macroporous 3D templates for cell culture applications using natural materials is often limited by their weaker mechanical properties compared to those of synthetic materials. Here, different methods were evaluated to produce macroporous bovine serum albumin (BSA)-based hydrogel systems, with adjustable pore sizes in the range of 10 to 70 &#181;m in radius. Furthermore, a method to generate channels in this protein-based material that are several hundred microns long was established. The different methods to produce pores, as well as the influence of pore size on material properties such as swelling ratio, pH, temperature stability, and enzymatic degradation behavior, were analyzed. Pore sizes were investigated in the native, swollen state of the hydrogels using confocal laser scanning microscopy. The feasibility for cell culture applications was evaluated using a cell-adhesive RGD peptide modification of the protein system and two model cell lines: human breast cancer cells (A549) and adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells (MCF7).

Different methods to manipulate three-dimensional architecture in protein-based hydrogels are evaluated here with respect to material properties. The macroporous networks are functionalized with a cell-adhesive peptide, and their feasibility in cell culture is evaluated using two different model cell lines.

셀 문화 응용 프로그램에 대 한 단백질 기반 Hydrogels 아키텍처의 쉬운 조작

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis can be characterized using an in vitro DNA synthesis assay followed by polyacrylamide gel electrophoresis. The goal of this assay is to quantify synthesis of both natural DNA and modified DNA (M-DNA). These approaches are particularly useful for resolving oligonucleotides with single nucleotide resolution, enabling observation of individual steps during enzymatic oligonucleotide synthesis. These methods have been applied to the evaluation of an array of biochemical and biophysical properties such as the measurement of steady-state rate constants of individual steps of DNA synthesis, the error rate of DNA synthesis, and DNA binding affinity. By using modified components including, but not limited to, modified nucleoside triphosphates (NTP), M-DNA, and/or mutant DNA polymerases, the relative utility of substrate-DNA polymerase pairs can be effectively evaluated. Here, we detail the assay itself, including the changes that must be made to accommodate nontraditional primer DNA labeling strategies such as near-infrared fluorescently labeled DNA. Additionally, we have detailed crucial technical steps for acrylamide gel pouring and running, which can often be technically challenging.

This protocol describes the characterization of DNA polymerase synthesis of modified DNA through observation of changes to near-infrared fluorescently labeled DNA using gel electrophoresis and gel imaging. Acrylamide gels are used for high resolution imaging of the separation of short nucleic acids, which migrate at different rates depending on size.

근 적외선 형광 레이블이 DNA 아크릴 아 미드 젤 전기 이동 법으로 시각을 사용 하 여 DNA 중 합 효소 활동 분석 결과

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The modification presented includes the combination of this technique with cell-penetrating sequences. We propose to design cell-penetrating baits that can be incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions found will reflect those that occur within the intracellular context. Connexin43 (Cx43), a protein that forms gap junction channels and hemichannels is down-regulated in high-grade gliomas. The Cx43 region comprising amino acids 266-283 is responsible for the inhibition of the oncogenic activity of c-Src in glioma cells. Here we use TAT as the cell-penetrating sequence, biotin as the pull-down tag and the region of Cx43 comprised between amino acids 266-283 as the target to find intracellular interactions in the hard-to-transfect human glioma stem cells. One of the limitations of the proposed method is that the molecule used as bait could fail to fold properly and, consequently, the interactions found could not be associated with the effect. However, this method can be especially interesting for the interactions involved in signal transduction pathways because they are usually carried out by intrinsically disordered regions and, therefore, they do not require an ordered folding. In addition, one of the advantages of the proposed method is that the relevance of each residue on the interaction can be easily studied. This is a modular system; therefore, other cell-penetrating sequences, other tags, and other intracellular targets can be employed. Finally, the scope of this protocol is far beyond protein-protein interaction because this system can be applied to other bioactive cargoes such as RNA sequences, nanoparticles, viruses or any molecule that can be transduced with cell-penetrating sequences and fused to pull-down tags to study their intracellular mechanism of action.

This is a protocol to study intracellular protein-protein interactions based on the biotin-avidin pull-down system with the novelty of combining cell-penetrating sequences. The main advantage is that the target sequence is incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions will occur within the cellular context.

Biotinylated 세포 관통 펩 티 드 세포내 단백질-단백질 상호 작용을 공부 하

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage by extracellular oxidants. This process of transporting electrons from intracellular reductants to extracellular oxidants is not well defined. Here we present spectrophotometric assays by C2C12 myotubes to monitor tPMET utilizing the extracellular electron acceptors: water-soluble tetrazolium salt-1 (WST-1) and 2,6-dichlorophenolindophenol (DPIP or DCIP). Through reduction of these electron acceptors, we are able to monitor this process in a real-time analysis. With the addition of enzymes such as ascorbate oxidase (AO) and superoxide dismutase (SOD) to the assays, we can determine which portion of tPMET is due to ascorbate export or superoxide production, respectively. While WST-1 was shown to produce stable results with low background, DPIP was able to be re-oxidized after the addition of AO and SOD, which was demonstrated with spectrophotometric analysis. This method demonstrates a real-time, multi-well, quick spectrophotometric assay with advantages over other methods used to monitor tPMET, such as ferricyanide (FeCN) and ferricytochrome c reduction.

The goal of this protocol is to spectrophotometrically monitor trans-plasma membrane electron transport utilizing extracellular electron acceptors and to analyze enzymatic interactions that may occur with these extracellular electron acceptors.

C2C12 Myotubes에 의해 트랜스-플라즈마 막 전자 전송 측정

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

셀 연락처에서 단백질 단백질 상호 작용의 형광 변동 분광학 분석 결과

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often viruses exhibit cell and tissue tropism and are adapted to specific cell or tissue proteases. Moreover, these viruses can introduce mutations or insertions into their genome during replication that may affect the cleavage, and thus can contribute to adaptations to a new host. Here, we present a fluorogenic peptide cleavage assay that allows a rapid screening of peptides mimicking the cleavage site of viral fusion proteins. The technique is very flexible and can be used to investigate the proteolytic activity of a single protease on many different substrates, and in addition, it also allows exploration of the activity of multiple proteases on one or more peptide substrates. In this study, we used peptides mimicking the cleavage site motifs of the coronavirus spike protein. We tested human and camel derived Middle East Respiratory Syndrome coronaviruses (MERS-CoV) to demonstrate that single and double substitutions in the cleavage site can alter the activity of furin and dramatically change cleavage efficiency. We also used this method in combination with bioinformatics to test furin cleavage activity of feline coronavirus spike proteins from different serotypes and strains. This peptide-based method is less labor- and time intensive than conventional methods used for the analysis of proteolytic activity for viruses, and results can be obtained within a single day.

We present a fluorogenic peptide cleavage assay that allows a rapid screening of the proteolytic activity of proteases on peptides representing the cleavage site of viral fusion peptides. This method can also be used on any other amino acid motif within a protein sequence to test for the protease activity.

분해 활동에 대 한 화면에 Fluorogenic 펩 티 드 분열 분석 결과: 코로나 바이러스에 대 한 응용 프로그램 스파이크 단백질 활성화

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used for ATP production. The amphiphilic nature of membrane proteins requires particular attention to their handling, and reconstitution into the natural lipid environment is indispensable when studying membrane transport processes like proton translocation. Here, we detail a method that has been used for the investigation of the proton-pumping mechanism of membrane redox enzymes, taking cytochrome bo3 from Escherichia coli as an example. A combination of electrochemistry and fluorescence microscopy is used to control the redox state of the quinone pool and monitor pH changes in the lumen. Due to the spatial resolution of fluorescent microscopy, hundreds of liposomes can be measured simultaneously while the enzyme content can be scaled down to a single enzyme or transporter per liposome. The respective single enzyme analysis can reveal patterns in the enzyme functional dynamics that might be otherwise hidden by the behavior of the whole population. We include a description of a script for automated image analysis.

Here, we present a protocol to study the molecular mechanism of proton translocation across lipid membranes of single liposomes, using cytochrome bo3 as an example. Combining electrochemistry and fluorescence microscopy, pH changes in the lumen of single vesicles, containing single or multiple enzyme, can be detected and analyzed individually.

전기 화학 및 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 양성자 펌프 막 효소의 연구에 대 한 단일 Liposome 측정

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...