Die Autoren danken Emilie Josse für die kritische Begutachtung des Manuskripts. Diese Arbeit wurde von der Stiftung "La Ligue contre le Cancer", der "Fondation ARC pour la Recherche sur le Cancer" und dem "Centre National de la Recherche Scientifique" (CNRS) unterstützt.

1. Vorbereitung großer unilamellarer Vesikel (LUVs)
<ol><li>Bereiten Sie LUVs für ihre Verwendung als Zellmembran-Nachahmungen für die Fluoreszenzleckage-Assay vor.</li>
	<li>Mischen Sie mit einer Hamilton Glasspritze Phosphatidylcholin (DOPC, 786,11 g/mol), Sphingomyelin (SM, 760,22 g/mol) und Cholesterin (Chol, 386,65 g/mol) im Molverhältnis 4:4:2. Die Lipidlösung wird aus einer Stammlösung jedes Lipids gewonnen, das in einem Methanol/Chloroform-Lösungsmittel (3/1; Volumen/Volumen) bei 25 mg/ml in einem 25-ml-Glas-Rundkolben gelöst ist. Basierend auf 4 μmol DOPC, 4 μmol SM und 2 μmol Chol wird die Lipidlösung aus Stammlösung durch Mischen von 126 μL, 117 μL bzw. 31 μL erhalten. VORSICHT: Methanol ist ein giftiges und brennbares Lösungsmittel und Chloroform ist giftig und krebserregend. Beide sollten mit dem entsprechenden Schutz unter einer Haube gehandhabt werden.</li>
	<li>Methanol/Chloroform mit einem Rotationsverdampfer unter Vakuum während 45-60 min bei 60 °C verdampfen, bis ein getrockneter Lipidfilm entsteht.</li>
	<li>Bereiten Sie zwei HEPES-Pufferlösungen vor. HEPES-Puffer 1 durch Mischen von 20 mM HEPES (238,3 g/mol) und 75 mM NaCl (58,44 g/mol) herstellen und pH-Wert auf 7,4 einstellen. HEPES-Puffer 2 durch Mischen von 20 mM HEPES und 145 mM NaCl vorbereiten und pH-Wert auf 7,4 einstellen. HEPES-Puffer können 1 Monat lang bei 4 °C gelagert werden. HINWEIS: Es wird empfohlen, die Osmolarität der Puffer mit einem Osmometer zu überprüfen.</li>
	<li>Herstellung einer Lipidhydratationslösung durch Lösen der Membran undurchlässiger fluoreszierender Farbstoff-Quencher-Paare, 8-Aminonaphthalin-1, 3, 6-Trisulfonsäure, Dinatriumsalz bei 12,5 mM (ANTS, 427,33 g/mol) und p-Xylol-Bispyridiniumbromid bei 45 mM (DPX, 422,16 g/mol) in HEPES-Pufferlösung. Das Mischen von AMEISEN mit DPX führt zu einer gelben Lösung. Um die Konzentrationen von 12,5 mM ANTS und 45 mM DPX zu erreichen, lösen Sie 21,4 mg bzw. 76 mg in 4 ml HEPES-Puffer 1 auf. HINWEIS: Lipidhydratationslösung kann 2 Wochen bei 4 °C gelagert werden, indem das Röhrchen mit Aluminiumfolie umwickelt wird.</li>
	<li>Rekonstituieren Sie mehrschalige Vesikel (MLV), indem Sie den getrockneten Lipidfilm mit 1 ml der Lipidhydratationslösung wiederverwenden und bis zur Auflösung des getrockneten Lipidfilms wirbeln. Stellen Sie sicher, dass die Lösung vollständig gelöst ist, da sich kleine Lipidaggregate negativ auf die vorhergehenden Schritte auswirken. Überprüfen Sie auch die Wand des Glas-Rundkolbens, um sicherzustellen, dass kein Lipidfilm mehr vorhanden ist. HINWEIS: Die Lösung erscheint nach der Lösung opalisierend und hellgelb.</li>
	<li>Unterziehen Sie die Vesikel fünf Gefrier- / Auftauzyklen, um einlamellare Vesikel zu erhalten. Führen Sie jeden Zyklus durch, indem Sie den Glas-Rundkolben für 30 s in flüssigen Stickstoff für den Gefrierschritt stellen und dann für 2 Minuten in einem Wasserbad für den Auftauschritt belassen. HINWEIS: Die Temperatur des Badewassers sollte 5-10 °C höher sein als die Schmelztemperatur der Lipide.</li>
	<li>Bereiten Sie den Lipidextruder vor, indem Sie zwei Filterträger mit HEPES-Puffer in jedes Polytetrafluorethylen (PTFE) -Extruderstück einsetzen, das in den Metallextruderkanister gelegt wird.</li>
	<li>Legen Sie eine HEPES-befeuchtete Polycarbonatmembran (0,1 μm Porengröße, 25 mm Durchmesser) auf die Oberseite einer Filterhalterung.</li>
	<li>Montieren Sie die beiden Metallextruderkanister und schrauben Sie sie.</li>
	<li>Legen Sie den zusammengebauten Extruder in den Halter und führen Sie eine 1-ml-Spritze in das entsprechende Loch am Ende jedes Polytetrafluorethylen-Extruderstücks ein. Die Extrusion entspricht dem Durchgang der getesteten Flüssigkeit von einer Spritze zur anderen durch die Polycarbonatmembran.</li>
	<li>Testen Sie den Extruder mit 1 ml HEPES-Puffer, der in eine der 1 ml Spritzen geladen ist, um sicherzustellen, dass keine Leckagen oder Probleme auftreten.</li>
	<li>Ersetzen Sie den 1-ml-HEPES-Puffer durch die MLV-Probe.</li>
	<li>Führen Sie die Extrusion durch, indem Sie die MLV-Probe mindestens 21 Mal von einer Spritze zur anderen durch die Polycarbonatmembran leiten, um einheitliche LUVs gleicher Größe zu erhalten. HINWEIS: Die Extrusion sollte bei einer Temperatur erfolgen, die höher ist als die Schmelztemperatur des Lipidgemisches.</li>
</ol>2. Reinigung von LUVs
<ol><li>Bereiten Sie eine Säulenreinigung vor, um nicht gekapselte ANTS- und DPX-Überschuss zu entfernen.</li>
	<li>Vernetztes Dextrangel (G-50), das in wässrigem Medium mit 0,01%NaN3 (65 g/mol) resuspendiert ist, in eine Flüssigkeitschromatographiesäule (Luer Lock, nicht ummantelt, 1,0 cm x 20 cm, Bettvolumen 16 ml) bis zu 1 cm unter der Oberseite des farblosen Teils der Säule einführen.</li>
	<li>Öffnen Sie den Wasserhahn und lassen Sie die Flüssigkeit fließen, um das vernetzte Dextran-Gel abzusetzen.</li>
	<li>Waschen Sie die Säule durch Eluieren mit 20 ml HEPES-Puffer 2 und verwerfen Sie den Ausgangsstrom der Säule.</li>
	<li>Schließen Sie den Wasserhahn, sobald das tote Lösungsmittelvolumen über der Säule minimiert ist (<100 μL), aber ausreichend, um eine Trocknung des vernetzten Dextrangels zu vermeiden.</li>
	<li>Legen Sie die frisch extrudierten LUVs (gelb) auf die Säule und lassen Sie sie in das vernetzte Dextran-Gel einwirken.</li>
	<li>Fügen Sie der Säule kontinuierlich den HEPES-Puffer 2 hinzu, um die LUV-Reinigung durchzuführen.</li>
	<li>Elute etwa 2 ml HEPES-Puffer 2 (vergessen Sie nicht, die Oberseite der Säule regelmäßig zu füllen, um ein Trocknen des vernetzten Dextran-Gels zu vermeiden): Die freie gelbe AMEISEN- und DPX-Lösung wandert langsamer als die Liposomen.</li>
	<li>Beginnen Sie mit dem Sammeln von gereinigten LUVs in Röhrchen (1,5 ml).</li>
	<li>Beobachten Sie die Eluententropfen aus der Säule und wenn sie opalisierend werden, enthalten sie Liposomen. Wechseln Sie das Röhrchen, um die LUV-haltige Fraktion zurückzugewinnen.</li>
	<li>Elute, bis die Tropfen nicht mehr opalisierend sind (~1 ml). Eluieren Sie anschließend weitere 0,5 ml in einer separaten Fraktion und hören Sie dann auf zu eluieren. HINWEIS: Standards sind jetzt in einer Vielzahl von Molekulargewichten, als Kits oder einzelne Molekulargewichte erhältlich, um das Elutionsvolumen der LUVs zu kalibrieren.</li>
	<li>Wickeln Sie die Röhrchen mit den LUVs in Aluminiumfolie, um ein Bleichen des Fluoreszenzfarbstoffs zu vermeiden.</li>
	<li>Waschen Sie die Säule mit 20 mL HEPES Puffer 2.</li>
	<li>Die LUVs können dann eine Woche lang bei 4 °C gelagert werden. HINWEIS: Da die LUV-Stabilität von der LUV-Konzentration und -Zusammensetzung sowie von der Ionenstärke abhängen kann, sollte die Größe der LUVs mit einem DLS-Instrument (Dynamic Light Scattering) gesteuert werden (siehe Abschnitt 4. B. Charakterisierung von LUV-Größe und Homogenität) vor jedem Test.</li>
</ol>3. Quantifizierung der Konzentration von LUVs
<ol><li>Schätzung der LUV-Konzentration durch ein Phospholipid-Quantifizierungskit, das die Bewertung der Cholinkonzentration19ermöglicht. Dieser Assay kann angewendet werden, wenn Phospholipide mit Cholin, das polaren Kopf enthält, erheblich sind (>50% der LUVs).</li>
	<li>Bereiten Sie das Farbreagenz vor, indem Sie 18 mg Chromogensubstrat in 3 ml Puffer auflösen.</li>
	<li>Laden Sie eine Polystyrolküvette, 10 x 10 x 45 mm, mit 3 ml Farbreagenz ein.</li>
	<li>Verwenden Sie das reine Farbreagenz als Leerbedingung (Blank). 20 μL LUV-Probe (Test) oder 20 μL Standardlösung bekannter Cholinkonzentration (Standard) zugeben.</li>
	<li>Gut mischen und 5 min bei 37 °C unter allen Bedingungen (Blank, Test und Standard) inkubieren.</li>
	<li>Messen Sie die Absorption (optische Dichte, OD) der Probe und der Standardlösung mit der Blindlösung als Kontrolle bei 600 nm mit einem Spektralphotometer.</li>
	<li>Überprüfen Sie die OD-Werte, die es ermöglichen, die Lipidkonzentration der LUVs, C [LUV], in Cholinäquivalent im Vergleich zum Standard der bekannten Konzentration abzuschätzen.</li>
	<li>Führen Sie die Berechnung mit der folgenden Gleichung durch: C[LUV] (mol / l) = (OD-Probe / OD-Standard) x C[Standard] (mol / l) ANMERKUNG: Das Phospholipid-Quantifizierungskit enthielt eine Cholinchlorid(139,6 mg/l)-Standardlösung bei 54 mg/dl, die der molaren Konzentration von C[Standard] = 3,87 mmol/L entspricht.</li>
</ol>4. Charakterisierung von LUV-Größe und Homogenität
<ol><li>Führen Sie eine Messung mit einem DLS-Gerät durch, um die LUV-Größe (in nm) und den Polydispersitätsindex (PdI) zu bestimmen.</li>
	<li>Programmieren Sie das entsprechende "Standard Operation Procedure" (SOP), indem Sie die Viskosität des Lösungsmittels/Puffers und der verwendeten Küvette angeben.</li>
	<li>500 μL der LUV-Lösung in eine Polystyrol-Halbmikroküvette geben.</li>
	<li>Setzen Sie die Polystyrol-Semimikroküvette in ein DLS-Gerät ein.</li>
	<li>Messen Sie bei Raumtemperatur die Größenverteilung in Bezug auf die mittlere Größe (Z-Mittelwert) der Partikelverteilung und der Homogenität (Polydispersitätsindex, PdI).</li>
	<li>Alle Ergebnisse stammen aus zwei unabhängigen Messungen, die jeweils in drei sich wiederholenden Zyklen durchgeführt werden. HINWEIS: Die Standardwerte für LUVs betragen eine mittlere Größe von 137 ± 7 nm mit einem PdI von 0,149 ± 0,041.</li>
</ol>5. Herstellung von Peptidlösungen
<ol><li>Bereiten Sie eine Stammlösung des Peptids vor, die für den Leckage-Assay analysiert werden sollte.</li>
	<li>Lösen Sie Peptidpulver (>95% Reinheit) in reinem Wasser auf (z. B. 1 mg Peptid in 500 μL reinem Wasser). HINWEIS: Es wird empfohlen, Peptide in reinem Wasser zu verdünnen und eine Dimethylsulfoxid (DMSO) -Solubilisierung zu vermeiden, die Artefakte induzieren könnte (z. B. Membranpermeabilisierung20).</li>
	<li>Wirbeln Sie die Peptidlösung für 5 s.</li>
	<li>Die Peptidlösung in einem Wasserbeschallungsbad für 5 min beschallen und dann für 5 min bei 12.225 x gzentrifugieren. Sammeln Sie den Überstand zur Konzentrationsbestimmung.</li>
	<li>Messen Sie die Absorption von drei unabhängigen Peptidverdünnungen bei 280 nm und berechnen Sie dann die Peptidkonzentration anhand des molaren Extinktionskoeffizienten ε (abhängig vom Tryptophan- und Tyrosingehalt in der Peptidsequenz) und der Beer-Lambert-Regel. HINWEIS: Wenn das Peptid Tryptophan und Tyrosin enthält, wird der molare Extinktionskoeffizient ε auf der Grundlage von Tryptophan ε = 5.690 M-1cm-1 und Tyrosin ε = 1.280 M-1cm-1berechnet. Wenn die Peptidsequenz kein Tryptophan oder Tyrosin enthält, könnte ein anderer kolorimetrischer Assay zur Messung der Konzentration durchgeführt werden (z. B. BCA oder Bradford).</li>
	<li>Die Peptidlösung in reinem Wasser auf eine von 100 μM verdünnen und bei 4 °C lagern. HINWEIS: In reinem Wasser kommt es während der 4 °C Lagerung zu keinem Peptidabbau. Die Peptidkonzentration sollte jedoch alle 2 Wochen gemessen werden, um sicherzustellen, dass keine Wasserverdunstung auftritt.</li>
</ol>6. Fluoreszenz-Leckage-Assay
<ol><li>Der Fluoreszenzlecktest wird auf einem Spektrofluorometer bei Raumtemperatur gemessen. Anregungs- und Emissionswellenlänge sind auf Ex = 360 nm ± 3 nm bzw. Em = 530 nm ± 5 nm festgelegt.</li>
	<li>Verdünnen Sie LUVs in 1 mL HEPES-Puffer 2 auf eine Endkonzentration von 100 μM in einer Quarzfluoreszenzküvette. Fügen Sie einen Magnetrührer hinzu, um die Lösung während des Experiments zu homogenisieren.</li>
	<li>Messen Sie die LUVs allein während der ersten 100 s, zwischen t = 0 s und t = 99 s, um auf die Hintergrundfluoreszenz zuzugreifen. HINWEIS: LUVs allein konnten auch während des gesamten Experiments (15 min) gemessen werden, um auf Hintergrundfluoreszenz und potenzielle Lecks zuzugreifen.</li>
	<li>Danach messen Sie die Leckage als Erhöhung der Fluoreszenzintensität unter Zugabe von Aliquots der Peptidlösung für die nächsten 900 s (15 min). Dieses Protokoll wird für jede getestete Peptidkonzentration von 0,1 μM bis 2,5 μM durchgeführt.</li>
	<li>Schließlich wurde eine 100%ige Fluoreszenz durch Solubilisierung der LUVs durch Zugabe von 1 μL Triton X-100 (0,1%, v/v) erreicht, was zu einer völlig ungequenten Sonde zwischen t = 1.000 s und t = 1.100 s führte.</li>
</ol>7. Quantifizierung der Leckage
<ol><li>Unterdrücken Sie Werte, die nach t = 1.090 s erhalten wurden, um die gleiche Anzahl von Punkten für jede getestete Bedingung beizubehalten.</li>
	<li>Berechnen Sie die minimale Fluoreszenz, Fmin, indem Sie den Durchschnitt von 50 Punkten zwischen t = 0 s und t = 49 s (LUVs allein) bilden.</li>
	<li>Berechnen Sie die maximale Fluoreszenz, Fmax, indem Sie den Durchschnitt von 50 Punkten zwischen t = 1.041 s und t = 1.090 s (LUVs mit Triton X-100) bilden.</li>
	<li>Berechnen Sie den Leckageprozentsatz (%Leck) zu jedem Zeitpunkt (t = x) gemäß der folgenden Gleichung: %Leck(t=x) = (F(t=x) - Fmin) / (Fmax - Fmin) x 100</li>
	<li>Berechnen Sie den Durchschnitt und die Standardabweichung für Werte, die mit unterschiedlicher LUV-Vorbereitung (n ≥ 2) für dieselbe Bedingung erhalten wurden.</li>
	<li>Zeichnen Sie den Prozentsatz der Leckage, %Leck(t=x),in Abhängigkeit von der Zeit (n).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Langel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Cell-Penetrating Peptides. , (2006).</li><li>Deshayes, S., Morris, M. C., Divita, G., Heitz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-penetrating+peptides:+tools+for+intracellular+delivery+of+therapeutics.">Cell-penetrating peptides: tools for intracellular delivery of therapeutics.</a> Cellular and Molecular Life Sciences CMLS. 62 (16), 1839-1849 (2005).</li><li>Richard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-penetrating+peptides.+A+reevaluation+of+the+mechanism+of+cellular+uptake.">Cell-penetrating peptides. A reevaluation of the mechanism of cellular uptake.</a> The Journal of Biological Chemistry. , (2003).</li><li>Jones, A., Sayers, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+entry+of+cell+penetrating+peptides:+tales+of+tails+wagging+dogs.">Cell entry of cell penetrating peptides: tales of tails wagging dogs.</a> Journal of Controlled Release Official Journal of the Controlled Release Society. , (2012).</li><li>T&#252;nnemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+analysis+of+cell+penetration+ability+and+toxicity+of+oligo-arginines.">Live-cell analysis of cell penetration ability and toxicity of oligo-arginines.</a> Journal of Peptide Science. 14 (4), 469-476 (2008).</li><li>Jiao, C. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+and+endocytosis+for+cell-penetrating+peptide+internalization.">Translocation and endocytosis for cell-penetrating peptide internalization.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (49), 33957-33965 (2009).</li><li>Deshayes, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+internalization+mechanism+of+WRAP:siRNA+nanoparticles.">Deciphering the internalization mechanism of WRAP:siRNA nanoparticles.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. Biomembranes. 1862 (6), 183252 (2020).</li><li>Konate, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimisation+of+vectorisation+property:+A+comparative+study+for+a+secondary+amphipathic+peptide.">Optimisation of vectorisation property: A comparative study for a secondary amphipathic peptide.</a> International Journal of Pharmaceutics. 509 (1-2), 71-84 (2016).</li><li>Lehto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+trafficking+determines+the+exon+skipping+activity+of+Pip6a-PMO+in+mdx+skeletal+and+cardiac+muscle+cells.">Cellular trafficking determines the exon skipping activity of Pip6a-PMO in mdx skeletal and cardiac muscle cells.</a> Nucleic Acids Research. 42 (5), 3207-3217 (2014).</li><li>Hoyer, J., Neundorf, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+vectors+for+the+nonviral+delivery+of+nucleic+acids.">Peptide vectors for the nonviral delivery of nucleic acids.</a> Accounts of Chemical Research. 45 (7), 1048-1056 (2012).</li><li>Milletti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-penetrating+peptides:+classes,+origin,+and+current+landscape.">Cell-penetrating peptides: classes, origin, and current landscape.</a> Drug Discovery Today. 17 (15-16), 850-860 (2012).</li><li>Mueller, J., Kretzschmar, I., Volkmer, R., Boisguerin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+cellular+uptake+using+22+CPPs+in+4+different+cell+lines.">Comparison of cellular uptake using 22 CPPs in 4 different cell lines.</a> Bioconjugate Chemistry. 19 (12), 2363-2374 (2008).</li><li>Ramaker, K., Henkel, M., Krause, T., R&#246;ckendorf, N., Frey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+penetrating+peptides:+a+comparative+transport+analysis+for+474+sequence+motifs.">Cell penetrating peptides: a comparative transport analysis for 474 sequence motifs.</a> Drug Delivery. 25 (1), 928-937 (2018).</li><li>Maget-Dana, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+monolayer+technique:+a+potent+tool+for+studying+the+interfacial+properties+of+antimicrobial+and+membrane-lytic+peptides+and+their+interactions+with+lipid+membranes.">The monolayer technique: a potent tool for studying the interfacial properties of antimicrobial and membrane-lytic peptides and their interactions with lipid membranes.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1462 (1-2), 109-140 (1999).</li><li>Alves, A. C., Ribeiro, D., Nunes, C., Reis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysics+in+cancer:+The+relevance+of+drug-membrane+interaction+studies.">Biophysics in cancer: The relevance of drug-membrane interaction studies.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1858 (9), 2231-2244 (2016).</li><li>Konate, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide-based+nanoparticles+to+rapidly+and+efficiently+"Wrap+'n+Roll"+siRNA+into+cells.">Peptide-based nanoparticles to rapidly and efficiently "Wrap 'n Roll" siRNA into cells.</a> Bioconjugate Chemistry. 30 (3), 592-603 (2019).</li><li>Seisel, Q., Pelletier, F., Deshayes, S., Boisguerin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+evaluate+the+cellular+uptake+of+CPPs+with+fluorescence+techniques:+Dissecting+methodological+pitfalls+associated+to+tryptophan-rich+peptides.">How to evaluate the cellular uptake of CPPs with fluorescence techniques: Dissecting methodological pitfalls associated to tryptophan-rich peptides.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. Biomembranes. 1861 (9), 1533-1545 (2019).</li><li>Derossi, D., Joliot, A. H., Chassaing, G., Prochiantz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+third+helix+of+the+Antennapedia+homeodomain+translocates+through+biological+membranes.">The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (14), 10444-10450 (1994).</li><li>Takayama, M., Itoh, S., Nagasaki, T., Tanimizu, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+enzymatic+method+for+determination+of+serum+choline-containing+phospholipids.">A new enzymatic method for determination of serum choline-containing phospholipids.</a> Clinica Chimica Acta; International Journal of Clinical Chemistry. 79 (1), 93-98 (1977).</li><li>Notman, R., Noro, M., O'Malley, B., Anwar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+for+Dimethylsulfoxide+(DMSO)+action+on+lipid+membranes.">Molecular basis for Dimethylsulfoxide (DMSO) action on lipid membranes.</a> Journal of the American Chemical Society. 128 (43), 13982-13983 (2006).</li><li>Konate, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insight+into+the+cellular+uptake+mechanism+of+a+secondary+amphipathic+cell-penetrating+peptide+for+siRNA+delivery.">Insight into the cellular uptake mechanism of a secondary amphipathic cell-penetrating peptide for siRNA delivery.</a> Biochemistry. 49 (16), 3393-3402 (2010).</li><li>Vaissi&#232;re, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+retro-inverso+cell-penetrating+peptide+for+siRNA+delivery.">A retro-inverso cell-penetrating peptide for siRNA delivery.</a> Journal of Nanobiotechnology. 15 (1), 34 (2017).</li><li>Eir&#237;ksd&#243;ttir, E., Konate, K., Langel, &. #. 2. 2. 0. ;., Divita, G., Deshayes, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secondary+structure+of+cell-penetrating+peptides+controls+membrane+interaction+and+insertion.">Secondary structure of cell-penetrating peptides controls membrane interaction and insertion.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1798 (6), 1119-1128 (2010).</li><li>Ziegler, A., Li Blatter, X., Seelig, A., Seelig, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+transduction+domains+of+HIV-1+and+SIV+TAT+interact+with+charged+lipid+vesicles.+Binding+mechanism+and+thermodynamic+analysis.">Protein transduction domains of HIV-1 and SIV TAT interact with charged lipid vesicles. Binding mechanism and thermodynamic analysis.</a> Biochemistry. 42 (30), 9185-9194 (2003).</li><li>Thor&#233;n, P. E. G., Persson, D., Karlsson, M., Nord&#233;n, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Antennapedia+peptide+penetratin+translocates+across+lipid+bilayers+-+the+first+direct+observation.">The Antennapedia peptide penetratin translocates across lipid bilayers - the first direct observation.</a> FEBS Letters. 482 (3), 265-268 (2000).</li><li>Mishra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+HIV+TAT+peptide+and+analogues+induced+by+multiplexed+membrane+and+cytoskeletal+interactions.">Translocation of HIV TAT peptide and analogues induced by multiplexed membrane and cytoskeletal interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (41), 16883-16888 (2011).</li><li>Rouser, G., Fleischer, S., Yamamoto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+dimensional+thin+layer+chromatographic+separation+of+polar+lipids+and+determination+of+phospholipids+by+phosphorus+analysis+of+spots.">Two dimensional thin layer chromatographic separation of polar lipids and determination of phospholipids by phosphorus analysis of spots.</a> Lipids. 5 (5), 494-496 (1970).</li><li>Bartlett, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorus+assay+in+column+chromatography.">Phosphorus assay in column chromatography.</a> Journal of Biological Chemistry. 234 (3), 466-468 (1959).</li><li>Stewart, J. C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+determination+of+phospholipids+with+ammonium+ferrothiocyanate.">Colorimetric determination of phospholipids with ammonium ferrothiocyanate.</a> Analytical Biochemistry. 104 (1), 10-14 (1980).</li><li>Spinella, S. A., Nelson, R. B., Elmore, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+peptide+translocation+into+large+unilamellar+vesicles.">Measuring peptide translocation into large unilamellar vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3571 (2012).</li><li>Wimley, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+effects+of+membrane-interacting+peptides+on+membrane+integrity.">Determining the effects of membrane-interacting peptides on membrane integrity.</a> Cell-Penetrating Peptides. 1324, 89-106 (2015).</li><li>B&#225;r&#225;ny-Wallje, E., Gaur, J., Lundberg, P., Langel, U., Gr&#228;slund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+membrane+perturbation+caused+by+the+cell+penetrating+peptide+Tp10+depending+on+attached+cargo.">Differential membrane perturbation caused by the cell penetrating peptide Tp10 depending on attached cargo.</a> FEBS Letters. 581 (13), 2389-2393 (2007).</li><li>van Rooijen, B. D., Claessens, M. M. A. E., Subramaniam, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+permeabilization+by+oligomeric+&#945;-Synuclein:+in+search+of+the+mechanism.">Membrane permeabilization by oligomeric &#945;-Synuclein: in search of the mechanism.</a> PloS One. 5 (12), 14292 (2010).</li><li>Hassane, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+cellular+trafficking+of+splice+redirecting+oligonucleotides+complexed+with+chemically+modified+cell-penetrating+peptides.">Insights into the cellular trafficking of splice redirecting oligonucleotides complexed with chemically modified cell-penetrating peptides.</a> Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 153 (2), 163-172 (2011).</li><li>Asciolla, J. J., Renault, T. T., Chipuk, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examining+BCL-2+family+function+with+large+unilamellar+vesicles.">Examining BCL-2 family function with large unilamellar vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (68), e4291 (2012).</li><li>Grewer, C., Gameiro, A., Mager, T., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+characterization+of+membrane+transport+proteins.">Electrophysiological characterization of membrane transport proteins.</a> Annual Review of Biophysics. 42 (1), 95-120 (2013).</li></ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Der vorgestellte Fluoreszenzlecktest ist eine einfache und schnelle Methode zur Behandlung der Membrandestabilisierung durch zelldurchdringendes Peptid. Einfach zu machen, ermöglicht es auch einen indirekten Vergleich zwischen verschiedenen membranwechselwirkenden Peptiden oder anderen membraninteragierenden Molekülen. In Bezug auf kritische Schritte des Protokolls, da dieser Assay relative Werte zwischen der Baseline (LUVs allein) und der maximalen Fluoreszenzfreisetzung (Triton-Bedingung) liefert, bewerten wir normal...

Nach ihrer Entdeckung in den neunziger Jahren wurden zelldurchdringende Peptide (CPPs) entwickelt, um eine effiziente zelluläre Lieferung von Ladungen durch die Plasmamembran zu fördern1,2. CPPs sind in der Regel kurze Peptide, im Allgemeinen 8 bis 30 Aminosäuren, die eine Vielzahl von Ursprüngen haben. Sie wurden zunächst als "direkt translozierende" Träger definiert, was bedeutet, dass sie in der Lage waren, die Plasmamembran zu überqueren und eine Ladung in Zellen zu übertragen, unabhängig von einem endozytotischen Weg, weder Energiebedarf noch Rezeptorbeteiligung. Weitere Untersuchungen ergaben jedoch, dass diese ersten Beobachtungen hauptsächlich auf eine Fluoreszenzüberschätzung aufgrund des experimentellen Artefakts und/oder auf Fixierungsprotokolle mit Methanol3 zurückzuführen waren. Heutzutage ist es allgemein anerkannt, dass die CPP-Aufnahme sowohl durch Endozytose als auch durch energieunabhängige Translokation4,5,6,7 in Abhängigkeit von verschiedenen Parametern wie der Art der Ladung, der verwendeten Verbindung zwischen CPP und Ladung, der untersuchten Zelllinie usw. erfolgt.
CPPs können als Transfektionsmittel nach zwei Strategien verwendet werden, entweder mit einer chemischen Verbindung (kovalente Strategie) oder elektrostatisch/hydrophobe Wechselwirkungen (nicht-kovalente Strategie) zwischen dem CPP und seiner Ladung8,9,10,11. Obwohl beide Strategien ihre Effizienz beim Zelltransfer mehrerer Ladungen gezeigt haben, ist das Verständnis des Mechanismus der Internalisierung durch CPPs immer noch umstritten und das Gleichgewicht zwischen Endozytosewegen oder direkter Penetration ist immer noch schwer zu messen12,13. Obwohl eine Reihe von experimentellen Werkzeugen und Strategien zur Verfügung stehen, um die Beteiligung endozytärer Prozesse klar zu adressieren, scheint die direkte Translokation jedoch schwieriger zu charakterisieren, da sie diskretere Wechselwirkungen mit Plasmamembrankomponenten impliziert. Biologische Membranen bestehen in der Regel aus zahlreichen Komponenten, von Phospholipiden bis hin zu Membranproteinen, die je nach Zelltyp und/oder Umgebung (Stressbedingungen, Zellteilung usw.) variieren können. Diese Vielfalt der Zusammensetzung und folglich das Fehlen eines universellen zellulären Membranmodells ermöglicht keine Studien in einer einzigen Weise. Um diese Einschränkungen zu umgehen, wurden jedoch schrittweise Ansätze mit künstlichen Membranen oder Membranextrakten entwickelt. Von kleinen unilamellaren Vesikeln bis hin zu Monolayer-Ansätzen war jedes Modell eindeutig relevant, um spezifische Fragen zu beantworten14,15. Unter ihnen bilden große unilamellare Vesikel (LUVs) ein geeignetes Membranimitationsmodell, um Peptid/ Membran-Wechselwirkungen als Schlüsselpunkt im Internalisierungsprozess zu untersuchen.
In diesem Zusammenhang beschreibt das folgende Protokoll die Untersuchung der Auswirkungen von Peptiden und Peptid/Membran-Wechselwirkungen auf die Integrität von LUVs durch die Überwachung sowohl eines anionischen Fluoreszenzfarbstoffs als auch seines entsprechenden polykationischen Quenchers, der in Liposomen verkapselt ist. Dieses Tool wird verwendet, um CPP / Membran-Interaktionen zu untersuchen, um zu verstehen, ob sie in der Lage sind, eine direkte Membrantranslokation durchzuführen. Obwohl dieser LUV-Fluoreszenzleckage-Assay normalerweise zum Vergleich verschiedener membranwechselwirkender Peptide angewendet wird, könnte er auch zur Untersuchung von CPPs-Frachtkonjugaten (kovalente Strategie) und CPP:cargo-Komplexen (nicht-kovalente Strategie) verwendet werden.
Das vorliegende Protokoll wird daher erstmals exemplarisch mit den kürzlich entwickelten Tryptophan (W)- und Arginin (R)-reichen Amphipathischen Peptiden (WRAP)16 veranschaulicht. WRAP ist in der Lage, peptidbasierte Nanopartikel zu bilden, um schnell und effizient kleine interferierende RNA (siRNA) in mehreren Zelllinien zu liefern16. Die Fluoreszenzleckeigenschaften von WRAP-Peptid allein oder siRNA-beladenen WRAP-basierten Nanopartikeln wurden überwacht, um ihren Mechanismus der zellulären Internalisierung zu charakterisieren. Wir zeigten, dass ihr Internalisierungsmechanismus hauptsächlich direkte Translokationbeinhaltete 7. In einem zweiten Beispiel wurde das WRAP-Peptid kovalent mit dem Protein/Protein-interferierenden Peptid iCAL36 (WRAP-iCAL36)17 konjugiert und seine Fähigkeit, Membranen zu destabilisieren, in einem Fluoreszenzleckage-Assay mit iCAL36 verglichen, das mit Penetratin18 (Penetratin-iCAL36), einem weiteren CPP, gekoppelt ist.
Abschließend werden die Vorteile und Grenzen der Methode sowohl aus technologischer Sicht als auch im Hinblick auf die biologische Relevanz diskutiert.

<table><tbody><tr><td>25 mL glass round-bottom flask</td><td>Pyrex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8-aminonaphthalene-1, 3, 6-trisulfonic acid, disodium salt (ANTS)</td><td>Invitrogen</td><td>A350</td><td>Protect from light&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Chloroform&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>288306</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>DOPC (dioleoylphosphatidylcholine)</td><td>Avanti Polar</td><td>850375P</td><td>Protect from air</td></tr><tr><td>Extruder</td><td>Avanti Polar</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>Fluorimeter</td><td>PTI Serlabo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 &amp;micro;L glass syringe</td><td>Hamilton</td><td>705N</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>LabAssay Phospholipid&amp;nbsp;</td><td>WAKO&amp;nbsp;</td><td>296-63801</td><td></td></tr><tr><td>liquid chromatography column</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Carlo Erba</td><td>414902</td><td></td></tr><tr><td>Nuclepore polycarbonate membrane (0.1 &amp;micro;m pore size, 25 mm diameter)</td><td>Whatman</td><td>800309</td><td></td></tr><tr><td>polystyrene cuvette, 10 x 10 x 45 mm</td><td>Grener Bio-One</td><td>614101</td><td></td></tr><tr><td>polystyrene semi-micro cuvette, DLS</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB55924</td><td></td></tr><tr><td>p-xylene-bispyridinium bromide (DPX)</td><td>Invitrogen</td><td>X1525</td><td>Protect from light&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>quartz fluorescence cuvette</td><td>Hellma</td><td>109.004F-QS</td><td></td></tr><tr><td>rotavapor system&amp;nbsp;</td><td>Heidolph</td><td>Z334898</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-50 resin</td><td>Amersham</td><td>17-0042-01</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide (NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chlorid (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator bath USC300T</td><td>VWR</td><td>142-6001</td><td></td></tr><tr><td>Sphingomyelin</td><td>Avanti Polar</td><td>860062P</td><td>Protect from air</td></tr><tr><td>Triton X-100&amp;nbsp;</td><td>Eromedex</td><td>2000-B</td><td></td></tr><tr><td>Zetaziser NanoZS&amp;nbsp;</td><td>Malvern</td><td>ZEN3500</td><td></td></tr></tbody></table>

fluorescent leakage assay to investigate membrane destabilization by cell-penetrating peptide

Zelldurchdringende Peptide (CPPs) sind definiert als Träger, die in der Lage sind, die Plasmamembran zu durchqueren und eine Ladung in Zellen zu übertragen. Eines der wichtigsten gemeinsamen Merkmale, die für diese Aktivität erforderlich sind, ergab sich aus den Wechselwirkungen von CPPs mit der Plasmamembran (Lipide) und insbesondere mit Komponenten der extrazellulären Matrix der Membran selbst (Heparansulfat). Unabhängig von der direkten Translokation oder der endozytoseabhängigen Internalisierung sind Lipiddoppelschichten sowohl auf Der Ebene der Plasmamembran als auch auf der Ebene des intrazellulären Verkehrs (endosomale Vesikel) am Internalisierungsprozess beteiligt. In diesem Artikel stellen wir ein detailliertes Protokoll vor, das die verschiedenen Schritte der Formulierung, Reinigung, Charakterisierung und Anwendung eines großen unilamellaren Vesikels (LUVs) beschreibt, um eine mögliche CPP-Membrandestabilisierung / -interaktion zu erkennen und ihre Rolle im Internalisierungsmechanismus zu adressieren. LUVs mit einer Lipidzusammensetzung, die den Plasmamembrangehalt widerspiegelt, werden erzeugt, um sowohl einen Fluoreszenzfarbstoff als auch einen Quencher zu verkapseln. Die Zugabe von Peptiden im extravesikulären Medium und die Induktion von Peptid-Membran-Wechselwirkungen auf den LUVs könnten somit dosisabhängig eine signifikante Erhöhung der Fluoreszenz induzieren, die eine Leckage aufdeckt. Hier werden Beispiele mit den kürzlich entwickelten Tryptophan (W)- und Arginin (R)-reichen amphipathischen Peptiden (WRAPs) geliefert, die eine schnelle und effiziente siRNA-Abgabe in verschiedenen Zelllinien zeigten. Schließlich werden die Art dieser Wechselwirkungen und die Affinität zu Lipiden diskutiert, um die Membrantranslokation und/oder den endosomalen Entweicher zu verstehen und zu verbessern.

Das Prinzip des Fluoreszenzleckage-Assays ist in Abbildung 1 dargestellt. Im Detail werden große einlamellare Vesikel (LUVs), die einen fluoreszierenden Farbstoff und einen Quencher (kein Fluoreszenzsignal) verkapseln, mit dem biomolekularen Wirkstoff behandelt. Durch die Wechselwirkung des Peptids mit Lipidmembranen, die Membranpermeabilität, Reorganisation oder sogar Ruptur implizieren könnte, werden der Fluoreszenzfarbstoff und der Quencher aus den LUVs...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Leakage Assay to Investigate Membrane Destabilization by Cell-Penetrating Peptide at JoVE.com

Fluorescent Leakage Assay to Investigate Membrane Destabilization by Cell-Penetrating Peptide

Der Fluoreszenz-Leckage-Assay ist eine einfache Methode, die die Untersuchung von Peptid/Membran-Wechselwirkungen ermöglicht, um ihre Beteiligung an mehreren biologischen Prozessen und insbesondere die Fähigkeit von zelldurchdringenden Peptiden zu verstehen, Phospholipide-Doppelschichten während eines direkten zellulären Translokationsprozesses zu stören.

Fluoreszenz-Leckage-Assay zur Untersuchung der Membrandestabilisierung durch zelldurchdringendes Peptid

Cell-penetrating peptides (CPPs) are defined as carriers that are able to cross the plasma membrane and to transfer a cargo into cells. One of the main ...

fluorescent-leakage-assay-to-investigate-membrane-destabilization

Research

JoVE Journal

Biochemistry

6.2K Aufrufe.  INSERM U1046 - CNRS UMR 9214 - University of Montpellier. Der Fluoreszenz-Leckage-Assay ist eine einfache Methode, die die Untersuchung von Peptid/Membran-Wechselwirkungen ermöglicht, um ihre Beteiligung an mehreren biologischen Prozessen und insbesondere die Fähigkeit von zelldurchdringenden Peptiden zu verstehen, Phospholipide-Doppelschichten während eines direkten zellulären Translokationsprozesses zu stören.

Serie: Fluorescent Leakage Assay to Investigate Membrane Destabilization by Cell-Penetrating Peptide

Construction of Cyclic Cell-Penetrating Peptides for Enhanced Penetration of Biological Barriers

Cancer has been a grand challenge in global health. However, the complex tumor microenvironment generally limits the access of therapeutics to deeper tumor cells, leading to tumor recurrence. To conquer the limited penetration of biological barriers, cell-penetrating peptides (CPPs) have been discovered with excellent membrane translocation ability and have emerged as useful molecular transporters for delivering various cargoes into cells. However, conventional linear CPPs generally show compromised proteolytic stability, which limits their permeability across biological barriers. Thus, the development of novel molecular transporters that can penetrate biological barriers and exhibit enhanced proteolytic stability is highly desired to promote drug delivery efficiency in biomedical applications. We have previously synthesized a panel of short cyclic CPPs with aromatic crosslinks, which exhibited superior permeability in cancer cells and tissues compared to their linear counterparts. Here, a concise protocol is described for the synthesis of the fluorescently labeled cyclic polyarginine R8 peptide and its linear counterpart, as well as key steps for investigating their cell permeability.

This protocol describes the synthesis of cyclic cell-penetrating peptides with aromatic cross-links and the evaluation of their permeability across biological barriers.

Konstruktion zyklischer zellpenetrierender Peptide zur verbesserten Durchdringung biologischer Barrieren

Cancer has been a grand challenge in global health. However, the complex tumor microenvironment generally limits the access of therapeutics to deeper ...

Forschung

Chemie

Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope

Numerous pathophysiological insults can cause damage to cell membranes and, when coupled with innate defects in cell membrane repair or integrity, can result in disease. Understanding the underlying molecular mechanisms surrounding cell membrane repair is, therefore, an important objective to the development of novel therapeutic strategies for diseases associated with dysfunctional cell membrane dynamics. Many in vitro and in vivo studies aimed at understanding cell membrane resealing in various disease contexts utilize two-photon laser ablation as a standard for determining functional outcomes following experimental treatments. In this assay, cell membranes are subjected to wounding with a two-photon laser, which causes the cell membrane to rupture and fluorescent dye to infiltrate the cell. The intensity of fluorescence within the cell can then be monitored to quantify the cell's ability to reseal itself. There are several alternative methods for assessing cell membrane response to injury, as well as great variation in the two-photon laser wounding approach itself, therefore, a single, unified model of cell wounding would beneficially serve to decrease the variation between these methodologies. In this article, we outline a simple two-photon laser wounding protocol for assessing cell membrane repair in vitro in both healthy and dysferlinopathy patient fibroblast cells transfected with or without a full-length dysferlin plasmid.

Cell membrane wounding via two-photon laser is a widely used method for assessing membrane resealing ability and can be applied to multiple cell types. Here, we describe a protocol for in vitro live-imaging of membrane resealing in dysferlinopathy patient cells following two-photon laser ablation.

Zellmembran Reparatur Assays mit einem zwei-Photonen-Laser-Mikroskop

Numerous pathophysiological insults can cause damage to cell membranes and, when coupled with innate defects in cell membrane repair or integrity, can ...

Immunologie und Infektion

Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1. Many of these are referred to as cell-penetrating peptides, which are frequently noted for their potential as drug delivery vectors1-3. Moreover, there is increasing interest in antimicrobial peptides that operate via non-membrane lytic mechanisms4,5, particularly those that cross bacterial membranes without causing cell lysis and kill cells by interfering with intracellular processes6,7. In fact, authors have increasingly pointed out the relationship between cell-penetrating and antimicrobial peptides1,8. A firm understanding of the process of membrane translocation and the relationship between peptide structure and its ability to translocate requires effective, reproducible assays for translocation. Several groups have proposed methods to measure translocation into large unilamellar lipid vesicles (LUVs)9-13. LUVs serve as useful models for bacterial and eukaryotic cell membranes and are frequently used in peptide fluorescent studies14,15. Here, we describe our application of the method first developed by Matsuzaki and co-workers to consider antimicrobial peptides, such as magainin and buforin II16,17. In addition to providing our protocol for this method, we also present a straightforward approach to data analysis that quantifies translocation ability using this assay. The advantages of this translocation assay compared to others are that it has the potential to provide information about the rate of membrane translocation and does not require the addition of a fluorescent label, which can alter peptide properties18, to tryptophan-containing peptides. Briefly, translocation ability into lipid vesicles is measured as a function of the Foster Resonance Energy Transfer (FRET) between native tryptophan residues and dansyl phosphatidylethanolamine when proteins are associated with the external LUV membrane (Figure 1). Cell-penetrating peptides are cleaved as they encounter uninhibited trypsin encapsulated with the LUVs, leading to disassociation from the LUV membrane and a drop in FRET signal. The drop in FRET signal observed for a translocating peptide is significantly greater than that observed for the same peptide when the LUVs contain both trypsin and trypsin inhibitor, or when a peptide that does not spontaneously cross lipid membranes is exposed to trypsin-containing LUVs. This change in fluorescence provides a direct quantification of peptide translocation over time.

This protocol details a method for the quantitative measure of peptide translocation into large unilamellar lipid vesicles. This method also provides information about the rate of membrane translocation and can be used to identify peptides that efficiently and spontaneously cross lipid bilayers.

Mess-Peptide Translokation in große unilamellare Vesikel

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1.  Many of these are referred ...

Biologie

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein-basierte Screening Expression von Membranproteinen in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established for many membrane proteins. A simple technique called fluorescence protease protection (FPP) is presented, which permits the determination of membrane protein topology in living cells. This technique has numerous advantages over other methods for determining protein topology, in that it does not require the availability of multiple antibodies against various domains of the membrane protein, does not require large amounts of protein, and can be performed on living cells. The FPP method employs the spatially confined actions of proteases on the degradation of green fluorescent protein (GFP) tagged membrane proteins to determine their membrane topology and orientation. This simple approach is applicable to a wide variety of cell types, and can be used to determine membrane protein orientation in various subcellular organelles such as the mitochondria, Golgi, endoplasmic reticulum and components of the endosomal/recycling system. Membrane proteins, tagged on either the N-termini or C-termini with a GFP fusion, are expressed in a cell of interest, which is subject to selective permeabilization using the detergent digitonin. Digitonin has the ability to permeabilize the plasma membrane, while leaving intracellular organelles intact. GFP moieties exposed to the cytosol can be selectively degraded through the application of protease, whereas GFP moieties present in the lumen of organelles are protected from the protease and remain intact. The FPP assay is straightforward, and results can be obtained rapidly.

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection FPP

Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP.

Bestimmen Membrane Protein Topologie Mit Fluorescence Protease Schutz (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established ...

Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded proteins may serve as potential therapeutic targets. To distinguish degradation of misfolding-prone proteins from other mechanisms that regulate their levels, one important method is to measure protein half-life in cells. However, this can be challenging because misfolding-prone proteins may exist in different forms, including the native form and misfolded forms of distinct characteristics. Here we describe assays to examine the half-life of misfolded proteins in mammalian cells using a highly aggregation-prone protein, Ataxin-1 with an extended polyglutamine (polyQ) stretch, and a conformationally unstable luciferase mutant as models. Cycloheximide chase is combined with cell fractionation to examine the turnover rate of misfolding-prone proteins in various cellular fractions. We further depict a fluorescence-based assay using an enhanced green fluorescence protein (EGFP)-fusion of the luciferase mutant, which can be adapted for high throughput screening on a microplate-reader.

This report describes protocols for measuring degradation rates of misfolded proteins by either western blot or fluorescence-based assays. The methods can be applied to analysis of other misfolded proteins and for high throughput screening.

Assays für den Abbau fehlgefalteter Proteine ​​in Zellen

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded ...

Utilizing pHluorin-tagged Receptors to Monitor Subcellular Localization and Trafficking

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular organelles and those localized on the plasma membrane. Traditional fluorescence-based measurements lack the capability to distinguish membrane proteins residing in different organelles. Cutting edge methodologies transcend traditional methods by coupling pH-sensitive fluorophores with total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). TIRF illumination excites the sample up to approximately 150 nm from the glass-sample interface, thus decreasing background, increasing the signal to noise ratio, and enhancing resolution. The excitation volume in TIRFM encompasses the plasma membrane and nearby organelles such as the peripheral ER. Superecliptic pHluorin (SEP) is a pH sensitive version of GFP. Genetically encoding SEP into the extracellular domain of a membrane protein of interest positions the fluorophore on the luminal side of the ER and in the extracellular region of the cell. SEP is fluorescent when the pH is greater than 6, but remains in an off state at lower pH values. Therefore, receptors tagged with SEP fluoresce when residing in the endoplasmic reticulum (ER) or upon insertion in the plasma membrane (PM) but not when confined to a trafficking vesicle or other organelles such as the Golgi. The extracellular pH can be adjusted to dictate the fluorescence of receptors on the plasma membrane. The difference in fluorescence between TIRF images at neutral and acidic extracellular pH for the same cell corresponds to a relative number of receptors on the plasma membrane. This allows a simultaneous measurement of intracellular and plasma membrane resident receptors. Single vesicle insertion events can also be measured when the extracellular pH is neutral, corresponding to a low pH trafficking vesicle fusing with the plasma membrane and transitioning into a fluorescent state. This versatile technique can be exploited to study localization, expression, and trafficking of membrane proteins.

Labeling the extracellular domain of a membrane protein with a pH sensitive fluorophore, superecliptic pHluorin (SEP), allows subcellular localization, expression, and trafficking to be determined. Imaging SEP-labeled proteins with total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) enables the quantification of protein levels in the peripheral ER and plasma membrane.

pHluorin-getaggt Receptors Verwendung zu überwachen subzelluläre Lokalisierung und Handel

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular ...

Fluorescence Microplate-Based Cycloheximide Chase Assay: A Technique to Monitor the Degradation Kinetics of Fluorescent Nuclear Misfolded Proteins

Source: Guo, L. et. al., <a href="https://app.jove.com/v/54266">Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells.</a> J. Vis. Exp. (2016)
This video describes an in vitro fluorescence-based microplate assay to study the degradation kinetics of a fluorescently-labeled misfolded luciferase mutant protein expressed in the nuclei of transfected mammalian cells. The assay involves the treatment of cells expressing the fluorescent mutant protein with a translation inhibitor and a proteasome inhibitor to assess the proteasome-mediated degradation of the misfolded protein.

Fluoreszenz-Mikroplatten-basierter Cycloheximid-Chase-Assay: Eine Technik zur Überwachung der Abbaukinetik von fluoreszierenden nuklearen fehlgefalteten Proteinen

Source: Guo, L. et. al., Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells. J. Vis. Exp. (2016)
This video describes an in vitro ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biological Techniques

Assay Techniques

Biochemical assays

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen the Proteolytic Activity of Proteases

Source: Jaimes, J. A., et al. <a href="https://app.jove.com/v/58892">A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation.</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video demonstrates an assay to screen for the proteolytic activity of proteases using fluorogenic peptides. The protease recognizes its cleavage site on the peptide, cleaving it and separating the quencher from the fluorophore, enabling its fluorescence emission. The fluorescence signal is detected and analyzed to check for the cleavage efficiency of different peptide variants.

Ein fluorogener Peptidspaltungsassay zum Screening der proteolytischen Aktivität von Proteasen

1. Designing and Preparing the Peptides

	Acquire the sequence of the fusion protein of interest from a public database such as NCBI ...

Immunology

Immunodiagnostics

Specialized Assays

Fluorescence Leakage Assay to Study Cell-Penetrating Peptide Interaction with Membrane

Source: Konate, K. et al. <a href="https://app.jove.com/v/62028">Fluorescent Leakage Assay to Investigate Membrane Destabilization by Cell-Penetrating Peptide.</a> J. Vis. Exp. (2020)
This video discusses the fluorescence leakage assay to study the interactions of cell-penetrating peptides with cell membranes using cell membrane mimics &#8212; large unilamellar vesicles, or LUVs, encapsulated with a fluorescent dye and a quencher.

Fluoreszenz-Leckage-Assay zur Untersuchung der zellpenetrierenden Peptidinteraktion mit der Membran

Source: Konate, K. et al. Fluorescent Leakage Assay to Investigate Membrane Destabilization by Cell-Penetrating Peptide. J. Vis. Exp. (2020)
This video ...

Fluoreszenz-Leckage-Assay zur Untersuchung der Membrandestabilisierung durch zelldurchdringendes Peptid

Zusammenfassung

Weitere Videos entdecken

Kapitel in diesem Video

Konstruktion zyklischer zellpenetrierender Peptide zur verbesserten Durchdringung biologischer Barrieren

Zellmembran Reparatur Assays mit einem zwei-Photonen-Laser-Mikroskop

Mess-Peptide Translokation in große unilamellare Vesikel

Green Fluorescent Protein-basierte Screening Expression von Membranproteinen in

Bestimmen Membrane Protein Topologie Mit Fluorescence Protease Schutz (FPP)

Assays für den Abbau fehlgefalteter Proteine in Zellen

pHluorin-getaggt Receptors Verwendung zu überwachen subzelluläre Lokalisierung und Handel

Fluoreszenz-Mikroplatten-basierter Cycloheximid-Chase-Assay: Eine Technik zur Überwachung der Abbaukinetik von fluoreszierenden nuklearen fehlgefalteten Proteinen

Ein fluorogener Peptidspaltungsassay zum Screening der proteolytischen Aktivität von Proteasen

Fluoreszenz-Leckage-Assay zur Untersuchung der zellpenetrierenden Peptidinteraktion mit der Membran

Fluoreszenz-Leckage-Assay zur Untersuchung der Membrandestabilisierung durch zelldurchdringendes Peptid

Zusammenfassung

Weitere Videos entdecken

Kapitel in diesem Video

Konstruktion zyklischer zellpenetrierender Peptide zur verbesserten Durchdringung biologischer Barrieren

Zellmembran Reparatur Assays mit einem zwei-Photonen-Laser-Mikroskop

Mess-Peptide Translokation in große unilamellare Vesikel

Green Fluorescent Protein-basierte Screening Expression von Membranproteinen in

Bestimmen Membrane Protein Topologie Mit Fluorescence Protease Schutz (FPP)

Assays für den Abbau fehlgefalteter Proteine ​​in Zellen

pHluorin-getaggt Receptors Verwendung zu überwachen subzelluläre Lokalisierung und Handel

Fluoreszenz-Mikroplatten-basierter Cycloheximid-Chase-Assay: Eine Technik zur Überwachung der Abbaukinetik von fluoreszierenden nuklearen fehlgefalteten Proteinen

Ein fluorogener Peptidspaltungsassay zum Screening der proteolytischen Aktivität von Proteasen

Fluoreszenz-Leckage-Assay zur Untersuchung der zellpenetrierenden Peptidinteraktion mit der Membran

Assays für den Abbau fehlgefalteter Proteine in Zellen