Yazarlar, makalenin eleştirel incelemesi için Emilie Josse'ye teşekkür eder. Bu çalışma "La Ligue contre le Cancer", "Fondation ARC pour la Recherche sur le Cancer" ve "Centre National de la Recherche Scientifique" (CNRS) vakfı tarafından desteklendi.

1. Büyük Unilamellar Vezikles (LUVs) hazırlanması
<ol><li>Luv'ları floresan sızıntı tahlilleri için hücre zarı taklitleri olarak kullanımları için hazırlayın.</li>
	<li>Hamilton cam şırıngar fosfatidylcholine (DOPC, 786.11 g/mol), sphingomyelin (SM, 760.22 g/mol) ve Kolesterol (Chol, 386.65 g/mol) ile molar oranında 4:4:2 karıştırın. Lipid çözeltisi, 25 mL'lik cam yuvarlak alt şişede 25 mg/mL'de bir metanol/kloroform (3/1; hacim/hacim) çözücüde çözünen her lipitin stok çözeltisinden elde edilir. 4 μmol DOPC, 4 μmol SM ve 2 μmol Chol'a dayanan lipid çözeltisi, sırasıyla 126 μL, 117 μL ve 31 μL karıştırılarak stok çözeltisinden elde edilir. DİkKAT: Metanol toksik ve yanıcı bir çözücüdür ve kloroform toksik ve kanserojendir. Her ikisi de bir başlık altında uygun koruma ile ele alınmalıdır.</li>
	<li>Kurutulmuş bir lipit filmi oluşana kadar 60 °C'de 45-60 dakika boyunca vakum altında bir döner evaporatör kullanarak metanol / kloroform buharlaştırın.</li>
	<li>İki stok HEPES tampon çözümü hazırlayın. 20 mM HEPES (238,3 g/mol) ve 75 mM NaCl (58,44 g/mol) karıştırarak HEPES tampon 1'i hazırlayın ve pH'ı 7,4'e ayarlayın. 20 mM HEPES ve 145 mM NaCl karıştırarak HEPES tampon 2'yi hazırlayın ve pH'ı 7,4'e ayarlayın. HEPES tamponları 1 ay boyunca 4 °C'de saklanabilir. NOT: Bir kilometre sayacı kullanarak tamponların ozmolaritesinin kontrol etmesi önerilir.</li>
	<li>Membran geçirimsiz floresan boya-quencher çiftini çözerek lipid hidrasyon çözeltisi hazırlayın, HEPES tampon çözeltisinde 8-aminonaftafen-1, 3, 6-trisülfiyonik asit, 12,5 mM'de disodium tuzu (ANTS, 427,33 g/mol) ve 45 mM'de p-ksilen-bispyridinium bromür (DPX, 422,16 g/mol). ANTS'ı DPX ile karıştırmak sarı renkli bir çözeltiye yol açar. 12,5 mM ANTS ve 45 mM DPX konsantrasyonlarına ulaşmak için, 4 mL HEPES tampon 1'de sırasıyla 21,4 mg ve 76 mg çözün. NOT: Lipid hidrasyon çözeltisi, tüpün alüminyum folyo ile sarılmasıyla 4 °C'de 2 hafta saklanabilir.</li>
	<li>Kurutulmuş lipid filmini lipid hidrasyon çözeltisinin 1 mL'si ile yeniden canlandırarak ve kurutulmuş lipid filminin çözünmesine kadar girdaplayarak çokmeller veziklinleri (MLV) yeniden oluşturun. Küçük lipid agregaları önceki adımları olumsuz etkileyeceğinden çözümün tamamen çözündüğünden emin olun. Ayrıca, kalan lipit filmi olmadığından emin olmak için cam yuvarlak alt şişenin duvarını kontrol edin. NOT: Çözelti, çözünürleşmeden sonra opalescent ve açık sarı görünecektir.</li>
	<li>Unilamellar vesicles elde etmek için veziklikleri beş dondurma/çözme döngüsüne tabi edin. Her döngüyü, dondurma adımı için 30 s sıvı nitrojene 30 sn boyunca cam yuvarlak alt şişe koyarak, ardından çözme adımı için 2 dakika boyunca bir su banyosunda bırakarak gerçekleştirin. NOT: Banyo suyunun sıcaklığı lipitlerin erime sıcaklığından 5-10°C daha yüksek olmalıdır.</li>
	<li>Metal ekstrüder kutusuna yerleştirilen her politetrafloroetilen (PTFE) ekstrüder parçasına HEPES tamponu ile ön nemlendirilmiş iki filtre desteği yerleştirerek lipid ekstrüder hazırlayın.</li>
	<li>Bir filtre desteğinin üstüne HEPES nemlendirilmiş polikarbonat membran (0,1 μm gözenek boyutu, 25 mm çapında) koyun.</li>
	<li>İki metal ekstrüder bidonlarını monte edin ve vidalayın.</li>
	<li>Monte edilen ekstrüderi tutucuya yerleştirin ve her politetrafloroetilen ekstrüder parçasının ekstremitesinde uygun deliğe 1 mL şırıngır sokun. Ekstrüzyon, bir şırıncadan diğerine test edilen sıvının polikarbonat membrandan geçişine karşılık gelir.</li>
	<li>Sızıntı veya sorun olmadığından emin olmak için ekstrüderi 1 mL şırınnadan birine yüklenmiş 1 mL HEPES tamponu ile test edin.</li>
	<li>1 mL HEPES tamponu MLV örneği ile değiştirin.</li>
	<li>MLV örneğini bir şırıncadan diğerine polikarbonat membrandan en az 21 kez geçirerek aynı boyutta düzgün SUV'ler elde ederek ekstrüzyon gerçekleştirin. NOT: Ekstrüzyon lipit karışımının erime sıcaklığından daha yüksek bir sıcaklıkta yapılmalıdır.</li>
</ol>2. LUV'ların Saflaştırılması
<ol><li>Kapsüllenmemiş ANTS ve DPX fazlalığını gidermek için bir sütun saflaştırması hazırlayın.</li>
	<li>Sıvı kromatografi sütununda (Luer Lock, Ceketsiz, 1,0 cm x 20 cm, yatak hacmi 16 mL) sütun renksiz kısmının 1 cm altına kadar %0,01 NaN3 (65 g/mol) ile sulu ortamda yeniden sulanan çapraz bağlı dektran jelini (G-50) tanıtın.</li>
	<li>Musluğu açın ve çapraz bağlı dektran jelini yerleştirmek için sıvının akmasına izin verin.</li>
	<li>20 mL HEPES arabelleği 2 ile eluting yaparak sütunu yıkayın ve sütunun çıkış akışını atın.</li>
	<li>Kolonun üzerindeki ölü çözücü hacmi en aza indirildikten sonra (<100 μL) ancak çapraz bağlı dektran jelinin kurumasını önlemek için yeterli olduğunda musluğu kapatın.</li>
	<li>Yeni ekstrüde LUV'ları (sarı) sütuna yerleştirin ve çapraz bağlı dektran jeline girmelerine izin verin.</li>
	<li>LUV saflaştırmasını gerçekleştirmek için sütuna sürekli hepes arabelleği 2 ekleyin.</li>
	<li>Yaklaşık 2 mL HEPES tampon 2'yi boşaltın (çapraz bağlı dektran jelinin kurumasını önlemek için sütunun üst kısmını düzenli olarak doldurmayı unutmayın): serbest sarı ANTS ve DPX çözeltisi lipozomlardan daha yavaş göç eder.</li>
	<li>Saflaştırılmış LUV'ları tüplerde toplamaya başlayın (1,5 mL).</li>
	<li>Sütundan gelen yılan balığı damlalarını gözlemleyin ve opalescent olduklarında lipozomlar içerirler. LUV içeren fraksiyonu kurtarmak için tüpü değiştirin.</li>
	<li>Damlalar artık opalescent olmayana kadar elute (~1 mL). Daha sonra, ayrı bir kesirde 0,5 mL daha elute edin ve sonra kaçmayı bırakın. NOT: Standartlar artık LUV'ların elüasyon hacmini kalibre etmek için kitler veya bireysel moleküler ağırlıklar olarak çok çeşitli moleküler ağırlıklarda mevcuttur.</li>
	<li>Floresan boyasının ağartılmasını önlemek için tüpleri LÜV'lerle birlikte alüminyum folyoya sarın.</li>
	<li>Kolonu 20 mL HEPES tampon 2 ile yıkayın.</li>
	<li>SUV'ler daha sonra 4 °C'de bir hafta saklanabilir. NOT: LUV stabilitesi LUV konsantrasyonuna ve bileşimine ve iyonik mukavemete bağlı olabileceğinden, LUV'lerin boyutu dinamik bir ışık saçılma (DLS) cihazı kullanılarak kontrol edilmelidir (bkz. bölüm 4). LUV Boyutunun ve Homojenliğin Karakterizasyonu) her test öncesi.</li>
</ol>3. LUV konsantrasyonunun ölçülmesi
<ol><li>Kolin konsantrasyonunun değerlendirilmesini sağlayan fosfolipid nicelleştirme kiti ile LUV konsantrasyonunun tahmin edilmesi19. Bu test, polar kafa içeren kolin içeren fosfolipidler önemli olduğunda uygulanabilir (7'lerin% >50'si).</li>
	<li>Sağlanan 3 mL tamponda 18 mg kromojen substratını eriterek renk reaktifini hazırlayın.</li>
	<li>3 mL renkli reaktif ile 10 x 10 x 45 mm'lik bir polistiren cuvette yükleyin.</li>
	<li>Saf renk reaktifini boş koşul olarak kullanın (Boş). 20 μL LUV numunesi (Test) veya 20 μL bilinen kolin konsantrasyonu standart çözeltisi (Standart) ekleyin.</li>
	<li>İyice karıştırın ve 37 °C'de tüm koşullarda (Boş, Test ve Standart) 5 dakika kuluçkaya yatırarak kuluçkaya yatırarak.</li>
	<li>Test numunesinin ve standart çözümün emiciliğini (optik yoğunluk, OD) bir spektrofotometre ile 600 nm'de kontrol olarak boş çözelti ile ölçün.</li>
	<li>BILINEN konsantrasyon standardına kıyasla LUV'ların lipid konsantrasyonu olan C[LUV]'un kolin eşdeğerini tahmin etmeyi sağlayan OD değerlerini kontrol edin.</li>
	<li>Aşağıdaki denklemi kullanarak hesaplamayı gerçekleştirin: C[LUV] (mol / l) = (OD Örneği / OD Standardı) x C[Standart] (mol / l) NOT: Fosfolipid nicelleştirme kiti, C[Standart] = 3.87 mmol/L molar konsantrasyonuna karşılık gelen 54 mg/dL'de Kolin Klorür (139.6 mg/l) standart çözeltisi sağlamıştır.</li>
</ol>4. LUV boyutunun ve homojenliğinin karakterizasyonu
<ol><li>LUV boyutunu (nm cinsinden) ve çok disiplinlilik indeksini (PdI) belirlemek için bir DLS cihazı kullanarak ölçüm gerçekleştirin.</li>
	<li>Çözücü/tamponun ve kullanılan cuvette'in viskozitesini belirterek uygun "standart çalışma prosedürünü" (SÇP) programlayın.</li>
	<li>LUV çözeltisinin 500 μL'sini bir polistiren yarı mikro cuvette yerleştirin.</li>
	<li>Polistiren yarı mikro cuvette'i bir DLS cihazına yerleştirin.</li>
	<li>Oda sıcaklığında, boyut dağılımını parçacık dağılımının ortalama büyüklüğü (Z-ortalama) ve homojenlik (polidisperlik indeksi, PdI) açısından ölçün.</li>
	<li>Tüm sonuçlar, her biri üç tekrarlayan döngüde gerçekleştirilen iki bağımsız ölçümden elde edilir. NOT: 0,149 ± 0,041 PDI ile 137 ± 7 nm ortalama boyutlarında olacaktır.</li>
</ol>5. Peptit çözeltileri hazırlama
<ol><li>Sızıntı tahlil için analiz edilmesi gereken peptitin bir stok çözeltisini hazırlayın.</li>
	<li>Peptit tozluğunu (%>95 saflıkta) saf suda çözün (örneğin, 500 μL saf suda 1 mg peptit). NOT: Peptitlerin saf suda seyreltilmeleri ve eserleri teşvik edebilecek dimetil sülfit (DMSO) çözünürlüğünden kaçınmanız önerilir (örneğin, membran permeabilizasyonu20).</li>
	<li>Vortex 5 s için peptit çözeltisi.</li>
	<li>Peptit çözeltisini bir su sonikasyon banyosunda 5 dakika ve daha sonra 12.225 x g'da5 dakika santrifüjde sonicate edin. Konsantrasyon tespiti için süpernatant toplayın.</li>
	<li>Emiciliği üç bağımsız peptit seyreltmenin 280 nm'sinde ölçün ve ardından molar yok olma katsayısı ε (peptit dizisindeki triptofan ve tirozin içeriğine bağlı olarak) ve Bira-Lambert kuralını kullanarak peptit konsantrasyonunu hesaplayın. NOT: Peptit triptofan ve tirozin içeriyorsa, molar yok olma katsayısı ε Triptofan ε = 5.690 M-1cm-1 ve Tirozin ε = 1.280 M-1cm-1temel alınarak hesaplanır. Peptit dizisi triptofan veya tirozin içermezse, konsantrasyonu ölçmek için başka kolorimetrik test yapılabilir (örneğin, BCA veya Bradford).</li>
	<li>Peptit çözeltisini saf suda 100 μM'lik nihai bir çözeltiye seyreltin ve 4 °C'de saklayın. NOT: Saf suda, 4 °C depolama sırasında peptit bozulması meydana gelmez. Bununla birlikte, su buharlaşmasının oluşmamasını sağlamak için peptit konsantrasyonu her 2 haftada bir ölçülmelidir.</li>
</ol>6. Floresan sızıntı tahlil
<ol><li>Floresan sızıntı tahlili oda sıcaklığında spektrofluorometre üzerinde ölçülür. Ekscitasyon ve emisyon dalga boyu sırasıyla Ex = 360 nm ± 3 nm ve Em = 530 nm ± 5 nm olarak sabitlenir.</li>
	<li>1 mL HEPES tampon 2'deki LUV'ları kuvars floresan cuvette 100 μM'lik son konsantrasyona seyreltin. Deney sırasında çözeltiyi homojenize etmek için manyetik bir karıştırıcı ekleyin.</li>
	<li>Arka plan floresanlarına erişmek için luv'ları ilk 100 s boyunca t = 0 s ve t = 99 s arasında tek başına ölçün. NOT: Arka plan floresan ve potansiyel sızıntılara erişmek için tüm deney sırasında (15 dk) tek başına LUV'lar da ölçülebilir.</li>
	<li>Bundan sonra, sızıntıyı, sonraki 900 s (15 dk) için peptit çözeltisinin aliquotlarının eklenmesi üzerine floresan yoğunluğunda bir artış olarak ölçün. Bu protokol, 0,1 μM ila 2,5 μM arasında test edilen her peptit konsantrasyonu için gerçekleştirilir.</li>
	<li>Son olarak, 1 μL Triton X-100 (%0,1, v/v) eklenerek LUV'ların çözünmesiyle %100 floresan elde edildi ve bu da t = 1.000 s ile t = 1.100 s arasında tamamen söndürülmemiş prob ile sonuçlandı.</li>
</ol>7. Sızıntının nicelleştirilmesi
<ol><li>Test edilen her koşul için aynı sayıda noktayı korumak için t = 1.090 sn'den sonra elde edilen değerleri bastırın.</li>
	<li>T = 0 s ve t = 49 s (yalnızca LUV'lar) arasında ortalama 50 puan yaparak minimum floresan, Fdk'yı hesaplayın.</li>
	<li>T = 1.041 s ve t = 1.090 s (Triton X-100 ile LUV'lar) arasında ortalama 50 puan yaparak maksimum floresan, Fmaks.</li>
	<li>Aşağıdaki denkleme göre, her zaman noktasında (t = x) sızıntı yüzdesini (%Sızıntı) hesaplayın: %Sızıntı(t=x) = (F(t=x) - Fdk) / (Fmaks . - Fdk) x 100</li>
	<li>Aynı koşul için farklı LUV hazırlığı (n ≥ 2) ile elde edilen değerler için ortalama ve standart sapmayı hesaplayın.</li>
	<li>%Leak(t=x)sızıntı yüzdesini zaman (lar) işlevinde çizin.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Langel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Cell-Penetrating Peptides. , (2006).</li><li>Deshayes, S., Morris, M. C., Divita, G., Heitz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-penetrating+peptides:+tools+for+intracellular+delivery+of+therapeutics.">Cell-penetrating peptides: tools for intracellular delivery of therapeutics.</a> Cellular and Molecular Life Sciences CMLS. 62 (16), 1839-1849 (2005).</li><li>Richard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-penetrating+peptides.+A+reevaluation+of+the+mechanism+of+cellular+uptake.">Cell-penetrating peptides. A reevaluation of the mechanism of cellular uptake.</a> The Journal of Biological Chemistry. , (2003).</li><li>Jones, A., Sayers, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+entry+of+cell+penetrating+peptides:+tales+of+tails+wagging+dogs.">Cell entry of cell penetrating peptides: tales of tails wagging dogs.</a> Journal of Controlled Release Official Journal of the Controlled Release Society. , (2012).</li><li>T&#252;nnemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+analysis+of+cell+penetration+ability+and+toxicity+of+oligo-arginines.">Live-cell analysis of cell penetration ability and toxicity of oligo-arginines.</a> Journal of Peptide Science. 14 (4), 469-476 (2008).</li><li>Jiao, C. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+and+endocytosis+for+cell-penetrating+peptide+internalization.">Translocation and endocytosis for cell-penetrating peptide internalization.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (49), 33957-33965 (2009).</li><li>Deshayes, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+internalization+mechanism+of+WRAP:siRNA+nanoparticles.">Deciphering the internalization mechanism of WRAP:siRNA nanoparticles.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. Biomembranes. 1862 (6), 183252 (2020).</li><li>Konate, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimisation+of+vectorisation+property:+A+comparative+study+for+a+secondary+amphipathic+peptide.">Optimisation of vectorisation property: A comparative study for a secondary amphipathic peptide.</a> International Journal of Pharmaceutics. 509 (1-2), 71-84 (2016).</li><li>Lehto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+trafficking+determines+the+exon+skipping+activity+of+Pip6a-PMO+in+mdx+skeletal+and+cardiac+muscle+cells.">Cellular trafficking determines the exon skipping activity of Pip6a-PMO in mdx skeletal and cardiac muscle cells.</a> Nucleic Acids Research. 42 (5), 3207-3217 (2014).</li><li>Hoyer, J., Neundorf, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+vectors+for+the+nonviral+delivery+of+nucleic+acids.">Peptide vectors for the nonviral delivery of nucleic acids.</a> Accounts of Chemical Research. 45 (7), 1048-1056 (2012).</li><li>Milletti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-penetrating+peptides:+classes,+origin,+and+current+landscape.">Cell-penetrating peptides: classes, origin, and current landscape.</a> Drug Discovery Today. 17 (15-16), 850-860 (2012).</li><li>Mueller, J., Kretzschmar, I., Volkmer, R., Boisguerin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+cellular+uptake+using+22+CPPs+in+4+different+cell+lines.">Comparison of cellular uptake using 22 CPPs in 4 different cell lines.</a> Bioconjugate Chemistry. 19 (12), 2363-2374 (2008).</li><li>Ramaker, K., Henkel, M., Krause, T., R&#246;ckendorf, N., Frey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+penetrating+peptides:+a+comparative+transport+analysis+for+474+sequence+motifs.">Cell penetrating peptides: a comparative transport analysis for 474 sequence motifs.</a> Drug Delivery. 25 (1), 928-937 (2018).</li><li>Maget-Dana, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+monolayer+technique:+a+potent+tool+for+studying+the+interfacial+properties+of+antimicrobial+and+membrane-lytic+peptides+and+their+interactions+with+lipid+membranes.">The monolayer technique: a potent tool for studying the interfacial properties of antimicrobial and membrane-lytic peptides and their interactions with lipid membranes.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1462 (1-2), 109-140 (1999).</li><li>Alves, A. C., Ribeiro, D., Nunes, C., Reis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysics+in+cancer:+The+relevance+of+drug-membrane+interaction+studies.">Biophysics in cancer: The relevance of drug-membrane interaction studies.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1858 (9), 2231-2244 (2016).</li><li>Konate, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide-based+nanoparticles+to+rapidly+and+efficiently+"Wrap+'n+Roll"+siRNA+into+cells.">Peptide-based nanoparticles to rapidly and efficiently "Wrap 'n Roll" siRNA into cells.</a> Bioconjugate Chemistry. 30 (3), 592-603 (2019).</li><li>Seisel, Q., Pelletier, F., Deshayes, S., Boisguerin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+evaluate+the+cellular+uptake+of+CPPs+with+fluorescence+techniques:+Dissecting+methodological+pitfalls+associated+to+tryptophan-rich+peptides.">How to evaluate the cellular uptake of CPPs with fluorescence techniques: Dissecting methodological pitfalls associated to tryptophan-rich peptides.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. Biomembranes. 1861 (9), 1533-1545 (2019).</li><li>Derossi, D., Joliot, A. H., Chassaing, G., Prochiantz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+third+helix+of+the+Antennapedia+homeodomain+translocates+through+biological+membranes.">The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (14), 10444-10450 (1994).</li><li>Takayama, M., Itoh, S., Nagasaki, T., Tanimizu, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+enzymatic+method+for+determination+of+serum+choline-containing+phospholipids.">A new enzymatic method for determination of serum choline-containing phospholipids.</a> Clinica Chimica Acta; International Journal of Clinical Chemistry. 79 (1), 93-98 (1977).</li><li>Notman, R., Noro, M., O'Malley, B., Anwar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+for+Dimethylsulfoxide+(DMSO)+action+on+lipid+membranes.">Molecular basis for Dimethylsulfoxide (DMSO) action on lipid membranes.</a> Journal of the American Chemical Society. 128 (43), 13982-13983 (2006).</li><li>Konate, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insight+into+the+cellular+uptake+mechanism+of+a+secondary+amphipathic+cell-penetrating+peptide+for+siRNA+delivery.">Insight into the cellular uptake mechanism of a secondary amphipathic cell-penetrating peptide for siRNA delivery.</a> Biochemistry. 49 (16), 3393-3402 (2010).</li><li>Vaissi&#232;re, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+retro-inverso+cell-penetrating+peptide+for+siRNA+delivery.">A retro-inverso cell-penetrating peptide for siRNA delivery.</a> Journal of Nanobiotechnology. 15 (1), 34 (2017).</li><li>Eir&#237;ksd&#243;ttir, E., Konate, K., Langel, &. #. 2. 2. 0. ;., Divita, G., Deshayes, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secondary+structure+of+cell-penetrating+peptides+controls+membrane+interaction+and+insertion.">Secondary structure of cell-penetrating peptides controls membrane interaction and insertion.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1798 (6), 1119-1128 (2010).</li><li>Ziegler, A., Li Blatter, X., Seelig, A., Seelig, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+transduction+domains+of+HIV-1+and+SIV+TAT+interact+with+charged+lipid+vesicles.+Binding+mechanism+and+thermodynamic+analysis.">Protein transduction domains of HIV-1 and SIV TAT interact with charged lipid vesicles. Binding mechanism and thermodynamic analysis.</a> Biochemistry. 42 (30), 9185-9194 (2003).</li><li>Thor&#233;n, P. E. G., Persson, D., Karlsson, M., Nord&#233;n, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Antennapedia+peptide+penetratin+translocates+across+lipid+bilayers+-+the+first+direct+observation.">The Antennapedia peptide penetratin translocates across lipid bilayers - the first direct observation.</a> FEBS Letters. 482 (3), 265-268 (2000).</li><li>Mishra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+HIV+TAT+peptide+and+analogues+induced+by+multiplexed+membrane+and+cytoskeletal+interactions.">Translocation of HIV TAT peptide and analogues induced by multiplexed membrane and cytoskeletal interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (41), 16883-16888 (2011).</li><li>Rouser, G., Fleischer, S., Yamamoto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+dimensional+thin+layer+chromatographic+separation+of+polar+lipids+and+determination+of+phospholipids+by+phosphorus+analysis+of+spots.">Two dimensional thin layer chromatographic separation of polar lipids and determination of phospholipids by phosphorus analysis of spots.</a> Lipids. 5 (5), 494-496 (1970).</li><li>Bartlett, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorus+assay+in+column+chromatography.">Phosphorus assay in column chromatography.</a> Journal of Biological Chemistry. 234 (3), 466-468 (1959).</li><li>Stewart, J. C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+determination+of+phospholipids+with+ammonium+ferrothiocyanate.">Colorimetric determination of phospholipids with ammonium ferrothiocyanate.</a> Analytical Biochemistry. 104 (1), 10-14 (1980).</li><li>Spinella, S. A., Nelson, R. B., Elmore, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+peptide+translocation+into+large+unilamellar+vesicles.">Measuring peptide translocation into large unilamellar vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3571 (2012).</li><li>Wimley, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+effects+of+membrane-interacting+peptides+on+membrane+integrity.">Determining the effects of membrane-interacting peptides on membrane integrity.</a> Cell-Penetrating Peptides. 1324, 89-106 (2015).</li><li>B&#225;r&#225;ny-Wallje, E., Gaur, J., Lundberg, P., Langel, U., Gr&#228;slund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+membrane+perturbation+caused+by+the+cell+penetrating+peptide+Tp10+depending+on+attached+cargo.">Differential membrane perturbation caused by the cell penetrating peptide Tp10 depending on attached cargo.</a> FEBS Letters. 581 (13), 2389-2393 (2007).</li><li>van Rooijen, B. D., Claessens, M. M. A. E., Subramaniam, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+permeabilization+by+oligomeric+&#945;-Synuclein:+in+search+of+the+mechanism.">Membrane permeabilization by oligomeric &#945;-Synuclein: in search of the mechanism.</a> PloS One. 5 (12), 14292 (2010).</li><li>Hassane, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+cellular+trafficking+of+splice+redirecting+oligonucleotides+complexed+with+chemically+modified+cell-penetrating+peptides.">Insights into the cellular trafficking of splice redirecting oligonucleotides complexed with chemically modified cell-penetrating peptides.</a> Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 153 (2), 163-172 (2011).</li><li>Asciolla, J. J., Renault, T. T., Chipuk, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examining+BCL-2+family+function+with+large+unilamellar+vesicles.">Examining BCL-2 family function with large unilamellar vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (68), e4291 (2012).</li><li>Grewer, C., Gameiro, A., Mager, T., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+characterization+of+membrane+transport+proteins.">Electrophysiological characterization of membrane transport proteins.</a> Annual Review of Biophysics. 42 (1), 95-120 (2013).</li></ol>

Yazarların çıkar çatışması yoktur.

Sunulan floresan sızıntı tahlili, hücreye nüfuz eden peptit ile membran dengesinin bozulmasını gidermek için basit ve hızlı bir yöntemdir. Yapması kolay, aynı zamanda farklı membran etkileşimi olan peptitler veya diğer membran etkileşimi molekülleri arasında dolaylı bir karşılaştırma sağlar. Protokolün kritik adımlarıyla ilgili olarak, bu test taban çizgisi (tek başına LUV'lar) ve maksimum floresan salınımı (Triton durumu) arasında göreceli değerler sağladığından, genellikle LUV'l...

Doksanlı yıllardaki keşiflerinden sonra, plazma membran 1,2aracılığıyla kargoların verimli bir hücresel teslimatını teşvik etmek için hücre nüfuz eden peptitler (CPP'ler) geliştirilmiştir. CPP'ler genellikle çok çeşitli kökenlere sahip, genellikle 8 ila 30 amino asit olan kısa peptitlerdir. İlk olarak "doğrudan translokasyon" taşıyıcıları olarak tanımlandılar, yani plazma zarını geçebildiler ve herhangi bir endositotik yoldan bağımsız olarak hücrelere bir yük aktarabildiler ne enerji gereksinimi ne de reseptör tutulumu. Bununla birlikte, daha fazla araştırma, bu ilk gözlemlerin esas olarak deneysel eser nedeniyle floresan aşırı tahmininden ve / veya metanol3kullanarak sabitleme protokollerinden geldiğini ortaya koydu. Günümüzde, CPP alımının, kargonun doğası, CPP ve kargo arasındaki kullanılanbağlantı,çalışılan hücre hattı vb.
CPP'ler, CPP ile kargosu 8 ,9,10,11arasında kimyasal bir bağlantı (kurevi strateji) veya elektrostatik/hidrofobik etkileşimler (kurda olmayan strateji) içeren iki stratejiye göre transfeksiyon ajanları olarak kullanılabilir. Her iki strateji de birkaç kargonun hücre transferinde verimliliklerini göstermiş olsa da, CPP'ler tarafından içselleştirme mekanizmasının anlaşılması hala tartışma altındadır ve endositoz yolları veya doğrudan penetrasyon arasındaki dengenin ölçülmesi hala zordur12,13. Endosit süreçlerin katılımını net bir şekilde ele almak için bir dizi deneysel araç ve strateji mevcut olsa da, plazma membran bileşenleriyle daha ayrı etkileşimler anlamına gelir, ancak doğrudan translokasyonun karakterize etmesi daha zor görünmektedir. Biyolojik membranlar genellikle fosfolipidlerden membran proteinlerine kadar hücresel tipe ve/veya ortama (stres koşulları, hücre bölünmesi vb.) göre değişebilen çok sayıda bileşenden oluşur. Bu kompozisyon çeşitliliği ve sonuç olarak evrensel bir hücresel membran modelinin bulunmaması çalışmaları tek bir şekilde etkinleştirmez. Bununla birlikte, bu sınırlamaları atlatmak için yapay membran veya membran özleri ile adım adım yaklaşımlar geliştirilmiştir. Küçük unilamellar vesicles monolayer yaklaşımlara kadar, her model açıkça belirli soruları cevaplamak için uygundu14,15. Bunlar arasında, büyük unilameller vesicles (LUVs), peptit / membran etkileşimlerini içselleştirme sürecinde önemli bir nokta olarak incelemek için uygun bir membran taklit modeli oluşturur.
Bu bağlamda, aşağıdaki protokolde hem aniyonik bir floresan boyanın hem de lipozomlarda kapsüllenmiş karşılık gelen poli-katyonik quencher'in izlenmesi yoluyla peptitlerin ve peptit/membran etkileşimlerinin LUVs bütünlüğü üzerindeki etkilerinin araştırılması açıklanmaktadır. Bu araç, doğrudan membran translokasyonu yapıp yapamayacaklarını anlamak için CPP / membran etkileşimlerini incelemek için kullanılır. Genellikle farklı membran etkileşimli peptitleri karşılaştırmak için uygulansa da, bu LUV floresan sızıntı tahlili hem CPP-kargo konjugelerini (kurcalama stratejisi) hem de CPP:cargo komplekslerini (kurvalent olmayan strateji) araştırmak için de kullanılabilir.
Bu nedenle mevcut protokol ilk olarak yakın zamanda geliştirilen triptofan (W) ve arginin (R)- zengin Amfipatik Peptitler (WRAP)16ile örneklenecektir. WRAP, birkaç hücre hattında hızlı ve verimli bir şekilde küçük müdahale RNA 'sı (siRNA) sunmak için peptit bazlı nanopartiküller oluşturabilir16. Wrap peptidinin floresan sızıntı özellikleri tek başına veya siRNA yüklü WRAP bazlı nanopartiküller hücresel içselleştirme mekanizmalarını karakterize etmek için izlendi. İçselleştirme mekanizmalarının esas olarak doğrudan translokasyon içerdiğini gösterdik7. İkinci bir örnekte, WRAP peptidi protein/proteine müdahale eden peptit iCAL36 (WRAP-iCAL36)17'ye eş zamanlı olarak konjuge edildi ve membranların dengesini bozma yeteneği, başka bir CPP olan Penetratin18 (Penetratin-iCAL36) ile birleştirilen iCAL36'ya floresan sızıntısı testinde karşılaştırıldı.
Son olarak, yöntemin avantajları ve sınırlamaları hem teknolojik açıdan hem de biyolojik alaka açısından tartışılacaktır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >25 mL glass round-bottom flask</td>
			<td >Pyrex</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >8-aminonaphthalene-1, 3, 6-trisulfonic acid, disodium salt (ANTS)</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >A350</td>
			<td>Protect from light&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chloroform&#160;</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >288306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cholesterol</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DOPC (dioleoylphosphatidylcholine)</td>
			<td >Avanti Polar</td>
			<td>850375P</td>
			<td>Protect from air</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Extruder</td>
			<td >Avanti Polar</td>
			<td >610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluorimeter</td>
			<td >PTI Serlabo</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 &#181;L glass syringe</td>
			<td >Hamilton</td>
			<td >705N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEPES</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LabAssay Phospholipid&#160;</td>
			<td >WAKO&#160;</td>
			<td >296-63801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >liquid chromatography column</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Methanol</td>
			<td >Carlo Erba</td>
			<td >414902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nuclepore polycarbonate membrane (0.1 &#181;m pore size, 25 mm diameter)</td>
			<td >Whatman</td>
			<td >800309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >polystyrene cuvette, 10 x 10 x 45 mm</td>
			<td >Grener Bio-One</td>
			<td >614101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >polystyrene semi-micro cuvette, DLS</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >FB55924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >p-xylene-bispyridinium bromide (DPX)</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >X1525</td>
			<td>Protect from light&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >quartz fluorescence cuvette</td>
			<td >Hellma</td>
			<td >109.004F-QS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >rotavapor system&#160;</td>
			<td >Heidolph</td>
			<td >Z334898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sephadex G-50 resin</td>
			<td >Amersham</td>
			<td >17-0042-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium azide (NaN3)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium chlorid (NaCl)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sonicator bath USC300T</td>
			<td >VWR</td>
			<td >142-6001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sphingomyelin</td>
			<td >Avanti Polar</td>
			<td>860062P</td>
			<td>Protect from air</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100&#160;</td>
			<td >Eromedex</td>
			<td >2000-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Zetaziser NanoZS&#160;</td>
			<td >Malvern</td>
			<td >ZEN3500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescent leakage assay to investigate membrane destabilization by cell-penetrating peptide

Hücreye nüfuz eden peptitler (CPP'ler), plazma zarını geçebilen ve bir kargoyu hücrelere aktarabilen taşıyıcılar olarak tanımlanır. Bu aktivite için gerekli olan temel ortak özelliklerden biri, CPP'lerin plazma membranı (lipitler) ve daha çok membranın hücre dışı matrisinin bileşenleri (heparan sülfat) ile etkileşimlerinden kaynaklanandır. Nitekim, doğrudan translokasyon veya endositoza bağımlı içselleştirmeden bağımsız olarak, lipid bilayerleri hem plazma zarı seviyesinde hem de hücre içi trafik (endosomal veziküller) düzeyinde içselleştirme sürecine dahil olurlar. Bu yazıda, olası CPP-membran dengesizliğini/etkileşimini tespit etmek ve içselleştirme mekanizmasındaki rollerini ele almak için floresan sızıntı testinde büyük bir unilamellar veziküllerin (LUV' ler) formülasyonu, saflaştırılması, karakterizasyonu ve uygulamasının farklı adımlarını açıklayan ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Plazma membran içeriğini yansıtan lipid bileşimine sahip LUV'lar, hem floresan boyayı hem de bir quencher'ı kapsüllemek için üretilir. Ekstravesiküler ortamda peptitlerin eklenmesi ve OV'ler üzerinde peptit-membran etkileşimlerinin indüksiyonu, böylece bir sızıntıyı ortaya çıkaran floresanlarda doza bağlı bir şekilde önemli bir artışa neden olabilir. Örnekler burada, çeşitli hücre hatlarında hızlı ve verimli bir siRNA teslimatı gösteren yakın zamanda geliştirilen triptofan (W) ve arginin (R) zengin Amfipatik Peptitler (WRAP'ler) ile sağlanmaktadır. Son olarak, bu etkileşimlerin doğası ve lipitlere olan yakınlık, membran translokasyonunu ve/veya endosomal kaçışı anlamak ve iyileştirmek için tartışılır.

Floresan kaçak tahlili prensibi Şekil 1'de gösterilmiştir. Ayrıntılı olarak, floresan bir boyayı ve bir quencher'ı (floresan sinyali yok) kapsülleyen büyük unilameller vesicles (LUV'lar) ilgi çekici biyomolekül ile tedavi edilir. Peptidin lipid zarları ile etkileşimi nedeniyle, membran geçirgenliği, yeniden yapılanma ve hatta yırtılma anlamına gelebilir, floresan boyası ve quencher LUV'lardan salınır. Tampondaki sonraki seyreltmeler f...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Leakage Assay to Investigate Membrane Destabilization by Cell-Penetrating Peptide at JoVE.com

Fluorescent Leakage Assay to Investigate Membrane Destabilization by Cell-Penetrating Peptide

Floresan sızıntı tahlili, peptit/membran etkileşimlerinin araştırılmasını sağlayan basit bir yöntemdir, böylece çeşitli biyolojik süreçlere dahil olmaları ve özellikle hücre nüfuz eden peptitlerin doğrudan hücresel translokasyon işlemi sırasında fosfolipid bilayerleri rahatsız etme yeteneği.

Hücre Delici Peptit ile Membran Dengesizleşmesini Araştırmak için Floresan Sızıntı Tahlil

Cell-penetrating peptides (CPPs) are defined as carriers that are able to cross the plasma membrane and to transfer a cargo into cells. One of the main ...

fluorescent-leakage-assay-to-investigate-membrane-destabilization

Research

JoVE Journal

Biochemistry

6.1K Görüntüleme.  INSERM U1046 - CNRS UMR 9214 - University of Montpellier. Floresan sızıntı tahlili, peptit/membran etkileşimlerinin araştırılmasını sağlayan basit bir yöntemdir, böylece çeşitli biyolojik süreçlere dahil olmaları ve özellikle hücre nüfuz eden peptitlerin doğrudan hücresel translokasyon işlemi sırasında fosfolipid bilayerleri rahatsız etme yeteneği.

Video: Fluorescent Leakage Assay to Investigate Membrane Destabilization by Cell-Penetrating Peptide

Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a determinant phosphoinositide of the plasma membrane (PM), and it is required to modulate ion channels, actin dynamics, exocytosis, endocytosis, intracellular signaling, and many other cellular processes. However, the spatial organization of PI(4,5)P2 in the PM is controversial, and its nanoscale distribution is poorly understood due to the technical limitations of research approaches. Here by utilizing single molecule localization microscopy and the Pleckstrin Homology (PH) domain based dual color fluorescent probes, we describe a novel method to visualize the nanoscale distribution of PI(4,5)P2 in the PM in fixed membrane sheets as well as live cells.

PI(4,5)P2 regulates various cellular functions, but its nanoscale organization in the cell plasma membrane is poorly understood. By labeling PI(4,5)P2 with a dual-color fluorescent probe fused to the Pleckstrin Homology domain, we describe a novel approach to study the PI(4,5)P2 spatial distribution in the plasma membrane at the nanometer scale.

Roman Floresan Probları Plazma Membran Fosfatidilinositol 4,5-bisfosfatın tek molekül Süper çözünürlüklü görüntüleme

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

Biyokimya

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating these studies, reincorporation of detergent-solubilized membrane proteins into liposomes is a stochastic process where protein topology is impossible to enforce. This paper offers an alternative method to these challenging techniques that utilizes a liposome-based scaffold. Protein solubility is enhanced by deletion of the transmembrane domain, and these amino acids are replaced with a tethering moiety, such as a His-tag. This tether interacts with an anchoring group (Ni2+ coordinated by nitrilotriacetic acid (NTA(Ni2+)) for His-tagged proteins), which enforces a uniform protein topology at the surface of the liposome. An example is presented wherein the interaction between Dynamin-related protein 1 (Drp1) with an integral membrane protein, Mitochondrial Fission Factor (Mff), was investigated using this scaffold liposome method. In this work, we have demonstrated the ability of Mff to efficiently recruit soluble Drp1 to the surface of liposomes, which stimulated its GTPase activity. Moreover, Drp1 was able to tubulate the Mff-decorated lipid template in the presence of specific lipids. This example demonstrates the effectiveness of scaffold liposomes using structural and functional assays and highlights the role of Mff in regulating Drp1 activity.

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için<em&gt; İn Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the availability of enough area to perform the function. Nanodiscs are used to provide a membrane surface of controlled size and lipid content. In the absence of bound extrinsic proteins, sodium phosphotungstate-stained nanodiscs appear as stacks of coins when viewed from the side by transmission electron microscopy (TEM). This protocol is therefore designed to intentionally promote stacking; consequently, the prevention of stacking can be interpreted as the binding of the membrane-binding protein to the nanodisc. In a further step, the TEM images of the protein-nanodisc complexes can be processed with standard single-particle methods to yield low-resolution structures as a basis for higher resolution cryoEM work. Furthermore, the nanodiscs provide samples suitable for either TEM or non-denaturing gel electrophoresis. To illustrate the method, Ca2+-induced binding of 5-lipoxygenase on nanodiscs is presented.

Many proteins perform their function when attached to membrane surfaces. The binding of extrinsic proteins on nanodisc membranes can be indirectly imaged by transmission electron microscopy. We show that the characteristic stacking (rouleau) of nanodiscs induced by the negative stain sodium phosphotungstate is prevented by the binding of extrinsic protein.

Yöntem gözünüzde canlandırın ve Transmisyon Elektron Mikroskobu Membran Etkileşen Proteinler Analiz için

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field of 3D templates is rising due to the potential resemblance of those materials to the natural extracellular matrix. Protein-based hydrogels are particularly promising because they can easily be functionalized and can achieve defined structures with adjustable physicochemical properties. However, the production of macroporous 3D templates for cell culture applications using natural materials is often limited by their weaker mechanical properties compared to those of synthetic materials. Here, different methods were evaluated to produce macroporous bovine serum albumin (BSA)-based hydrogel systems, with adjustable pore sizes in the range of 10 to 70 &#181;m in radius. Furthermore, a method to generate channels in this protein-based material that are several hundred microns long was established. The different methods to produce pores, as well as the influence of pore size on material properties such as swelling ratio, pH, temperature stability, and enzymatic degradation behavior, were analyzed. Pore sizes were investigated in the native, swollen state of the hydrogels using confocal laser scanning microscopy. The feasibility for cell culture applications was evaluated using a cell-adhesive RGD peptide modification of the protein system and two model cell lines: human breast cancer cells (A549) and adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells (MCF7).

Different methods to manipulate three-dimensional architecture in protein-based hydrogels are evaluated here with respect to material properties. The macroporous networks are functionalized with a cell-adhesive peptide, and their feasibility in cell culture is evaluated using two different model cell lines.

Protein bazlı Hydrogels mimarilerde kolayca idare hücre kültür uygulamaları için

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis can be characterized using an in vitro DNA synthesis assay followed by polyacrylamide gel electrophoresis. The goal of this assay is to quantify synthesis of both natural DNA and modified DNA (M-DNA). These approaches are particularly useful for resolving oligonucleotides with single nucleotide resolution, enabling observation of individual steps during enzymatic oligonucleotide synthesis. These methods have been applied to the evaluation of an array of biochemical and biophysical properties such as the measurement of steady-state rate constants of individual steps of DNA synthesis, the error rate of DNA synthesis, and DNA binding affinity. By using modified components including, but not limited to, modified nucleoside triphosphates (NTP), M-DNA, and/or mutant DNA polymerases, the relative utility of substrate-DNA polymerase pairs can be effectively evaluated. Here, we detail the assay itself, including the changes that must be made to accommodate nontraditional primer DNA labeling strategies such as near-infrared fluorescently labeled DNA. Additionally, we have detailed crucial technical steps for acrylamide gel pouring and running, which can often be technically challenging.

This protocol describes the characterization of DNA polymerase synthesis of modified DNA through observation of changes to near-infrared fluorescently labeled DNA using gel electrophoresis and gel imaging. Acrylamide gels are used for high resolution imaging of the separation of short nucleic acids, which migrate at different rates depending on size.

DNA polimeraz etkinliği tahlil Akrilamid Jel Elektroforez tarafından görüntülenmiştir yakın kızılötesi floresan etiketli DNA'yı kullanarak

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The modification presented includes the combination of this technique with cell-penetrating sequences. We propose to design cell-penetrating baits that can be incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions found will reflect those that occur within the intracellular context. Connexin43 (Cx43), a protein that forms gap junction channels and hemichannels is down-regulated in high-grade gliomas. The Cx43 region comprising amino acids 266-283 is responsible for the inhibition of the oncogenic activity of c-Src in glioma cells. Here we use TAT as the cell-penetrating sequence, biotin as the pull-down tag and the region of Cx43 comprised between amino acids 266-283 as the target to find intracellular interactions in the hard-to-transfect human glioma stem cells. One of the limitations of the proposed method is that the molecule used as bait could fail to fold properly and, consequently, the interactions found could not be associated with the effect. However, this method can be especially interesting for the interactions involved in signal transduction pathways because they are usually carried out by intrinsically disordered regions and, therefore, they do not require an ordered folding. In addition, one of the advantages of the proposed method is that the relevance of each residue on the interaction can be easily studied. This is a modular system; therefore, other cell-penetrating sequences, other tags, and other intracellular targets can be employed. Finally, the scope of this protocol is far beyond protein-protein interaction because this system can be applied to other bioactive cargoes such as RNA sequences, nanoparticles, viruses or any molecule that can be transduced with cell-penetrating sequences and fused to pull-down tags to study their intracellular mechanism of action.

This is a protocol to study intracellular protein-protein interactions based on the biotin-avidin pull-down system with the novelty of combining cell-penetrating sequences. The main advantage is that the target sequence is incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions will occur within the cellular context.

İntraselüler Protein-protein etkileşimleri çalışmaya Biotinylated hücre Penetran peptidler

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage by extracellular oxidants. This process of transporting electrons from intracellular reductants to extracellular oxidants is not well defined. Here we present spectrophotometric assays by C2C12 myotubes to monitor tPMET utilizing the extracellular electron acceptors: water-soluble tetrazolium salt-1 (WST-1) and 2,6-dichlorophenolindophenol (DPIP or DCIP). Through reduction of these electron acceptors, we are able to monitor this process in a real-time analysis. With the addition of enzymes such as ascorbate oxidase (AO) and superoxide dismutase (SOD) to the assays, we can determine which portion of tPMET is due to ascorbate export or superoxide production, respectively. While WST-1 was shown to produce stable results with low background, DPIP was able to be re-oxidized after the addition of AO and SOD, which was demonstrated with spectrophotometric analysis. This method demonstrates a real-time, multi-well, quick spectrophotometric assay with advantages over other methods used to monitor tPMET, such as ferricyanide (FeCN) and ferricytochrome c reduction.

The goal of this protocol is to spectrophotometrically monitor trans-plasma membrane electron transport utilizing extracellular electron acceptors and to analyze enzymatic interactions that may occur with these extracellular electron acceptors.

Trans-plazma membran elektron taşıma C2C12 Myotubes ile ölçme

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

Bir floresan dalgalanma spektroskopisi tahlil Protein-Protein etkileşimlerinin hücre-hücre kişiler

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often viruses exhibit cell and tissue tropism and are adapted to specific cell or tissue proteases. Moreover, these viruses can introduce mutations or insertions into their genome during replication that may affect the cleavage, and thus can contribute to adaptations to a new host. Here, we present a fluorogenic peptide cleavage assay that allows a rapid screening of peptides mimicking the cleavage site of viral fusion proteins. The technique is very flexible and can be used to investigate the proteolytic activity of a single protease on many different substrates, and in addition, it also allows exploration of the activity of multiple proteases on one or more peptide substrates. In this study, we used peptides mimicking the cleavage site motifs of the coronavirus spike protein. We tested human and camel derived Middle East Respiratory Syndrome coronaviruses (MERS-CoV) to demonstrate that single and double substitutions in the cleavage site can alter the activity of furin and dramatically change cleavage efficiency. We also used this method in combination with bioinformatics to test furin cleavage activity of feline coronavirus spike proteins from different serotypes and strains. This peptide-based method is less labor- and time intensive than conventional methods used for the analysis of proteolytic activity for viruses, and results can be obtained within a single day.

We present a fluorogenic peptide cleavage assay that allows a rapid screening of the proteolytic activity of proteases on peptides representing the cleavage site of viral fusion peptides. This method can also be used on any other amino acid motif within a protein sequence to test for the protease activity.

Bir Fluorogenic peptid bölünme tahlil için proteolitik aktivite ekran: coronavirus uygulamalarda spike protein etkinleştirme

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used for ATP production. The amphiphilic nature of membrane proteins requires particular attention to their handling, and reconstitution into the natural lipid environment is indispensable when studying membrane transport processes like proton translocation. Here, we detail a method that has been used for the investigation of the proton-pumping mechanism of membrane redox enzymes, taking cytochrome bo3 from Escherichia coli as an example. A combination of electrochemistry and fluorescence microscopy is used to control the redox state of the quinone pool and monitor pH changes in the lumen. Due to the spatial resolution of fluorescent microscopy, hundreds of liposomes can be measured simultaneously while the enzyme content can be scaled down to a single enzyme or transporter per liposome. The respective single enzyme analysis can reveal patterns in the enzyme functional dynamics that might be otherwise hidden by the behavior of the whole population. We include a description of a script for automated image analysis.

Here, we present a protocol to study the molecular mechanism of proton translocation across lipid membranes of single liposomes, using cytochrome bo3 as an example. Combining electrochemistry and fluorescence microscopy, pH changes in the lumen of single vesicles, containing single or multiple enzyme, can be detected and analyzed individually.

Proton pompalama membran enzimler elektrokimya ve floresan mikroskopisi kullanılarak incelenmesi için tek lipozom ölçümleri

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...