Este protocolo microscópico de expansão permite ao pesquisador visualizar proteínas glomerulares com resolução de nanoescala em um microscópio convencional. A principal vantagem da microscopia de expansão é que ela é acessível a uma grande comunidade de pesquisa. Comece fazendo espaçadores para a câmara de gelação.
Corte número um e número 1,5 tampa de vidro desliza em listras de cinco milímetros, usando uma faca de diamante. Coloque um deslizamento de vidro em uma câmara de coloração e posicione as listras de deslizamento de cobertura número 1,5 no escorregador de vidro, de modo que eles formem um quadrado de 2,5 centímetros. Pipeta uma gota de água dupla destilada nos cantos da praça para aderir as listras de deslizamento de tampa de vidro uns aos outros e ao deslizamento de vidro.
Aguarde aproximadamente 20 minutos para que os deslizamentos de cobertura número 1.5 sejam fixados. Pipeta uma gota de água em cada listra de deslizamento de cobertura número 1.5. Coloque quatro listras de deslizamento de tampa de vidro número um nos deslizamentos de cobertura número 1.5.
Para a tampa da câmara de gelação, enrole um copo de cobertura com filme de parafina, evitando quaisquer dobras ou sujeira no filme. Para o tratamento de ancoragem, remova o PBS das células imunotravas e adicione 250 microliters de tampão de ancoragem por poço diretamente no deslizamento da tampa do vidro. Incubar a placa por três horas em temperatura ambiente.
Mantenha o substrato no escuro usando uma caixa. Após a incubação, remova o tampão de ancoragem e lave o deslizamento da tampa uma vez com 1,5 mililitros de PBS por poço. Para coloricionar as fibras de actina, descongele uma solução de faloidóide compatível com EXM e incuba-a por 45 minutos à temperatura ambiente.
Enquanto isso, dissolva o acrilato de sódio em água dupla destilada usando um dispositivo de agitação e prepare a solução de monômero no gelo. Remova a falooidina das células e lave-as com 1,5 mililitros de PBS, duas vezes, à temperatura ambiente. Deixe 1,5 mililitros de PBS dentro do poço após a última lavagem.
Use fórceps e uma cânula para levantar o deslizamento de vidro de cobertura da placa de seis poços e colocá-lo na câmara de gelação. Adicione APS à solução de gelagem e vórtice brevemente. Pipette 200 microliters de solução de gelagem na amostra e fechar cautelosamente a câmara, evitando bolhas de ar dentro do gel.
Adicione água à câmara de coloração e incubar a câmara de coloração por pelo menos uma hora a 37 graus Celsius para polimerizar o gel. Tire a câmara de coloração da incubadora. Para abrir a tampa da câmara de gelação, introduza uma lâmina de barbear entre a tampa e o espaçador e remova a tampa com cautela.
Remova os espaçadores com a lâmina de barbear e corte todo o gel extra. Use um pincel para desprender as bordas do gel. Coloque o slide com o gel e cubra o vidro em um prato cheio de PBS.
Em seguida, remova o vidro de cobertura separado do gel sacudindo-o suavemente. Coloque o slide abaixo do gel para fixar o gel ao slide. Com o gel no slide, divida o gel em pequenos pedaços usando a lâmina de barbear.
Empurre suavemente um pedaço de gel em um poço de uma placa de seis poços com um fundo de vidro e desdobre-o com um pincel. Use o pincel para manter o gel hidratado com uma pequena quantidade de PBS. Usando um microscópio invertido, faça imagens de visão geral com baixa abertura numérica para imagens de pré-expansão.
Diluir Proteinase K a quatro unidades por mililitro no tampão de digestão para fazer a solução de digestão. Adicione 500 microliters da solução de digestão a cada poço, e mergulhe o gel dentro da solução. Deixe digerir durante a noite à temperatura ambiente com a tampa fechada para manter as amostras no escuro.
Remova a solução de digestão com uma pipeta e descarte-a. Adicione um mililitro de água dupla destilada e incubar o gel imerso por 10 minutos em temperatura ambiente. Retire a água e adicione um mililitro de água fresca e dupla destilada.
Continue trocando água a cada 10 minutos até que um platô de expansão seja atingido, fazendo com que o gel fique opticamente claro. Remova a água do gel e inicie imediatamente a microscopia. Usando um microscópio invertido, use um objetivo de ar em baixa ampliação para encontrar células no estado de pré-expansão.
Mude para objetivos 40 X e 63 X para uma melhor resolução. Excite-se com o comprimento de onda de interesse e leve a imagem através da câmera. Este protocolo EXM permite a expansão de até quatro vezes.
Para determinar o fator de expansão é essencial para as células de imagem antes e depois da expansão. Ancoragem e homogeneização insuficientes podem levar a distorções e rupturas de células. Exemplos representativos de células rompidas são mostrados aqui.
Este método pode ser usado para investigar a colocalização de proteínas adaptadora f-actin e actina, como podocina e nefrina. Podocin é retratado em verde, actina em azul, e nefrina em vermelho. Áreas brancas indicam colocalização.
A intensidade e abundância do sinal fluorescente são fundamentais para o sucesso exm. A ancoragem eficiente dos corantes fluorescentes via ACX é de fundamental importância para este protocolo. Em nossas mãos o ACX solubilizado é bom por até três a quatro meses.
