פרוטוקול מיקרוסקופי הרחבה זה מאפשר לחוקר לדמיין חלבונים גלומרולריים ברזולוציה ננומטרית במיקרוסקופ קונבנציונלי. היתרון העיקרי של מיקרוסקופיית התרחבות הוא שהוא נגיש לקהילת מחקר גדולה. התחל על ידי ביצוע מרווחים לתא הג'לציה.
חתוך מספר אחד ומספר 1.5 כיסוי זכוכית מחליק לתוך חמישה פסים מילימטר, באמצעות סכין יהלום. הנח שקופית זכוכית לתוך תא מכתים ומקם את פס החלקת הכיסוי מספר 1.5 על שקופית הזכוכית, כך שהם יוצרים ריבוע של 2.5 ס"מ. פיפט טיפה של מים מזוקקים כפולים לפינות הכיכר לדבוק פסים לכסות זכוכית להחליק אחד לשני אל מגלשת הזכוכית.
המתן כ- 20 דקות כך שתעודות הכיסוי של המספר 1.5 מחוברות ביציבות. פיפטה טיפת מים על כל פס כיסוי מספר 1.5. מניחים ארבעה פסים כיסוי זכוכית מספר אחת להחליק על מספר 1.5 תגיות כיסוי.
למכסה תא הג'לציה יש לעטוף כיסוי בסרט פרפין, תוך הימנעות מקפלי או לכלוך על הסרט. לטיפול בעיגון, הסירו את PBS מהתאים הויטראז' החיסוניים והוסיפו 250 מיקרוליטרים של חיץ עיגון לבאר ישירות על גבי כיסוי הזכוכית. דגירה את הצלחת במשך שלוש שעות בטמפרטורת החדר.
השאר את המצע בחושך באמצעות תיבה. לאחר הדגירה, להסיר את חיץ עיגון ולשטוף את החלקת הכיסוי פעם אחת עם 1.5 מיליליטר של PBS לכל באר. כדי להכתים סיבי אקטין, להפשיר פתרון פאלודין תואם EXM ולהדגיר אותו במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר.
בינתיים, להמיס אקרילט נתרן במים מזוקקים כפול באמצעות מכשיר ערבוב ולהכין את הפתרון מונומר על קרח. הסר phalloidin מהתאים ולשטוף אותם עם 1.5 מיליליטר של PBS, פעמיים, בטמפרטורת החדר. השאירו 1.5 מיליליטר של PBS בתוך הבאר לאחר הכביסה האחרונה.
השתמש מלקחיים קנולה להרים את החלקת זכוכית כיסוי מצלחת שש היטב ומניחים אותו לתוך תא gelation. מוסיפים APS לתמיסת הג'לינג ומערבולת בקצרה. פיפטה 200 microliters של פתרון gelling על המדגם בזהירות לסגור את התא, הימנעות בועות אוויר בתוך הג'ל.
מוסיפים מים לתא ההכתמה, ומדגרים את תא ההכתמה למשך שעה אחת לפחות ב-37 מעלות צלזיוס כדי ל polymerize את הג'ל. תוציא את תא ההכתמה מהחממה. כדי לפתוח את מכסה תא הג'לציה, הציגו סכין גילוח בין המכסה למרווח, והסירו את המכסה בזהירות.
מוציאים את המרווחים עם סכין הגילוח וחותכים את כל הג'ל הנוסף. השתמש במברשת צבע כדי לנתק את קצות הג'ל. שים את השקופית עם הג'ל לכסות זכוכית לתוך צלחת מלאה PBS.
לאחר מכן להסיר את כיסוי מנותק מן הג'ל על ידי טלטול אותו בעדינות. שים את השקופית מתחת לג'ל כדי לחבר את הג'ל למגלשה. עם הג'ל על המגלשה, מחלקים את הג'ל לחתיכות קטנות באמצעות סכין הגילוח.
בעדינות לדחוף חתיכה אחת של ג'ל לתוך באר של צלחת שש באר עם תחתית זכוכית ולפתח אותו עם מברשת צבע. השתמש מברשת צבע כדי לשמור על ג'ל לחות עם כמות קטנה של PBS. באמצעות מיקרוסקופ הפוך, צלם תמונות מבט כולל עם צמצם מספרי נמוך לתמונות לפני ההרחבה.
לדלל Proteinase K לארבע יחידות למיליליטר במאגר העיכול כדי להפוך את פתרון העיכול. הוסף 500 מיקרוליטרים של פתרון העיכול לכל באר, לטבול את הג'ל בתוך הפתרון. תן לו לעכל לילה בטמפרטורת החדר עם המכסה סגור כדי לשמור על הדגימות בחושך.
הסר את פתרון העיכול עם פיפטה והשליך אותו. מוסיפים מיליליטר אחד של מים מזוקקים כפולים ומדגירה את הג'ל השקוע במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. מוציאים את המים ומוסיפים מיליליטר אחד של מים מזוקקים טריים וכפולים.
ממשיכים להחליף מים כל 10 דקות עד לרמה של התרחבות, מה שגורם לג'ל להיות ברור אופטית. מוציאים את המים מהג'ל ומיד מתחילים מיקרוסקופיה. באמצעות מיקרוסקופ הפוך, השתמש במטרת אוויר בהגדלה נמוכה כדי למצוא תאים במצב שלפני ההתפשטות.
עבור ליעדים של 40 X ו- 63 X לקבלת רזולוציה טובה יותר. לרגש עם אורך הגל של עניין ולקחת את התמונה דרך המצלמה. פרוטוקול EXM זה מאפשר הרחבה של עד פי ארבעה.
כדי לקבוע את גורם ההרחבה הוא חיוני לתאי תמונה לפני ואחרי ההתפשטות. עיגון והומוגניזציה לא מספיקים עלולים להוביל לעיוותים וקרעים של תאים. דוגמאות מייצגות לתאים קרועים מוצגות כאן.
שיטה זו יכולה לשמש כדי לחקור את colocalization של חלבונים מתאם F-actin ו actin, כגון podocin ו nephrin. פודוצ'ין מתואר בירוק, אקטין בכחול ונפרין באדום. אזורים לבנים מצביעים על קולוקליזציה.
עוצמת האות הפלואורסצנטי והשפע הם המפתח ל- EXM מוצלח. לעיגון יעיל של צבעי הפלואורסצנט באמצעות ACX יש חשיבות קריטית לפרוטוקול זה. בידינו ACX solubilized הוא טוב עד שלושה עד ארבעה חודשים.
