이 확장 현미경 프로토콜은 구형자가 기존의 현미경에 나노 스케일 해상도로 구체 단백질을 시각화 할 수 있게합니다. 확장 현미경 검사법의 주요 장점은 대규모 연구 커뮤니티에 액세스 할 수 있다는 것입니다. 젤레이션 챔버용 스페이서를 만드는 것으로 시작합니다.
1번과 1.5번 유리 커버를 다이아몬드 나이프를 사용하여 5mm 스트라이프로 잘라냅니다. 유리 슬라이드를 염색 챔버에 넣고 유리 슬라이드에 숫자 1.5 커버 슬립 스트라이프를 배치하여 2.5 센티미터 사각형을 형성합니다. 파이프는 유리 커버 슬립 스트라이프를 서로 와 유리 슬라이드에 부착하기 위해 사각형의 모서리에 이중 증류수의 액적.
숫자 1.5 커버 전표가 안정적으로 부착되도록 약 20 분 동안 기다립니다. 각 번호 1.5 커버 슬립 스트라이프에 물방울을 피펫. 4번 유리 커버 슬립 스트라이프를 숫자 1.5 커버 슬립에 놓습니다.
겔화 챔버 뚜껑의 경우 덮개 유리를 파라핀 필름으로 감아 필름의 주름이나 먼지를 피하십시오. 앵커링 치료를 위해 면역 스테인드 셀에서 PBS를 제거하고 유리 커버 슬립에 직접 고정 버퍼 250 마이크로리터를 추가합니다. 상온에서 3시간 동안 접시를 배양합니다.
상자를 사용하여 기판을 어둠 속에서 유지합니다. 인큐베이션 후, 앵커링 버퍼를 제거하고 1.5 밀리리터의 PBS로 한 번 커버 슬립을 잘 씻는다. 액틴 섬유를 더럽게 하려면 EXM 호환 프할로이딘 용액을 해동하고 실온에서 45분 동안 배양합니다.
한편, 교반 장치를 사용하여 이중 증류수에 아크릴 나트륨을 용해하고 얼음에 단조로운 용액을 준비합니다. 세포에서 phalloidin을 제거하고 실온에서 두 번 PBS의 1.5 밀리리터로 세척하십시오. 마지막 세척 후 우물 내에 PBS1.5 밀리리터를 둡니다.
집게와 캐뉼라를 사용하여 6개의 웰 플레이트에서 덮개 유리 슬립을 들어 올려 젤레이션 챔버에 넣습니다. 겔화 용액과 소용돌이에 APS를 간단히 추가합니다. 피펫 200 마이크로리터의 젤링 용액은 시료에 조심스럽게 닫아 겔 내의 기포를 피합니다.
염색 실에 물을 추가하고, 젤을 중합하기 위해 섭씨 37도에서 적어도 한 시간 동안 스테인딩 챔버를 배양한다. 인큐베이터에서 염색 챔버를 꺼내십시오. 겔화 챔버 뚜껑을 열려면 뚜껑과 스페이서 사이에 면도날을 소개하고 뚜껑을 조심스럽게 제거합니다.
면도날로 스페이서를 제거하고 모든 여분의 젤을 잘라냅니다. 페인트 브러시를 사용하여 젤의 가장자리를 분리합니다. 젤과 함께 슬라이드를 넣고 PBS로 채워진 접시에 유리를 덮습니다.
그런 다음 젤에서 분리 된 커버 유리를 부드럽게 흔들어 제거합니다. 젤 아래에 슬라이드를 넣어 젤을 슬라이드에 부착합니다. 젤을 슬라이드에 넣고 젤을 면도날을 사용하여 작은 조각으로 나눕니다.
젤 한 조각을 유리 바닥으로 6개의 웰 플레이트에 부드럽게 밀어 넣고 페인트 브러시로 펴냅니다. 소량의 PBS로 젤을 촉촉하게 유지하려면 페인트 브러시를 사용합니다. 반전된 현미경을 사용하여 확장 전 이미지에 대한 낮은 숫자 조리개와 개요 이미지를 참조하십시오.
단백질을 소화 용액으로 만들기 위해 밀리리터당 4단위로 단백질을 희석합니다. 각 음소화 용액500 마이크로리터를 각 웰에 추가하고 용액 내에 젤을 담그습니다. 샘플을 어둠 속에서 유지하기 위해 뚜껑을 닫고 실온에서 밤새 소화하십시오.
파이펫으로 소화 용액을 제거하고 폐기하십시오. 이중 증류수 1밀리리터를 넣고 실온에서 10분 동안 침지된 젤을 배양합니다. 물을 제거하고 신선한 이중 증류수 1 밀리리터를 추가합니다.
팽창의 고원에 도달 할 때까지 10 분마다 물을 교환 계속, 젤은 광학적으로 명확해지는 원인이. 젤에서 물을 제거하고 즉시 현미경 검사를 시작합니다. 반전된 현미경을 사용하여, 확장 전 상태에서 세포를 찾기 위해 낮은 배율에서 공기 목표를 사용합니다.
더 나은 해상도를 위해 40 X 및 63 X 목표로 전환합니다. 관심의 파장에 흥분하고 카메라를 통해 이미지를 가져 가라. 이 EXM 프로토콜을 사용하면 최대 4배까지 확장할 수 있습니다.
확장 계수를 결정하려면 확장 전후의 이미지 셀에 필수적입니다. 부족한 앵커링과 균질화는 세포의 왜곡과 파열로 이어질 수 있습니다. 파열된 세포의 대표적인 예가 여기에 나와 있다.
이 방법은 포도신 및 네프린과 같은 F-액틴 및 액틴 어댑터 단백질의 공동 국화를 조사하는 데 사용될 수 있다. 포도신은 녹색으로 묘사되고, 파란색으로 액틴을, 네프린은 빨간색으로 묘사됩니다. 흰색 영역은 공동 지역화를 나타냅니다.
형광 신호 강도와 풍부함은 성공적인 EXM의 핵심입니다. ACX를 통한 형광염료의 효율적인 고정은 이 프로토콜에 매우 중요합니다. 우리의 손에 용해 ACX는 최대 3 ~ 4 개월 동안 좋다.
