Questo protocollo microscopico di espansione consente allo sperimentatore di visualizzare proteine glomerulari con risoluzione su scala nanometrica su un microscopio convenzionale. Il principale vantaggio della microscopia espansiva è che è accessibile a una grande comunità di ricerca. Inizia facendo distanziale per la camera di gelazione.
Taglia il numero uno e il numero 1.5 la copertura in vetro scivola in strisce di cinque millimetri, usando un coltello diamanta. Posizionare uno scivolo di vetro in una camera di colorazione e posizionare le strisce di scorrimento del coperchio numero 1.5 sullo scivolo di vetro, in modo che formeranno un quadrato di 2,5 centimetri. Pipettare una goccia di doppia acqua distillata negli angoli del quadrato per aderire alle strisce di vetro che si infilano l'una all'altra e allo scivolo di vetro.
Attendere circa 20 minuti in modo che i foglietti di copertura numero 1.5 siano attaccati stabilmente. Pipettare una goccia d'acqua su ogni numero 1.5 coprire striscia di slittamento. Posizionare quattro strisce di copertura in vetro numero uno sullo scivolo di copertura numero 1.5.
Per il coperchio della camera di gelazione, avvolgere un vetro di copertura con pellicola di paraffina, evitando pieghe o sporcizia sul film. Per il trattamento di ancoraggio, rimuovere pbs dalle cellule macchiate immunitarie e aggiungere 250 microlitri di tampone di ancoraggio per pozzo direttamente sul coperchio del vetro. Incubare il piatto per tre ore a temperatura ambiente.
Tenere il substrato al buio utilizzando una scatola. Dopo l'incubazione, rimuovere il tampone di ancoraggio e lavare il coperchio scivolare una volta con 1,5 millilitri di PBS per pozzo. Per macchiare le fibre di actina, scongelare una soluzione di falloidina compatibile con EXM e incubarla per 45 minuti a temperatura ambiente.
Nel frattempo, sciogliere l'acrilato di sodio in acqua distillata doppia utilizzando un dispositivo di agitazione e preparare la soluzione monomero sul ghiaccio. Rimuovere la falloidina dalle cellule e lavarle con 1,5 millilitri di PBS, due volte, a temperatura ambiente. Lasciare 1,5 millilitri di PBS all'interno del pozzo dopo l'ultimo lavaggio.
Utilizzare le forcep e una cannula per sollevare lo scivolo di vetro di copertura dalla piastra dei sei pozza e posizionarlo nella camera di gelazione. Aggiungere brevemente APS alla soluzione gelificante e al vortice. Pipettare 200 microlitri di soluzione gelificante sul campione e chiudere cautamente la camera, evitando bolle d'aria all'interno del gel.
Aggiungere acqua alla camera di colorazione e incubare la camera di colorazione per almeno un'ora a 37 gradi Celsius per polimerizzare il gel. Togliere la camera di colorazione dall'incubatrice. Per aprire il coperchio della camera di gelazione, introdurre una lama di rasoio tra il coperchio e il distanziale e rimuovere il coperchio con cautela.
Rimuovere i distanziati con la lama del rasoio e tagliare tutto il gel extra. Utilizzare un pennello per staccare i bordi del gel. Mettere lo scivolo con il gel e coprire il vetro in un piatto pieno di PBS.
Quindi rimuovere il vetro di copertura staccato dal gel scuotendolo delicatamente. Mettere la diapositiva sotto il gel per attaccare il gel alla diapositiva. Con il gel sullo scivolo, dividere il gel in piccoli pezzi usando la lama del rasoio.
Spingere delicatamente un pezzo di gel in un pozzo di un piatto di sei pozzetti con un fondo di vetro e dispiegarlo con un pennello. Utilizzare il pennello per mantenere il gel idratante con una piccola quantità di PBS. Utilizzando un microscopio invertito, scatta immagini panoramiche con bassa apertura numerica per immagini pre-espansione.
Diluire la proteinasi K a quattro unità per millilitro nel tampone di digestione per rendere la soluzione di digestione. Aggiungere 500 microlitri della soluzione di digestione ad ogni pozzo e immergere il gel all'interno della soluzione. Lasciare digerire durante la notte a temperatura ambiente con il coperchio chiuso per tenere i campioni al buio.
Rimuovere la soluzione di digestione con una pipetta e scartarla. Aggiungere un millilitro di acqua distillata doppia e incubare il gel immerso per 10 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere l'acqua e aggiungere un millilitro di acqua distillata fresca e doppia.
Continuare a scambiare acqua ogni 10 minuti fino a raggiungere un altopiano di espansione, facendo sì che il gel diventi otticamente chiaro. Rimuovere l'acqua dal gel e iniziare immediatamente la microscopia. Usando un microscopio invertito, usa un obiettivo d'aria a basso ingrandimento per trovare cellule nello stato di pre-espansione.
Passa agli obiettivi 40 X e 63 X per una migliore risoluzione. Eccitare con la lunghezza d'onda di interesse e prendere l'immagine tramite la fotocamera. Questo protocollo EXM consente un'espansione fino a quattro volte.
Per determinare il fattore di espansione è essenziale l'immagine delle celle prima e dopo l'espansione. Un'ancoraggio e un'omogeneizzazione insufficienti possono portare a distorsioni e rotture delle cellule. Esempi rappresentativi di cellule rotture sono mostrati qui.
Questo metodo può essere utilizzato per studiare la colocalizzazione delle proteine dell'adattatore F-actina e actina, come la podocina e la nefrina. La podocina è raffigurata in verde, actina in blu e nefrrina in rosso. Le aree bianche indicano la colocalizzazione.
L'intensità e l'abbondanza del segnale fluorescente sono fondamentali per un EXM di successo. L'ancoraggio efficiente dei coloranti fluorescenti tramite ACX è di fondamentale importanza per questo protocollo. Nelle nostre mani l'ACX solubilizzato è buono per un massimo di tre o quattro mesi.
