Este protocolo microscópico de expansión permite al investigador visualizar proteínas glomerulares con resolución a nanoescala en un microscopio convencional. La principal ventaja de la microscopía de expansión es que es accesible para una gran comunidad de investigación. Comience por hacer espaciadores para la cámara de gelación.
La cubierta de vidrio número uno y número 1.5 se desliza en rayas de cinco milímetros, usando un cuchillo de diamantes. Coloque un tobogán de vidrio en una cámara de tinción y coloque las rayas deslizantes de la cubierta número 1.5 en el tobogán de vidrio, de modo que formen un cuadrado de 2,5 centímetros. Pipeta una gota de agua destilada doble en las esquinas del cuadrado para adherir las rayas deslizantes de la cubierta de vidrio entre sí y a la diapositiva de vidrio.
Espere aproximadamente 20 minutos para que los resbalones de cobertura número 1.5 estén firmemente unidos. Pipeta una gota de agua en cada número 1.5 cubierta raya resbaladiza. Coloque cuatro rayas deslizantes de cubierta de vidrio número uno en los resbalones de cubierta número 1.5.
Para la tapa de la cámara de gelificación, envuelva un vaso de cubierta con película de parafina, evitando cualquier pliegue o suciedad en la película. Para el tratamiento de anclaje, retire PBS de las células manchadas inmunes y agregue 250 microlitros de amortiguador de anclaje por pozo directamente en el resbalón de la cubierta de vidrio. Incubar la placa durante tres horas a temperatura ambiente.
Mantenga el sustrato en la oscuridad con una caja. Después de la incubación, retire el amortiguador de anclaje y lave el resbalón de la cubierta una vez con 1,5 mililitros de PBS por pozo. Para manchar las fibras de actina, descongelar una solución de fhalloidina compatible con EXM e incubarla durante 45 minutos a temperatura ambiente.
Mientras tanto, disolver el acrilato de sodio en agua destilada doble utilizando un dispositivo de agitación y preparar la solución monómero sobre hielo. Retire la faloidina de las células y lávela con 1,5 mililitros de PBS, dos veces, a temperatura ambiente. Deje 1,5 mililitros de PBS dentro del pozo después del último lavado.
Utilice fórceps y una cánula para levantar el resbalón de vidrio de la cubierta de la placa de seis pozos y colóquelo en la cámara de gelación. Agregue APS a la solución de gelling y vórtice brevemente. Pipeta 200 microlitros de solución de gelling en la muestra y cerrar con precaución la cámara, evitando burbujas de aire dentro del gel.
Agregue agua a la cámara de tinción e incubar la cámara de tinción durante al menos una hora a 37 grados Celsius para polimerizar el gel. Saca la cámara de manchas de la incubadora. Para abrir la tapa de la cámara de gelificación, introduzca una cuchilla de afeitar entre la tapa y el espaciador y retire la tapa con precaución.
Retire los espaciadores con la cuchilla de afeitar y corte todo el gel adicional. Utilice un pincel para separar los bordes del gel. Coloque el tobogán con el gel y cubra el vidrio en un plato lleno de PBS.
A continuación, retire el vaso de cubierta separado del gel agitando suavemente. Coloque la diapositiva debajo del gel para fijar el gel a la diapositiva. Con el gel en el tobogán, divida el gel en trozos pequeños usando la hoja de afeitar.
Empuje suavemente una pieza de gel en un pozo de un pozo de seis placas de pozo con un fondo de vidrio y despliécelo con un pincel. Utilice el pincel para mantener el gel hidratado con una pequeña cantidad de PBS. Con un microscopio invertido, tome imágenes de visión general con baja apertura numérica para imágenes previas a la expansión.
Diluir proteinasa K a cuatro unidades por mililitro en búfer de digestión para hacer la solución de digestión. Añadir 500 microlitros de la solución de digestión a cada pozo, y sumergir el gel dentro de la solución. Deje que digera durante la noche a temperatura ambiente con la tapa cerrada para mantener las muestras en la oscuridad.
Retire la solución de digestión con una pipeta y deséchela. Agregue un mililitro de agua destilada doble e incubar el gel sumergido durante 10 minutos a temperatura ambiente. Retire el agua y agregue un mililitro de agua fresca destilada doble.
Continúe intercambiando agua cada 10 minutos hasta que se alcance una meseta de expansión, lo que hace que el gel se vuelva ópticamente claro. Retire el agua del gel e inicie inmediatamente la microscopía. Con un microscopio invertido, utilice un objetivo de aire a baja ampliación para encontrar células en el estado de pre-expansión.
Cambie a objetivos 40 X y 63 X para una mejor resolución. Excitar con la longitud de onda de interés y tomar la imagen a través de la cámara. Este protocolo EXM permite la expansión de hasta cuatro veces.
Para determinar el factor de expansión es esencial para las celdas de imagen antes y después de la expansión. El anclaje y la homogeneización insuficientes pueden conducir a distorsiones y rupturas de las células. Aquí se muestran ejemplos representativos de células rotas.
Este método se puede utilizar para investigar la colocación de proteínas adaptadoras de F-actina y actina, como la podocina y la nefrina. La podocina se representa en verde, actin en azul y nefrina en rojo. Las áreas blancas indican la colocación.
La intensidad y la abundancia de la señal fluorescente son clave para un EXM exitoso. El anclaje eficiente de los colorantes fluorescentes a través de ACX es de vital importancia para este protocolo. En nuestras manos, acx solubilizado es bueno para hasta tres a cuatro meses.
