Agradecemos ao Dr. Julie K. Horton para a leitura crítica do manuscrito e Dr. Rajendra Prasad para sugestões e discussões úteis. Partes desta pesquisa foram originalmente publicado no The Journal of Biological Chemistry, Sassa A et. al., &quot;DNA Sequence efeitos de contexto sobre a atividade glicosilase of Human glicosilase DNA 8 oxoguanine.&quot; J Biol Chem. 287, 36702-36710 (2012) 2. Este trabalho foi apoiado, no todo ou em parte, pelo National Institutes of Health Research Grant Projeto Z01-ES050158 no Programa de Pesquisa intramuros, NIEHS.

1. Preparação de enzima e substrato de ADN <ol><li> Over-express OGG1 como uma proteína de fusão GST-em E. coli, utilize o tag GST para a purificação e, em seguida, remover o tag GST por clivagem com HRV-3C protease (Figura 1) 6. </li><li> Adquirir a sintetizado quimicamente 5&#39;-6-carboxifluoresceína (6-FAM) oligonucleotídeo marcado contendo um único resíduo de 8 oxoG e a sua cadeia de oligonucleótido não marcado complementar. Os oligonucleótidos 34-mero contêm a 8 oxoG na posição 17 a partir da extremidade 5 &#39;. Purifica-se estes oligonucleótidos por electroforese em gel de poliacrilamida. </li><li> Preparar substrato de ADN de cadeia dupla contendo 8-oxoG por mistura 5&#39;-6-FAM oligonucleótido marcado com a sua cadeia complementar a uma razão molar de 1:1,2 em tampão de hibridação (Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 10 mM, 50 mM, 1 mM de EDTA) num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Coloque o tubo em um carro alegórico em água fervente por 5 min. Deixe o tubo no lugar e, em seguida, deixe a água esfriar lentamente para rtemperatura oom (isso leva cerca de 2 horas). </li><li> Realizar a preparação da amostra e da experiência em condições de baixa ou mínima de luz, de modo a minimizar a fotodegradação do marcador fluorescente. </li></ol> 2. Medição do Tempo Curso de Estado Estável e do Active Titulação site de OGG1 2.1. A preparação da amostra e decurso de tempo de estado estacionário <ol><li> Preparar substrato de ADN e OGG1 soluções separadamente em tampão de reacção (HEPES 50 mM, pH 7,5, KCl 20 mM, EDTA 0,5 mM e 0,1% de albumina de soro de bovino) em tubos de microcentrífuga de 1,5 ml em gelo. A concentração de ADN é de 400 nM e a concentração aparente de OGG1 é de 30, 60, 90 ou 120 nM como determinado por um ensaio de proteína de Bradford. Colocar os tubos de reacção de um conjunto de bloco de calor a 37 ° C. Pré-incubar enzima e do substrato de ADN soluções separadamente a 37 ° C durante 1 min. </li><li> Iniciar a reacção por mistura de volumes iguais das soluções de substrato e OGG1 DNA por pipetagem. Depois de misturar estes soluções 1:1 (v / v), as concentrações finais são de 200 nM e 15 de ADN, 30, 45, ou 60 nM OGG1, respectivamente. Remover alíquotas (10 ul) em intervalos de tempo e temperar a reacção por mistura com 1 ml de NaOH 1M. Como controlo para os cursos de tempo, 10 ul da mistura de reacção, sem enzima é misturada com 1 ml de NaOH 1M. </li><li> Coloque as amostras de reacção de um bloco de aquecimento de 90 ° C durante 5 minutos para separar o produto resultante do AP local. Após o aquecimento, adicionar 1 ml de HCl 1 M para neutralizar cada uma das amostras. </li><li> Adicionar um volume igual (12 ul) de tampão de carregamento de gel (95% de formamida, EDTA 20 mM, 0,02% de bromofenol, e 0,02% de xileno cianol) a cada amostra de reacção, e, em seguida, colocar a mistura num bloco de aquecimento de 95 ° C durante 2 min, em seguida, colocar imediatamente o tubo em gelo. </li><li> Coloque as amostras (5 ul) para um gel desnaturante de poliacrilamida a 15% contendo 8 M de ureia em 89 mM de EDTA mM Tris-HCl, pH 8,8, ácido bórico 89 mM e 2. O substrato e os produtos clivados são bem separados depoisexecutando o gel. </li></ol> 2.2. Imagem do gel <ol><li> Digitalizar o gel utilizando um gerador de imagens que pode detectar o ADN marcado por fluorescência e visualizar as bandas do substrato e do produto. </li><li> Quantificar as bandas depois de imagiologia do gel. Note-se que alguma clivagem do fundo podem ser observados após o tratamento do próprio substrato com NaOH (Figura 2A). Subtrair este pano de fundo a partir da quantidade medida de cada um dos produtos de reacção. </li></ol> 2.3. A análise dos dados <ol><li> Traça-se a quantidade de produto formado em cada tempo de reacção (t) (Figura 2B). Analisar os dados não processados ​​usando a Equação 1 para determinar a amplitude do sinal de sincronismo (A 0, intercepção de y) e o declive da fase de estado estacionário linear (v ss). </li></ol><img fo:src="/files/ftp_upload/50695/50695eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50695/50695eq1.jpg" /><ol start="2"><li> Enredoa intercepção y em relação à concentração de proteína total (isto é, concentração de enzima aparente; figura 2C), proporcionando uma medida da fracção de enzima activa. É um ajuste linear com uma intercepção de zero para proporcionar o factor de correcção para a determinação da fracção de enzima activa. </li><li> Traça-se a taxa em estado estacionário em relação à concentração de enzima activa (Figura 2D), proporcionando a taxa de dissociação constante do produto (isto é, a inclinação da linha ajustada). </li></ol> 3. Medição do Tempo Curso Pré-steady-state Como mostrado na Figura 2, a formação do produto durante a fase de explosão é demasiado rápido para medir por mistura manual e têmpera. Assim, um instrumento de fluxo rápido de têmpera pode fornecer um método poderoso para medir reacções rápidas que ocorrem na escala de tempo em milisegundos (Figura 3) 5. O instrumento usa um motor de accionamento controlado por computador, para rapidamente misturar umaª saciar reações após os tempos de reação especificados. Por exemplo, usar um RQF-3 Rápido Instrumento Quench-Flow Kintek para medir a fase de libertação inicial e subsequente fase de estado estacionário de formação do produto catalisado por OGG1. Rápido Instruments Quench-Flow estão disponíveis de vários fabricantes. 3.1. Preparação da amostra Separadamente preparar substrato de ADN e OGG1 soluções em tubos de 1,5 ml, tal como descrito em 2-1. As concentrações de ADN e OGG1 activas são 400 nm e 80 nm, respectivamente. Isto resulta em concentrações finais de 200 nM e de ADN de 40 nm OGG1 activo após mistura 1:1 (v / v). 3.2. Preparação de instrumento rápido resfriamento de fluxo <ol><li> Ligação de um banho de água de circulação para o instrumento de fluxo rápido arrefecimento para controlo da temperatura (37 ° C). </li><li> Ajuste dos parâmetros do aparelho e escolha do circuito de reacção adequada para o tempo desejado pontos de acordo com instruções do fabricanteções. Os laços de reacção são de comprimento variável para proporcionar tempos de reacção alternativos. </li><li> Prepare tampão de reação e NaOH saciar soluções em 10 ml luer lock seringas descartáveis ​​e anexar essas seringas para as portas da unidade e carregar os Reservatórios unidade com tampão de reação (seringas B) e NaOH 142 mM (seringa Q) (Seringa Válvulas de Carga em posição LOAD) . Para remover as bolhas de ar da seringa, trabalhar a solução e para trás várias vezes. </li><li> Abaixe o motor de passo até tocar no topo das seringas (válvulas de carga de seringas e válvulas de carga Amostra na posição FIRE). </li><li> Lave as amostras Loops, o ciclo de reação, ea linha de saída com água e metanol. Seque as áreas coradas por completo (válvulas em posição de descarga). </li></ol> 3.3. Curso de tempo pré-steady-state <ol><li> Fazer um buraco na parte superior de um tubo de 1,5 ml tapado com uma agulha de calibre 16. Anexar um tubo na linha de saída para recolher a reacção extinta. </li><li> Defina o reactio desejadotempo n (em segundos), utilizando o teclado. O motor de passo será fazer o backup para ajustar o volume de loop, de modo a manter o volume de têmpera constante. Posição êmbolos de seringa B contra a plataforma de motor de passo, adicionando tampão com as seringas descartáveis ​​ligados às portas da unidade. </li><li> Preencha 1 ml luer lock seringas descartáveis ​​com substrato DNA e OGG1 soluções, respectivamente (válvulas de amostra em posição LOAD). Anexar seringas com substrato DNA e OGG1 soluções para cada um dos portos de carga de exemplo e, em seguida, preencher os Loops amostra com substrato de DNA e OGG1 soluções, respectivamente (Amostra Válvulas de Carga em posição LOAD). </li><li> Todas as válvulas de carga seringa e Amostra Válvulas de carga para a posição FOGO. Iniciar a reação por um golpe teclado (por exemplo, imprensa de &quot;G&quot; ou tecla &quot;START&quot;). Substrato de ADN e OGG1 soluções (18 mL de cada) são imediatamente misturados na Curva de Reacção. </li><li> Aguardar até que a reacção é temperada a automaticamente o tempo de reacção desejado, misturando 36 ul da reaction mistura com 86 ml de NaOH 142 mM. Após extinção da reacção, a amostra é descarregada a partir da linha de saída. </li><li> Defina as válvulas de carga da seringa na posição da carga e da Amostra Carga válvulas para a posição de descarga. Lave as amostras Loops, o ciclo de reação, ea linha de saída com água e metanol e secar como descrito no ponto 3.2. Repetir o procedimento acima para cada ponto de tempo. </li><li> Realizar uma experiência de controlo sem enzima para determinar uma correcção do fundo, que pode ser feita manualmente ou com o instrumento de rápido arrefecimento. Para realizar um controle com o instrumento de rápido resfriamento, preencha o loop de amostra para DNA com substrato de DNA, mas manter o loop de amostra para OGG1 vazio. Definir o tempo de reacção, realizar a mistura e extingue-se tal como descrito no 3.3.4-3.3.6. </li><li> Lave os Loops Amostra eo loop Reação com NaOH 2 M, 2 M HCl, água e metanol e, em seguida, secar as linhas lavados. Depois de definir o motor de passo para a posição inicial, mudar as válvulas de carga da seringa para a positio CARGAn e lavar os reservatórios com água da unidade. </li><li> Tratar as amostras temperadas, com o calor de reacção, e, em seguida, separada do substrato e o ADN do produto de 15% de electroforese desnaturante em gel de poliacrilamida, como descrito no item 2.1. </li><li> Visualiza e quantificar as bandas no gel, tal como descrito em 2.2. </li></ol> 3.4. A análise dos dados Montar os cursos de tempo de formação do produto por análise de regressão não linear a uma equação com a subida dos termos exponenciais e linear (equação 2) proporcionando a constante de velocidade de primeira ordem (k obs), a amplitude do impulso (A 0), e um ritmo linear (v ss). <img fo:src="/files/ftp_upload/50695/50695eq2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50695/50695eq2.jpg" /> 4. Curso Tempo único volume de negócios <ol><li> Preparar substrato de ADN e OGG1 em tubos separados de 1,5 ml como descrito em 2-1. A concenções de DNA e OGG1 activas são 100 nm e 500 nm, respectivamente, isto resulta em concentrações finais de 50 nM e 250 nM ADN OGG1 após mistura 1:1 (v / v). </li><li> Preparar o aparelho de arrefecimento rápido de fluxo e preparar as amostras de reacção, tal como descrito em 3.2 e 3.3. </li><li> Tratar as amostras de reacção interrompida com calor e sujeitá-las a 15% de desnaturação para electroforese em gel de poliacrilamida e os produtos de substrato separada, tal como descrito em 2.1. </li><li> Visualiza e quantificar as bandas no gel, tal como descrito em 2.2. </li><li> Montar os cursos de tempo da formação de um único produto para exponencial para determinar a constante de velocidade de primeira ordem (k obs) como dada pela Equação 3. </li></ol><img fo:src="/files/ftp_upload/50695/50695eq3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50695/50695eq3.jpg" />

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K., Mitra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+DNA+glycosylase+activity+of+OGG1+by+NEIL1:+functional+collaboration+between+two+human+DNA+glycosylases.">Stimulation of DNA glycosylase activity of OGG1 by NEIL1: functional collaboration between two human DNA glycosylases.</a> Biochemistry. 43, 11596-11604 (2004).</li><li>Sidorenko, V. S., Nevinsky, G. A., Zharkov, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+interaction+between+human+8-oxoguanine-DNA+glycosylase+and+AP+endonuclease.">Mechanism of interaction between human 8-oxoguanine-DNA glycosylase and AP endonuclease.</a> DNA Repair. 6, 317-328 (2007).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

As aproximações cinéticas descritas aqui delinear métodos para definir constantes cinéticas elementares. Se um decurso de tempo de formação do produto é bifásico, com a primeira reposição enzimática ocorre rapidamente, em seguida, um passo após a química é limitante da velocidade durante a rotatividade catalíticas subsequentes. No caso de OGG1, o primeiro volume pode ser medido utilizando elevadas concentrações de enzima, quer com a limitação (S &lt;E) ou alta (S&gt; E), as concentrações de ADN. No...

Um ambiente aeróbico acelera instabilidade genômica. Uma lesão grande de DNA resultante promutagenic do stress oxidativo é 7,8-di-hidro-8-oxoguanina (8-oxoG). Isto é devido ao potencial de codificação ambígua de 8-oxoG. Human 8 oxoguanine DNA glicosilase (OGG1) é responsável por iniciar reparo por excisão de base do 8 oxoG. A atividade glicosilase de OGG1 extirpa a base de 8 oxoG resultando em DNA produto com um site apurínico (AP-local). A atividade lyase fraco OGG1 pode incisão no AP local em alguns casos. Caracterização cinética da glicosilases DNA geralmente acha que eles exibem cursos de tempo bifásicos. Depois de uma fase rápida inicial de formação do produto (isto é, explosão), uma fase de estado estacionário linear é observada 1-3. Este comportamento é indicativo de um passo na sequência da química (isto é, a mudança conformacional ou libertação do produto) a ser limitante da velocidade, durante a porção linear do decurso do tempo, enquanto que a brocaª fase, muitas vezes referida como a fase transitória, corresponde à formação do produto no sítio activo da enzima, durante o primeiro ciclo de reacção. Quando o lançamento do produto é a taxa de limitação durante a fase de steady-state, as medições de atividade fornecer uma medida qualitativa do DNA produto afinidade de ligação, mas não fornecem informações cinética sobre eventos no sítio ativo da enzima (ou seja, química). Deste modo, os métodos para isolar e medir a fase do sincronismo de pré-estado estacionário exponencial são necessários para investigar acontecimentos durante a primeira rotação enzimática em local activo da enzima 4. Existem três métodos cinéticos padrão para caracterizar o comportamento catalítico do OGG1, (1) no estado estacionário, (2) pré-de estado estacionário, e (3) um único volume. Estas abordagens diferem umas das outras pela concentração da enzima na mistura de reacção e da enzima em relação ao substrato utilizada em cada abordagem. Em uma abordagem típica de estado estacionário,por vezes referido como o volume de negócios múltiplos cinética, baixas concentrações de enzima são utilizados para seguir a formação do produto. A concentração do substrato é muito superior à concentração de enzima de modo a que várias das modificações enzimáticas não afectam significativamente a concentração de substrato. Nesta situação, os cursos de tempo deve ser linear e muitas vezes é difícil discernir se uma explosão ocorreu durante a primeira rotação, devido à baixa concentração de enzima usada neste método; nota que a amplitude de ruptura é equivalente à concentração de enzima. Isto pode ser ultrapassado utilizando uma concentração de enzima mais elevada e extrapolando o curso de tempo linear para o tempo zero para detectar se o primeiro volume enzimática ocorreu rapidamente. O intercepto no eixo das ordenadas (eixo y) deve ser proporcional à concentração de enzima e fornece uma medida da enzima activa envolvida com o substrato. Embora esta abordagem pode, em princípio fornecem evidência para a existência de uma fase de explosão, uma diferené necessária para medir abordagem rente a cinética da fase de sincronização. Em muitos casos, a fase de explosão é muito rápido de medir por meio de técnicas de mixagem e têmpera manuais. Nesta situação, a cinética de pré-estado estacionário e um único volume de negócios (ou seja cinética transiente) aproxima-se muitas vezes requerem um instrumento de mistura rápida e de têmpera para seguir os pontos de uma reacção de 5 tempo iniciais. Em uma abordagem de pré-estado estacionário elevadas concentrações de enzima são utilizadas de modo a que uma quantidade significativa de produto é formado durante a primeira rotação. Dado que várias das modificações são seguidos para observar ciclismo catalítica (isto é, a fase linear que segue a rajada), a concentração de substrato é maior do que a concentração de enzima ([enzima] &lt;[substrato]). Para isolar os eventos no sítio ativo da enzima sem ciclismo catalítico, são utilizadas as condições de um único volume de negócios. Neste caso, o substrato é impregnado com a enzima (E &gt;&gt; S), de modo que todo o substrato vai participar in o «volume de negócios single &#39;e normalmente apresentam um curso de tempo single-exponencial. Como mencionado acima para as enzimas que exibem uma fase do sincronismo, de libertação do produto (k off) muitas vezes limita a taxa da fase de estado estacionário ao longo do tempo. A taxa de libertação de produto (. / Hora v ss, conc) pode ser determinada a partir do declive da fase de estado estacionário linear. A concentração da enzima ativa (E) é necessário para converter a taxa de liberação do produto para uma constante taxa intrínseca onde k off = v ss / [E]. Importante, a concentração de enzima activa é tipicamente menor do que a concentração de proteína medida devido às impurezas, enzima inactiva, enzima não produtivamente ligado ao substrato e ao método utilizado para determinar a concentração de proteína. A concentração de enzima activa pode ser determinado a partir da amplitude de ruptura quando a libertação do produto é lenta. Assim, extrapolando a um curso de tempo de estado estacionário paratempo zero fornece uma estimativa da enzima activa necessária para calcular k off (libertação do produto) a partir da taxa em estado estacionário observada. Para medir a cinética da explosão, uma abordagem de pré-estado estacionário é necessário seguir a formação do produto, durante a primeira rotação, que ocorre antes da fase de estado estacionário linear. A cinética de ruptura segue a formação do intermediário enzima-produto. Uma vez que a reacção é iniciada pela enzima de mistura com o substrato, a quantidade do produto da enzima aumenta rapidamente até que a reacção atinge uma fase de estado estacionário. Se a catálise é muito mais rápida do que a libertação do produto, a amplitude do impulso é igual a enzima envolvida activamente e a abordagem exponencial observada até ao equilíbrio (kobs) corresponde à taxa de conversão química do substrato em produto, assumindo que a taxa de reverso química é negligenciável. Em alguns casos cy catalíticaagarram interfere com a análise pré-steady-state, como quando as magnitudes de taxas para a química e lançamento do produto não são significativamente diferentes. Neste caso, utilizando o excesso de enzima em relação ao substrato previne ciclismo catalítico e do substrato com a enzima de limites ligado a um único volume. Por conseguinte, o primeiro passo da reacção química pode ser isolado e determinado com precisão como a constante de velocidade de primeira ordem (k obs). Esta constante de velocidade deve ser semelhante ao kobs determinada a partir da abordagem de pré-estado estacionário descrito acima. Aqui descrevemos como estes métodos cinéticos pode ser utilizado para analisar a actividade de OGG1 glicosilase.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent/Material</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5'-6-FAM labeled oligonucleotides containing a single 8-oxoG</td>
 <td>Eurofins MWG Operon</td>
 <td></td>
 <td>5'-P32 radiolabeled oligonucleotides can be used as well. Polyacrylamide gel purification grade is recommended. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Unlabeled oligonucleotides (complementary strand)</td>
 <td>Eurofins MWG Operon</td>
 <td></td>
 <td>Polyacrylamide gel purification grade is recommended. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 ml BD Luer Lock disposable syringe</td>
 <td>BD Medical</td>
 <td>309628</td>
 <td>Lue Lock disposable syringe from other vendors can be used as well.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 ml BD Luer Lock disposable syringe</td>
 <td>BE Medical</td>
 <td>309604</td>
 <td>Luer Lock disposable syringe from other vendors can be used as well.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Circulating water bath</td>
 <td>Any vender</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RQF-3 Rapid Quench-Flow Instrument</td>
 <td>KinTek Corporation</td>
 <td></td>
 <td>Rapid Quench-Flow Instrument from other vendors can be used as well.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Typhoon Phosphorimager 8600</td>
 <td>GE Healthcare Life Sciences</td>
 <td></td>
 <td>Imager from other vendors can be used as well.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KaleidaGraph</td>
 <td>Synergy Software</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

steady-state, pre-steady-state, and single-turnover kinetic measurement for dna glycosylase activity

Humano 8-oxoguanina ADN glicosilase (OGG1) extirpa o mutagénicas lesão oxidativa do ADN de 8-oxo-7 ,8-dihydroguanine (8-oxoG) a partir de ADN. Caracterização cinética da OGG1 é realizada para medir as taxas de excisão 8 oxoG e lançamento do produto. Quando a concentração de OGG1 é menor do que o ADN do substrato, o período de formação de produto são bifásicos, com uma fase exponencial rápida (isto é, explosão) de formação do produto é seguido por uma fase de estado estacionário linear. O assomo inicial de formação do produto corresponde à concentração de enzima adequadamente acoplada no substrato, e a amplitude de explosão depende da concentração de enzima. A constante do sinal de sincronismo de velocidade de primeira ordem corresponde à taxa intrínseca da excisão 8-oxoG e da taxa em estado estacionário mais lento mede a taxa de libertação de produto (produto de ADN constante da taxa de dissociação, koff). Aqui, descrevemos as abordagens de estado estacionário, pré-steady-estado, e um único volume de negócios de isolar e medir spetapas ecific durante OGG1 ciclismo catalítico. Um oligonucleótido marcado fluorescente lesão contendo OGG1 e purificados são utilizados para facilitar as medições cinéticas exactas. Uma vez que baixas concentrações de enzima são utilizados para fazer medições de estado estacionário, a mistura de reagentes manuais e têmpera da reacção pode ser executada para determinar a taxa de estado estacionário (k off). Além disso, a extrapolação da taxa em estado estacionário de um ponto na ordenada no tempo zero indica que uma explosão de formação do produto ocorreu durante o primeiro volume (isto é, intercepção de y é positivo). A constante da taxa de fase do sincronismo exponencial de primeira ordem pode ser medida utilizando uma técnica de mistura e de arrefecimento rápido, que examina a quantidade de produto formado em intervalos de tempo curtos (&lt;1 s) antes da fase de estado estacionário correspondendo a uma taxa de 8 -oxoG excisão (isto é, química). O passo de química também pode ser medida utilizando uma abordagem de um único volume de negócios onde ciclismo catalítica éprevenida por ADN com a enzima de substrato saturante (E&gt; S). Estas abordagens podem medir constantes de velocidade elementares que influenciam a eficiência da remoção de uma lesão de DNA.

A análise cinética de estado estacionário foi realizada usando 200 nM de substrato de ADN e quatro diferentes concentrações aparentes de OGG1 (15, 30, 45 e 60 nM), como determinado por um ensaio de proteína de Bradford 2. Os cursos de tempo da formação de produto foram ajustados a uma equação linear para determinar a intercepção de y, que foram de 2,2, 11, 15 e 26 nM, respectivamente, em relação a cada concentração de proteína (Figura 2B). A y-intercepta foram ainda traçada ...

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Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

Cursos de tempo para a actividade de glicosilase de 8-oxoguanina glicosilase de ADN são bifásica exibindo uma explosão de formação do produto e uma fase de estado estacionário linear. Utilizando as técnicas de têmpera de fluxo, o rebentamento e as taxas em estado estacionário pode ser medida, o que corresponde à excisão de 8-oxoguanina e libertação da glicosilase de ADN a partir do produto, respectivamente.

Steady-state Pré-steady-state, e Single-turnover Medição, Kinetic para DNA glicosilase Atividade

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization ...

steady-state-pre-steady-state-single-turnover-kinetic-measurement-for

Research

JoVE Journal

Chemistry

19.2K visualizações.  NIEHS, National Institutes of Health. Cursos de tempo para a actividade de glicosilase de 8-oxoguanina glicosilase de ADN são bifásica exibindo uma explosão de formação do produto e uma fase de estado estacionário linear. Utilizando as técnicas de têmpera de fluxo, o rebentamento e as taxas em estado estacionário pode ser medida, o que corresponde à excisão de 8-oxoguanina e libertação da glicosilase de ADN a partir do produto, respectivamente.

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HPLC Measurement of the DNA Oxidation Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#8217;-deoxyguanosine, in Cultured Cells and Animal Tissues

Oxidative stress is associated with many physiological and pathological processes, as well as xenobiotic metabolism, leading to the oxidation of biomacromolecules, including DNA. Therefore, efficient detection of DNA oxidation is important for a variety of research disciplines, including medicine and toxicology. A common biomarker of oxidatively damaged DNA is 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxo-dGuo; often erroneously referred to as 8-hydroxy-2&#39;-deoxyguanosine (8-OH-dGuo or 8-oxo-dG)). Several protocols for 8-oxo-dGuo measurement by high pressure liquid chromatography with electrochemical detection (HPLC-ED) have been described. However, these were mainly applied to purified DNA treated with pro-oxidants. In addition, due to methodological differences between laboratories, mainly due to differences in analytical equipment, the adoption of published methods for detection of 8-oxo-dGuo by HPLC-ED requires careful optimization by each laboratory. A comprehensive protocol, describing such an optimization process, is lacking. Here, a detailed protocol is described for the detection of 8-oxo-dGuo by HPLC-ED, in DNA from cultured cells or animal tissues. It illustrates how DNA sample preparation can be easily and rapidly optimized to minimize undesirable DNA oxidation that can occur during sample preparation. This protocol shows how to detect 8-oxo-dGuo in cultured human alveolar adenocarcinoma cells (i.e., A549 cells) treated with the oxidizing agent KBrO3, and from the spleen of mice exposed to the polycyclic aromatic hydrocarbon dibenzo(def,p)chrysene (DBC, formerly known as dibenzo(a,l)pyrene, DalP). Overall, this work illustrates how an HPLC-ED methodology can be readily optimized for the detection of 8-oxo-dGuo in biological samples.

HPLC Measurement of the DNA Oxidation Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&amp;#8217;-deoxyguanosine, in Cultured Cells and Animal Tissues

The goal of this protocol is the detection of the DNA oxidation marker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxo-dGuo) by HPLC-ED, in DNA from cultured cells or animal tissues.

A medição por HPLC do ADN Oxidação de biomarcador, 8-oxo-7,8-di-hidro-2&#39;-desoxiguanosina, e em células em cultura de tecidos animais

Oxidative stress is associated with many physiological and pathological processes, as well as xenobiotic metabolism, leading to the oxidation of ...

Química

Preparation of Mica and Silicon Substrates for DNA Origami Analysis and Experimentation

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of these applications require interaction with and adhesion of DNA nanostructures to a substrate. Due to its atomically flat and easily cleaned nature, mica has been the substrate of choice for DNA origami experiments. However, the practical applications of mica are relatively limited compared to those of semiconductor substrates. For this reason, a straightforward, stable, and repeatable process for DNA origami adhesion on derivatized silicon oxide is presented here. To promote the adhesion of DNA nanostructures to silicon oxide surface, a self-assembled monolayer of 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) is deposited from an aqueous solution that is compatible with many photoresists. The substrate must be cleaned of all organic and metal contaminants using Radio Corporation of America (RCA) cleaning processes and the native oxide layer must be etched to ensure a flat, functionalizable surface. Cleanrooms are equipped with facilities for silicon cleaning, however many components of DNA origami buffers and solutions are often not allowed in them due to contamination concerns. This manuscript describes the set-up and protocol for in-lab, small-scale silicon cleaning for researchers who do not have access to a cleanroom or would like to incorporate processes that could cause contamination of a cleanroom CMOS clean bench. Additionally, variables for regulating coverage are discussed and how to recognize and avoid common sample preparation problems is described.

Reproducible cleaning processes for substrates used in DNA origami research are described, including bench-top RCA cleaning and derivatization of silicon oxide. Protocols for surface preparation, DNA origami deposition, drying parameters, and simple experimental set-ups are illustrated.

Preparação de Mica e silício substratos para análise do DNA Origami e Experimentação

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of ...

Ethylene Polymerizations Using Parallel Pressure Reactors and a Kinetic Analysis of Chain Transfer Polymerization

We demonstrate a method for high-throughput catalyst screening using a parallel pressure reactor starting from the initial synthesis of a nickel &#945;-diimine ethylene polymerization catalyst. Initial polymerizations with the catalyst lead to optimized reaction conditions, including catalyst concentration, ethylene pressure and reaction time. Using gas-uptake data for these reactions, a procedure to calculate the initial rate of propagation (kp) is presented. Using the optimized conditions, the ability of the nickel &#945;-diimine polymerization catalyst to undergo chain transfer with diethylzinc (ZnEt2) during ethylene polymerization was investigated. A procedure to assess the ability of the catalyst to undergo chain transfer (from molecular weight and 13C NMR data), calculate the degree of chain transfer, and calculate chain transfer rates (ke) is presented.

A protocol for the high-throughput analysis of polymerization catalyst, chain transfer polymerizations, polyethylene characterization, and reaction kinetic analysis is presented.

Polimerizações etileno utilizando reatores de pressão paralelas e uma análise cinética da cadeia de transferência de Polimerização

We demonstrate a method for high-throughput catalyst screening using a parallel pressure reactor starting from the initial synthesis of a nickel ...

Fabrication and Testing of Photonic Thermometers

In recent years, a push for developing novel silicon photonic devices for telecommunications has generated a vast knowledge base that is now being leveraged for developing sophisticated photonic sensors. Silicon photonic sensors seek to exploit the strong confinement of light in nano-waveguides to transduce changes in physical state to changes in resonance frequency. In the case of thermometry, the thermo-optic coefficient, i.e., changes in refractive index due to temperature, causes the resonant frequency of the photonic device such as a Bragg grating to drift with temperature. We are developing a suite of photonic devices that leverage recent advances in telecom compatible light sources to fabricate cost-effective photonic temperature sensors, which can be deployed in a wide variety of settings ranging from controlled laboratory conditions, to the noisy environment of a factory floor or a residence. In this manuscript, we detail our protocol for the fabrication and testing of photonic thermometers.

We describe the process of fabrication and testing of photonic thermometers.

Fabricação e teste dos termómetros fotônicos

In recent years, a push for developing novel silicon photonic devices for telecommunications has generated a vast knowledge base that is now being ...

Simultaneous Measurement of HDAC1 and HDAC6 Activity in HeLa Cells Using UHPLC-MS

The search for new histone deacetylase (HDAC) inhibitors is of increasing interest in drug discovery. Isoform selectivity has been in the spotlight since the approval of romidepsin, a class I HDAC inhibitor for cancer therapy, and the clinical investigation of HDAC6-specific inhibitors for multiple myeloma. The present method is used to determine the inhibitory activity of test compounds on HDAC1 and HDAC6 in cells. The isoform activity is measured using the ultra-high-performance liquid chromatography &#8211; mass spectrometry (UHPLC-MS) analysis of specific substrates incubated with treated and untreated HeLa cells. The method has the advantage of reflecting the endogenous HDAC activity within the cell environment, in contrast to cell-free biochemical assays conducted on isolated isoforms. Moreover, because it is based on the quantification of synthetic substrates, the method does not require the antibody recognition of endogenous acetylated proteins. It is easily adaptable to several cell lines and an automated process. The method has already proved useful in finding HDAC6-selective compounds in neuroblasts. Representative results are shown here with the standard HDAC inhibitors trichostatin A (non-specific), MS275 (HDAC1-specific), and tubastatin A (HDAC6-specific) using HeLa cells.

The present method serves to identify isoform-specific inhibitors of histone deacetylases (HDAC) in HeLa cells by the UHPLC-MS analysis of multiple substrates. This is an antibody-free method developed to reflect HDAC1 and HDAC6 activity in the living cell environment, in contrast to single-isoform cell-free assays.

Medição simultânea de HDAC1 e atividade HDAC6 em HeLa células usando UHPLC-MS

The search for new histone deacetylase (HDAC) inhibitors is of increasing interest in drug discovery. Isoform selectivity has been in the spotlight since ...

Disentangling High Strength Copolymer Aramid Fibers to Enable the Determination of Their Mechanical Properties

Traditionally, soft body armor has been made from poly(p-phenylene terephthalamide) (PPTA) and ultra-high molecular weight polyethylene. However, to diversify the fiber choices in the United States body armor market, copolymer fibers based on the combination of 5-amino-2-(p-aminophenyl) benzimidazole (PBIA) and the more conventional PPTA were introduced. Little is known regarding the long-term stability of these fibers, but as condensation polymers, they are expected to have potential sensitivity to moisture and humidity. Therefore, characterizing the strength of the materials and understanding their vulnerability to environmental conditions is important for evaluating their use lifetime in safety applications. Ballistic resistance and other critical structural properties of these fibers are predicated on their strength. To accurately determine the strength of the individual fibers, it is necessary to disentangle them from the yarn without introducing any damage. Three aramid-based copolymer fibers were selected for the study. The fibers were washed with acetone followed by methanol to remove an organic coating that held the individual fibers in each yarn bundle together. This coating makes it difficult to separate single fibers from the yarn bundle for mechanical testing without damaging the fibers and affecting their strength. After washing, fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy was performed on both washed and unwashed samples and the results were compared. This experiment has shown that there are no significant variations in the spectra of poly(p-phenylene-benzimidazole-terephthalamide-co-p-phenylene terephthalamide) (PBIA-co-PPTA1) and PBIA-co-PPTA3 after washing, and only a small variation in intensity for PBIA. This indicates that the acetone and methanol rinses are not adversely affecting the fibers and causing chemical degradation. Additionally, single fiber tensile testing was performed on the washed fibers to characterize their initial tensile strength and strain to failure, and compare those to other reported values. Iterative procedural development was necessary to find a successful method for performing tensile testing on these fibers.

The primary goal of the study is to develop a protocol to prepare consistent specimens for accurate mechanical testing of high strength copolymer aramid fibers, by removing a coating and disentangling the individual fiber strands without introducing significant chemical or physical degradation.

Desembaraçar as fibras de aramida de copolímero de alta resistência para permitir a determinação de suas propriedades mecânicas

Traditionally, soft body armor has been made from poly(p-phenylene terephthalamide) (PPTA) and ultra-high molecular weight polyethylene. However, to ...

Technical Aspect of the Automated Synthesis and Real-Time Kinetic Evaluation of [11C]SNAP-7941

Positron emission tomography (PET) is an essential molecular imaging technique providing insights into pathways and using specific targeted radioligands for in vivo investigations. Within this protocol, a robust and reliable remote-controlled radiosynthesis of [11C]SNAP-7941, an antagonist to the melanin-concentrating hormone receptor 1, is described. The radiosynthesis starts with cyclotron produced [11C]CO2 that is subsequently further reacted via a gas-phase transition to [11C]CH3OTf. Then, this reactive intermediate is introduced to the precursor solution and forms the respective radiotracer. Chemical as well as the radiochemical purity are determined by means of RP-HPLC, routinely implemented in the radiopharmaceutical quality control process. Additionally, the molar activity is calculated as it is a necessity for the following real-time kinetic investigations. Furthermore, [11C]SNAP-7941 is applied to MDCKII-WT and MDCKII-hMDR1 cells for evaluating the impact of P-glycoprotein (P-gp) expression on cell accumulation. For this reason, the P-gp expressing cell line (MDCKII-hMDR1) is either used without or with blocking prior to experiments by means of the P-gp substrate (&#177;)-verapamil and the results are compared to the ones observed for the wildtype cells. The overall experimental approach demonstrates the importance of a precise time-management that is essential for every preclinical and clinical study using PET tracers radiolabelled with short-lived nuclides, such as carbon-11 (half-life: 20 min).

Technical Aspect of the Automated Synthesis and Real-Time Kinetic Evaluation of [11C]SNAP-7941

Here, we represent a protocol for the fully automated radiolabelling of [11C]SNAP-7941 and the analysis of the real-time kinetics of this PET-tracer on P-gp expressing and non-expressing cells.

Aspecto técnico da síntese automatizada e avaliação cinética em tempo real de [11C] SNAP-7941

Positron emission tomography (PET) is an essential molecular imaging technique providing insights into pathways and using specific targeted radioligands ...

NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

NMR spectroscopy is often used for the identification and characterization of enzyme inhibitors in drug discovery, particularly in the context of fragment screening. NMR-based activity assays are ideally suited to work at the higher concentrations of test compounds required to detect these weaker inhibitors. The dynamic range and chemical shift dispersion in an NMR experiment can easily resolve resonances from substrate, product, and test compounds. This contrasts with spectrophotometric assays, in which read-out interference problems often arise from compounds with overlapping UV-vis absorption profiles. In addition, since they lack reporter enzymes, the single-enzyme NMR assays are not prone to coupled-assay false positives. This attribute makes them useful as orthogonal assays, complementing traditional high throughput screening assays and benchtop triage assays. Detailed protocols are provided for initial compound assays at 500 &#956;M and 250 &#956;M, dose-response assays for determining IC50 values, detergent counter screen assays, jump-dilution counter screen assays, and assays in E. coli whole cells. The methods are demonstrated using two nucleoside ribohydrolase enzymes. The use of 1H NMR is shown for the purine-specific enzyme, while 19F NMR is shown for the pyrimidine-specific enzyme. The protocols are generally applicable to any enzyme where substrate and product resonances can be observed and distinguished by NMR spectroscopy. To be the most useful in the context of drug discovery, the final concentration of substrate should be no more than 2-3x its Km value. The choice of NMR experiment depends on the enzyme reaction and substrates available as well as available NMR instrumentation.

NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

NMR-based activity assays have been developed to identify and characterize inhibitors of two nucleoside ribohydrolase enzymes. Protocols are provided for initial compound assays at 500 &#956;M and 250 &#956;M, dose-response assays for determining IC50 values, detergent counter screen assays, jump-dilution counter screen assays, and assays in E. coli whole cells.

Ensaios de atividade com base em RMN para determinação da inibição de compostos, valores de IC50 , atividade Artifactual e atividade de células inteiras de Ribohidrolases nucleósidos

NMR spectroscopy is often used for the identification and characterization of enzyme inhibitors in drug discovery, particularly in the context of fragment ...

A Femtoliter Droplet Array for Massively Parallel Protein Synthesis from Single DNA Molecules

Advances in spatial resolution and detection sensitivity of scientific instrumentation make it possible to apply small reactors for biological and chemical research. To meet the demand for high-performance microreactors, we developed a femtoliter droplet array (FemDA) device and exemplified its application in massively parallel cell-free protein synthesis (CFPS) reactions. Over one million uniform droplets were readily generated within a finger-sized area using a two-step oil-sealing protocol. Every droplet was anchored in a femtoliter microchamber composed of a hydrophilic bottom and a hydrophobic sidewall. The hybrid hydrophilic-in-hydrophobic structure and the dedicated sealing oils and surfactants are crucial for stably retaining the femtoliter aqueous solution in the femtoliter space without evaporation loss. The femtoliter configuration and the simple structure of the FemDA device allowed minimal reagent consumption. The uniform dimension of the droplet reactors made large-scale quantitative and time-course measurements convincing and reliable. The FemDA technology correlated the protein yield of the CFPS reaction with the number of DNA molecules in each droplet. We streamlined the procedures about the microfabrication of the device, the formation of the femtoliter droplets, and the acquisition and analysis of the microscopic image data. The detailed protocol with the optimized low running cost makes the FemDA technology accessible to everyone who has standard cleanroom facilities and a conventional fluorescence microscope in their own place.

The overall goal of the protocol is to prepare over one million ordered, uniform, stable, and biocompatible femtoliter droplets on a 1 cm2 planar substrate that can be used for cell-free protein synthesis.

Uma matriz de gotícula femtoliter para síntese de proteínas massivamente paralelas de moléculas de DNA único

Advances in spatial resolution and detection sensitivity of scientific instrumentation make it possible to apply small reactors for biological and ...

Quantitative Atomic-Site Analysis of Functional Dopants/Point Defects in Crystalline Materials by Electron-Channeling-Enhanced Microanalysis

A novel elemental and chemical analysis scheme based on electron-channeling phenomena in crystalline materials is introduced, where the incident high-energy electron beam is rocked with the submicrometric pivot point fixed on a specimen. This method enables us to quantitatively derive the site occupancies and site-dependent chemical information of impurities or intentionally doped functional elements in a specimen, using energy-dispersive X-ray spectroscopy and electron energy-loss spectroscopy attached to a scanning transmission electron microscope, which is of significant interest to current materials science, particularly related to nanotechnologies. This scheme is applicable to any combination of elements even when the conventional Rietveld analysis by X-ray or neutron diffraction occasionally fails to provide the desired results because of limited sample sizes and close scattering factors of neighboring elements in the periodic table. In this methodological article, we demonstrate the basic experimental procedure and analysis method of the present beam-rocking microanalysis.

We provide a general outline of quantitative microanalysis methods for estimating the site occupancies of impurities and their chemical states by taking advantage of electron-channeling phenomena under incident electron beam-rocking conditions, which reliably extract information from minority species, light elements, oxygen vacancies, and other point/line/planar defects.