Este protocolo fornece um método benchtop para avaliar a eficácia e os mecanismos de ação da histotripsia auxiliada terapia trombolítico ou lysotripsy, uma abordagem alternativa não invasiva para o tratamento da trombose venosa profunda crítica. Esta técnica usa a atividade bolha para ter um efeito bidirecionário através de uma fibrinólise aumentada devido a uma entrega lítica aprimorada e à hemólise dos glóbulos vermelhos dentro do coágulo. Essa abordagem de bancada para o tratamento da trombose venosa profunda facilita a modelagem de coágulos sanguíneos, tratamento com lise e imagem simultânea durante o tratamento.
Geração de nuvens de bolhas, planejamento de tratamento e orientação de imagem podem ser usados para investigar tratamentos in vitro baseados em histotripsia de outras doenças, como tumores renais e hepáticos. Para configurar a fonte histotripsy, monte a fonte em um sistema de posicionamento motorizado. Cubra a matriz de imagens com uma tampa de sonda e fixe a matriz coaxialmente na abertura da fonte histotripsy.
Conecte a matriz de imagens a um sistema de varredura de ultrassom e submerga completamente a fonte de histotripsy e a matriz de imagem no tanque. Use uma seringa para remover suavemente quaisquer bolhas de ar e use o conjunto de imagens e o scanner para adquirir imagens de água desgaseadas no modo B a 20 quadros por segundo. Ao adquirir as imagens, ajuste a posição do conjunto de imagens dentro da abertura do transdutor confocal até que a nuvem de bolha esteja localizada aproximadamente no centro da janela da imagem e registe a localização focal detectada na janela de imagem.
Em seguida, descontinua a insssonação e defina a tensão aplicada à fonte histotripsia a zero. Para preparar um coágulo para análise, use um alicate para cortar a extremidade selada de uma pipeta contendo um coágulo e deixar o coágulo e o soro deslizarem em uma placa de petri. Use um bisturi para cortar o coágulo a um centímetro de comprimento e use uma limpeza para borrar suavemente a seção de corte para remover qualquer excesso de fluido.
Use pinças para colocar cuidadosamente a seção do coágulo em uma balança e registrar o peso. Em seguida, levante manualmente o canal de fluxo de um reservatório de água desgase reverso e remova o vaso modelo do canal. Use pinças para colocar cuidadosamente o coágulo no vaso modelo sem danificar o coágulo e anexar o vaso ao canal de fluxo.
Abaixe o canal de fluxo para dentro do tanque de tal forma que a extremidade proximal do estágio em relação ao reservatório seja baixa em comparação com o lado distal, e use uma pipeta para adicionar 30 microliters de 37 graus Celsius de plasma aquecido ao reservatório. Monitore a temperatura do reservatório de água até atingir pelo menos 36 graus Celsius, e use uma pipeta para adicionar 80,4 microgramas de rt-PA no reservatório de plasma. Para preparar o canal de fluxo, use uma bomba de seringa para atrair plasma do reservatório para o canal até que o vaso modelo tenha sido preenchido.
Em seguida, nivele manualmente o vaso modelo para garantir que não haja bolhas de ar no vaso modelo, como visto dentro da janela de imagem. Para planejar um caminho para a fonte de histotripsy e a matriz de imagem para uma exposição uniforme de histotripsy ao longo do comprimento do coágulo, use o script de imagem para usar os posicionadores motorizados para alinhar a matriz de imagem paralelamente ao comprimento do coágulo e confirmar que não há bolhas de ar presentes no vaso. Use os posicionadores motorizados para alinhar a matriz de imagem de forma que o plano de imagem seja paralelo à seção transversal do coágulo.
Usando a janela de imagem como guia, mova a fonte de histotripsia para a extremidade proximal do coágulo, em relação ao reservatório. Para determinar o caminho de inseção ao longo do comprimento do coágulo, defina pontos de passagem ao longo do comprimento do coágulo em incrementos de cinco milímetros. Antes de finalizar cada ponto de passagem, o teste de fogo pulsa da fonte histotripsy com os mesmos parâmetros de insalação que demonstrados, mas com a exposição geral reduzida a 10 pulsos totais.
Em cada ponto de passagem, salve as posições do motor usando os comandos designados pelo fabricante. Para tratar o coágulo ao longo de seu comprimento de acordo com o caminho definido na etapa de pré-tratamento, coloque a bomba de seringa em 0,65 mililitros por minuto, e espere o menisco do plasma se mover. Interpolar o caminho de tratamento com passos intermediários entre os pontos de passagem estabelecidos com um tamanho de passo fixo, e use os posicionadores para mover a fonte de histotripsia em cada local do caminho, usando os parâmetros de inseção originalmente definidos.
Em seguida, crie um script para definir o conjunto de imagens para adquirir uma imagem de modo B do coágulo e do vaso modelo alguns segundos antes da aplicação do pulso histotripsy em cada local. Em seguida, aplique o pulso histotripsy em cada ponto de passagem, adquirindo as emissões acústicas no script para formar imagens passivas de cavitação após a análise. Use a janela de imagem para imagem da atividade da bolha durante a aplicação do pulso histotripsy em cada local do caminho.
Após a análise, levante manualmente o vaso modelo para fora do reservatório de água para drenar o perfusado via gravidade, e use a bomba de seringa para retirar a solução de plasma do canal de fluxo para permitir a coleta de todo o perfusato em um pequeno béquer. Desconecte o vaso modelo e remova o coágulo. Em seguida, limpe o coágulo com tecidos de laboratório e pese o coágulo para avaliar a perda de massa do coágulo.
Após a aplicação de tensão suficiente à fonte histotripsia, uma nuvem de bolha é gerada na região focal do transdutor e visualizada através de imagens de ultrassom. A posição focal é definida como o centro da nuvem de bolha. Este controle perfusado de um coágulo exposto apenas ao plasma, e este perfusato de um coágulo tratado de lysotripsy foi usado para avaliar o teor de hemoglobina e D-dimer como demonstrado.
A variabilidade na concentração de hemoglobina pode ser quantificada por absorvância óptica. Aqui, um coágulo pode ser visualizado dentro de um vaso modelo via imagem do modo B antes da exposição à histotripsia para determinar a posição do coágulo para segmentação da imagem de cavitação passiva. Como esta imagem de cavitação passiva co-registrada com a imagem do modo B do coágulo confirma, a energia acústica é contida principalmente dentro do coágulo durante a exposição à histotripsia.
Em amostras expostas à histotripsia, a interrupção é restrita principalmente ao centro do coágulo, consistente com os locais observados de atividade de bolhas rastreados por meio de imagens de cavitação passiva. Com a adição de lítico, a perda de massa também ocorre em regiões mais próximas da periferia do coágulo. Alternativamente, lipossomos ecológicos contendo rt-PA podem ser usados no lugar da entrega sistêmica de rt-PA para permitir a avaliação da entrega de medicamentos direcionados ao coágulo.
A lysotripsy fornece uma abordagem alternativa não invasiva ao tratamento de muitas doenças. Este protocolo in vitro permite a avaliação da eficácia do tratamento e seu potencial sucesso na aplicação in vivo.
