Este protocolo permite que o pesquisador monitore a atividade e a resposta de neurônios sensoriais únicos a uma estimulação controlada em uma vértebra de comportamento intacta. Esta eletrofisiologia de patches é uma maneira rápida e direta de registrar a partir da atividade de espiar de neurônios individuais em tempo real. E isso proporciona melhor resolução de tempo e sensibilidade a um custo menor do que a maioria das técnicas de imagem óptica.
As células ciliares da linha lateral são homólogas às do ouvido interno humano. Então essa técnica está pronta para revelar as propriedades dos circuitos de células ciliadas que se aplicam à surdez humana e distúrbios auditivos. Eletrofisiologia é uma nave que utiliza habilidades motoras finas que precisa ser vista e imitada fisicamente.
As instruções do texto deixam muito espaço para má interpretação. Para começar, dispense uma fina camada de elastômero de silicone auto-misturado, como Sylgard, em um prato de cultura de tecido com fundo de vidro para fazer um prato de gravação de fundo de elastômero de silicone. Para fazer pinos de dissecção, forneça uma carga negativa de cinco volts a um béquer de 100 mililitros de Etchant usando uma fonte de alimentação DC e conecte um fio de tungstênio à saída carregada positivamente.
Mergulhe repetidamente a ponta do fio no banho Etchant até que a ponta se reduza a um ponto afiado. Sob um microscópio estéreo, corte o fio aproximadamente um milímetro da ponta com uma lâmina de barbear de borda reta. Repita isso três vezes e insira pinos no prato de gravação curado usando fórceps finos.
Para preparar eletrodos de gravação, puxe tubos capilares de vidro borossilicato usando um puxador de micropipette com filamento de caixa. O eletrodo deve ter uma ponta de diâmetro de 30 micrômetros com um taper que será usado para registrar neurônios diferentes da linha lateral posterior. Puxe um tubo capilar de vidro borossilicato adicional em um par de eletrodos com diâmetros menores de uma a cinco mímetros.
Segurando um eletrodo em cada mão, execute delicadamente as pontas umas pelas outras para quebrar as pontas. Com um microforge, polir a ponta chanfrada até ficar homogêneo. O diâmetro da ponta final deve ser entre 30 a 50 micrômetros.
Imobilize as larvas de zebrafish e transfira-as para uma placa de petri de 35 milímetros usando uma grande ponta para transferir pipeta. Remova o máximo possível da solução circundante. Mergulhe larvas em 10 microlitadores de 0,1% alfa-Bungarotoxin por aproximadamente cinco minutos.
Lave a larva paralisada com solução extracelular por 10 minutos. Em seguida, use uma pipeta de transferência para mover a larva do banho de solução extracelular para o prato de gravação com fundo de silicone. Sob um microscópio estéreo, posicione suavemente as larvas com fórceps finos sobre o centro deste tapete de silicone, lado lateral para cima com as extremidades anterior e posterior do corpo correndo da esquerda para a direita.
Utilizando fórceps finos, insira o pino da borda ortogonalmente ao silicone através do notochord dorsal das larvas diretamente dorsal ao ânus. Insira o segundo pino através do notochord perto da extremidade da cauda e insira o terceiro pino através do notochord dorsal da bexiga de gás. Insira o quarto pino através da vesícula otica, proporcionando uma leve rotação à medida que o pino se insere no encapsulante.
À medida que uma leve rotação é aplicada, observe o tecido entre o cleithrum e o vesícula otic para revelar o aglomerado de somata aferente. Coloque a larva do pino sob o objetivo de 10 vezes em um estágio fixo do microscópio DIC e oriente as fissuras mioceptais dos blocos musculares paralelos ao vetor do estágio da cabeça esquerda. Coloque o fio moído na solução do banho e certifique-se de que ele esteja conectado ao estágio da cabeça esquerda.
Encha o eletrodo de gravação VR com 30 microliters de solução extracelular usando uma ponta flexível de pipeta de carregamento de gel e insira-o no suporte de pipeta da cabeça esquerda. Aumente a ampliação para 40 vezes e baixe a pipeta de gravação na solução do prato, aplicando pressão positiva produzida por um transdutor pneumático. Leve a ponta do eletrodo sobre um myoseptum entre os dois myomeres ventral para a linha lateral até que a fissura esteja centrada na abertura da ponta do eletrodo VR Abaixe a pipeta até que a borda defasada da abertura da ponta entre em contato suavemente com o epitélio.
Após o contato inicial, manobre a pipeta na diagonal para garantir que a borda principal faça contato e possa gerar uma vedação. Aplique pressão negativa com o transdutor pneumático e segure-o. No software de grampo de correção, clique no botão Reproduzir na barra de ferramentas para monitorar o sinal VR.
Certifique-se de que a gravação vr está sendo alcançada uma vez que a atividade do neurônio motor com a dinâmica de sinal de explosão estereotipado de Wells é observada. Encha o eletrodo de gravação aferente com 30 microliters de solução extracelular e insira-o no suporte de pipeta da cabeça direita. Em seguida, abaixe-o na solução de prato enquanto aplica pressão positiva produzida por um transdutor pneumático.
Localize o eletrodo e traga a ponta do eletrodo sobre a amostra. Usando um micromanipulador, abaixe a ponta de eletrodo diferente até que esteja mantendo posição acima do cleithrum. Aumente a ampliação para 40 vezes a imersão e localize a intersecção do nervo da linha lateral posterior e do cleithrum.
Leve a ponta do eletrodo sobre o gânglio aferente e baixe a pipeta até que a ponta entre em contato com o epitélio. Suavemente, manobre o eletrodo para que toda a circunferência da ponta entre em contato com o gânglio aferente. Aplique pressão negativa com o transdutor pneumático e segure-o.
Depois de clicar em Reproduzir no software de grampo de remendo, certifique-se de que toda a gravação de correção solta de células de neurônios aferentes seja alcançada quando os picos ocorrerem espontaneamente aproximadamente a cada 100 a 200 milissegundos. Uma vez detectada a atividade de neurônios e neurônios motores, clique no botão Gravar na barra de ferramentas no grampo de pico 10 para capturar gravações simultâneas livres de lacunas em ambos os canais. Realize o pré-processamento de dados conforme descrito no manuscrito do texto.
Usando este protocolo de gravação livre de lacunas, a atividade em tempo real de neurônios aferentes e VR pode ser medida simultaneamente. Scripts escritos personalizados e pré-processamento geram parcelas para auxiliar na visualização da detecção de picos usando parâmetros como limiar, duração mínima e intervalo mínimo de interspike. Sinais isolados foram obtidos ajustando as variáveis de detecção de limite inferior e superior no script de pré-processamento.
A detecção de picos de raízes ventral segue parâmetros idênticos com entradas adicionais. As rajadas dentro de um comando motor são definidas por um mínimo de dois picos dentro de 0,1 milissegundos com duração de cinco milissegundos pelo menos e delineadas por um mínimo de três rajadas com intervalos de bloqueio inferiores a 200 milissegundos Os scripts pré-processamento irão sobrepor seções de atividade aferente inseridas em um período bem definido de interesse. Neste caso, a atividade espontânea média mostra mudanças dramáticas em resposta ao início da atividade motora retratada no eixo X como tempo igual a zero.
Diferenças significativas foram detectadas em diferentes taxas de pico entre as taxas de pico pré-natação e as taxas de pico dos períodos de natação e pós-natação. As taxas de pico aferentes foram negativamente correlacionadas com a duração da natação. Não há correlação detectada entre a taxa de pico relativo e a frequência de natação.
A saúde animal é a coisa mais importante na tentativa desse procedimento. É crucial monitorar o fluxo sanguíneo rápido para não apenas garantir o bem-estar animal, mas também aumentar a probabilidade de sucesso de registro neural. Ao aproveitar ferramentas genéticas disponíveis no Zebrafish, este protocolo de eletrofisiologia pode ser elogiado por linhas transgênicas para investigar poderosamente a conectividade de circuitos anatômicos e funcionais em sistemas de células ciliadas e além.
Esta modificação simplificada da técnica de grampo de remendo nos permite monitorar como os sistemas sensoriais funcionam in vivo.
