Этот протокол позволяет исследователю контролировать активность и реакцию отдельных сенсорных нейронов на контролируемую стимуляцию в неповрежденных позвонках. Эта патч-электрофизиология является быстрым и прямым способом записи всплесков активности отдельных нейронов в режиме реального времени. И это обеспечивает лучшее временное разрешение и чувствительность при меньших затратах, чем большинство методов оптической визуализации.
Волосковые клетки боковой линии гомологичны клеткам внутреннего уха человека. Таким образом, этот метод готов выявить свойства контуров волосковых клеток, которые применяются к глухоте человека и нарушениям слуха. Электрофизиология - это ремесло, использующее мелкую моторику, которую нужно видеть и физически имитировать.
Текстовые инструкции оставляют слишком много места для неправильного толкования. Для начала дозируют тонкий слой самомешиваемого силиконового эластомера, такого как Sylgard, в чашку для культивирования тканей со стеклянным дном, чтобы сделать силиконовую эластомерную нижнюю записывающую тарелку. Чтобы сделать рассеченные контакты, обеспечьте отрицательный заряд в пять вольт на 100-миллилитровый кок для травления с помощью источника питания постоянного тока и прикрепите вольфрамовый провод к положительно заряженному выходу.
Многократно опускайте наконечник проволоки в ванну Etchant до тех пор, пока кончик не сузится до острой точки. Под стереомикроскопом отрежьте проволоку примерно в одном миллиметре от наконечника лезвием бритвы с прямым краем. Повторите это три раза, затем вставьте штифты в отвержденную пластину записи, используя тонкие щипцы.
Для подготовки записывающих электродов вытягивайте боросиликатные стеклянные капиллярные трубки с помощью съемника микропипетки с коробчатой нитью. Электрод должен иметь наконечник диаметром 30 микрометров с конусом, который будет использоваться для записи афферентных нейронов с задней боковой линии. Потяните дополнительную боросиликатную стеклянную капиллярную трубку в пару электродов с меньшим диаметром наконечника от одного до пяти микрометров.
Держа по одному электроду в каждой руке, осторожно провести кончиками друг по другу, чтобы сломать наконечники. Используя микроковалку, отполирует скошенный наконечник до однородной массы. Конечный диаметр наконечника должен составлять от 30 до 50 микрометров.
Обездвиживайте личинок рыбок данио и перекладывайте их в 35-миллиметровую чашку Петри, используя большой наконечник для переноса пипетки. Удалите как можно больше окружающего раствора. Погрузите личинок в 10 микролитров 0,1% альфа-бунгаротоксина примерно на пять минут.
Промыть парализованную личинку внеклеточным раствором в течение 10 минут. Затем используйте переносную пипетку, чтобы переместить личинку из ванны с внеклеточным раствором в силиконовую нижнюю записывающее блюдо. Под стереомикроскопом осторожно расположите личинок с мелкими наконечниками щипцов над центром этого силиконового коврика, боковой стороной вверх с передним и задним концами тела, идущими слева направо.
Используя тонкие щипцы с наконечниками, вставьте край штыря ортогонально к силикону через дорсальную нотохорду личинок непосредственно дорсально к анусу. Вставьте второй штифт через нотохорду ближе к концу хвоста и вставьте третий штифт через нотохордную дорсальную часть газового пузыря. Вставьте четвертый штифт через отический везикулу, обеспечивая при этом небольшое вращение, когда штифт вставляется в инкапсулант.
При небольшом вращении следите за тканью между клейтрумом и отическим везикулом, чтобы выявить скопление афферентных сомат. Поместите личинку штыря под 10-кратный объектив на фиксированной ступени микроскопа ДВС-КРВ и ориентируйте миоцептальные расщелины мышечных блоков параллельно вектору левой стадии головы. Поместите провод заземления в раствор ванны и убедитесь, что он подключен к левой головной ступени.
Заполните записывающий электрод VR 30 микролитрами внеклеточного раствора с помощью гибкого наконечника пипетки с гелевой загрузкой и вставьте его в держатель пипетки с левой головкой. Увеличьте увеличение до 40 раз и опустите записывающую пипетку в раствор тарелки, применяя положительное давление, создаваемое пневматическим преобразователем. Поднесите наконечник электрода над миосектумом между двумя вентральными миомерами к боковой линии, пока расщелина не будет центрирована в отверстии кончика электрода VR Опускайте пипетку до тех пор, пока запаздывающий край отверстия кончика мягко не соприкоснется с эпителием.
После первоначального контакта маневрируйте пипеткой по диагонали, чтобы убедиться, что передовая кромка вступает в контакт и может генерировать уплотнение. Приложить отрицательное давление с помощью пневматического преобразователя и удерживать его. В программном обеспечении patch clamp нажмите кнопку Play на панели инструментов, чтобы отслеживать сигнал VR.
Убедитесь, что запись VR достигается после того, как наблюдается активность двигательных нейронов со стереотипной динамикой сигнала всплеска Уэллса. Заполните афферентный записывающий электрод 30 микролитрами внеклеточного раствора и вставьте его в держатель пипетки правой головки. Затем опуская его в раствор для посуды, применяя положительное давление, создаваемое пневматическим преобразователем.
Найдите электрод и поднесите наконечник электрода к образцу. Используя микроманипулятор, опустите наконечник афферентного электрода до тех пор, пока он не удержит положение над клейтрумом. Увеличьте увеличение до 40-кратного погружения и найдите пересечение задней боковой линии нерва и клейтроума.
Поднесите наконечник электрода над афферентным ганглием и опустите пипетку до тех пор, пока наконечник не соприкнется с эпителием. Осторожно маневрируйте электродом так, чтобы вся окружность кончика контактировала с афферентным ганглием. Приложить отрицательное давление с помощью пневматического преобразователя и удерживать его.
После нажатия кнопки «Воспроизвести» в программном обеспечении зажима патча убедитесь, что запись афферентных нейронов вся клетка свободна, когда всплески происходят спонтанно примерно каждые 100-200 миллисекунд. После обнаружения активности афферентных нейронов и двигательных нейронов нажмите кнопку «Запись» на панели инструментов в пиковом зажиме 10, чтобы захватить одновременные записи без зазоров в обоих каналах. Выполните предварительную обработку данных, как описано в текстовой рукописи.
Используя этот протокол записи без пробелов, активность афферентных и VR-нейронов в реальном времени может быть измерена одновременно. Пользовательские сценарии предварительной обработки генерируют графики, помогая в визуализации обнаружения всплесков с использованием таких параметров, как порог, минимальная продолжительность и минимальный интервал между ударами. Изолированные сигналы были получены путем настройки переменных обнаружения нижней и верхней границ в скрипте предварительной обработки.
Обнаружение шипов вентральных корней следует идентичным параметрам с дополнительными входами. Всплески в команде двигателя определяются минимум двумя пиками в течение 0,1 миллисекунд продолжительностью не менее пяти миллисекунд и очерчены как минимум тремя всплесками с интервалами между вспышками менее 200 миллисекунд Сценарии предварительной обработки будут накладывать участки афферентной активности, введенные в четко определенный период интереса. В этом случае средняя спонтанная активность показывает драматические изменения в ответ на начало двигательной активности, изображенной на оси X как время, равное нулю.
Были обнаружены значительные различия в афферентных показателях всплесков между показателями всплесков до заплыва и пиками как в периоды плавания, так и после заплыва. Частота афферентных всплесков отрицательно коррелировала с продолжительностью плавания. Не обнаружено никакой корреляции между относительной скоростью всплесков и частотой плавания.
Здоровье животных является самой важной вещью при попытке попробовать эту процедуру. Крайне важно контролировать быстрый кровоток, чтобы не только обеспечить благополучие животных, но и увеличить вероятность успеха нейронной записи. Используя генетические инструменты, доступные в Рыбок данио, этот электрофизиологический протокол может быть дополнен трансгенными линиями для мощного исследования анатомической и функциональной связности цепей в системах волосковых клеток и за их пределами.
Эта упрощенная модификация техники зажимов позволяет нам контролировать, как сенсорные системы функционируют in vivo.
