פרוטוקול זה מאפשר לחוקר לעקוב אחר הפעילות והתגובה של נוירונים חושיים בודדים לגירוי מבוקר בחוליות התנהגות שלמות. אלקטרופיזיולוגיה תיקון זה היא דרך מהירה וישירה להקליט מן הפעילות spiking של נוירונים בודדים בזמן אמת. וזה מספק רזולוציית זמן ורגישות טובות יותר בעלות נמוכה יותר מרוב טכניקות ההדמיה האופטית.
תאי השיער הקווים לרוחב הם הומולוגיים לאלה של האוזן הפנימית האנושית. אז טכניקה זו צפויה לחשוף את המאפיינים של מעגלי תאי השיער החלים על חירשות אנושית והפרעות שמיעה. אלקטרופיזיולוגיה היא מלאכה המשתמשת במיומנויות מוטוריות עדינות שיש לראות ולחקות פיזית.
הוראות טקסט בלבד משאירות יותר מדי מקום לפרשנות שגויה. כדי להתחיל, לוותר על שכבה דקה של אלסטומר סיליקון ערבוב עצמי כגון Sylgard לתוך צלחת תרבית רקמות תחתית זכוכית כיסוי לעשות צלחת הקלטה התחתונה אלסטומר סיליקון. כדי לבצע סיכות ניתוח, לספק מטען שלילי של חמישה וולט 100 מיליליטר של Etchant באמצעות ספק כוח DC ולחבר חוט טונגסטן לפלט טעון חיובית.
שוב ושוב טובלים את קצה החוט לתוך האמבטיה Etchant עד הקצה מצטמצם לנקודה חדה. תחת מיקרוסקופ סטריאו, חותכים את החוט כמילימטר מהקצה עם סכין גילוח בקצה ישר. חזור על זה שלוש פעמים ולאחר מכן להכניס סיכות לתוך צלחת ההקלטה נרפא באמצעות מלקחיים עדינים.
כדי להכין אלקטרודות הקלטה, למשוך צינורות נימי זכוכית borosilicate באמצעות פולר micropipette עם חוט תיבת. האלקטרודה צריכה להיות קצה קוטר 30 מיקרומטר עם להתחדד שישמש כדי להקליט נוירונים afferent מהקו לרוחב האחורי. משוך צינור נימי זכוכית בורוסיליקט נוסף לתוך זוג אלקטרודות עם קטרים קטנים יותר של קצה אחד עד חמישה מיקרומטר.
מחזיק אלקטרודה אחת בכל יד, בעדינות להפעיל את הטיפים אחד על פני השני כדי לשבור את הטיפים. בעזרת מיקרופורג', יש ללטש את הקצה המשופע עד לקבלת מרקם חלק. קוטר הקצה הסופי צריך להיות בין 30 ל 50 מיקרומטר.
לשתק זחלי זברה ולהעביר אותם לתוך צלחת פטרי 35 מילימטר באמצעות קצה גדול להעביר פיפטה. הסר כמה שיותר מהפתרון שמסביב. לטבול זחלים ב 10 microliters של 0.1%אלפא-Bungarotoxin במשך כחמש דקות.
לשטוף את הזחל משותק עם פתרון חוץ תאי במשך 10 דקות. לאחר מכן, השתמש פיפטה העברה להעביר את הזחל מאמבט פתרון חוץ תאי לצלחת הקלטה תחתית סיליקון. תחת מיקרוסקופ סטריאו, מקם בעדינות את הזחלים עם מלקחיים עדינים מעל מרכז מחצלת סיליקון זו, צד לרוחב כלפי מעלה עם הקצוות הצדדיים והאחוריים של הגוף רצים משמאל לימין.
באמצעות מלקחיים עדינים, הכנס את סיכת הקצה אורתוגונלית לסיליקון דרך הנוכורד הגבי של הזחלים ישירות הגב לפי הטבעת. הכנס את הסיכה השנייה דרך notochord ליד סוף הזנב והכנס את הסיכה השלישית דרך הגב notochord של שלפוחית הגז. הכנס את הסיכה הרביעית דרך מעטה האוטי תוך מתן סיבוב קל כאשר הסיכה מוכנסת לתוך האנקפסולנט.
כמו סיבוב קל מוחל, לצפות את הרקמה בין cleithrum ואת vesicle אוטי לחשוף את האשכול של סומטה afferent. מניחים את זחל הסיכה תחת המטרה 10 פעמים על שלב קבוע של מיקרוסקופ DIC ומכוונים את שסועות mioceptal של גושי השרירים במקביל וקטור שלב הראש השמאלי. מניחים את חוט הקרקע בתמיסת האמבטיה ומבטיחים שהוא מחובר לשלב הראש השמאלי.
מלאו את אלקטרודת הקלטת ה-VR ב-30 מיקרוליטרים של פתרון חוץ-תאי בעזרת קצה פיפטה גמיש לטעינת ג'ל והכניסו אותו למחזיק פיפטה שמאלי. להגדיל את ההגדלה ל 40 פעמים ולהוריד את פיפטה הקלטה לתוך הפתרון צלחת תוך הפעלת לחץ חיובי המיוצר על ידי מתמר פנאומטי. מביאים את קצה האלקטרודה מעל myoseptum בין שני מיומרים גחוני לקו לרוחב עד שסוע מרוכז צמצם קצה אלקטרודה VR התחתון את פיפטה עד הקצה מפגר של מפתח קצה בעדינות יוצר קשר עם האפיתל.
לאחר מגע ראשוני, לתמרן את פיפטה באלכסון כדי להבטיח את הקצה המוביל יוצר קשר והוא יכול ליצור חותם. החל לחץ שלילי עם מתמר פנאומטי ולהחזיק אותו. בתוכנת מלחציים תיקון, לחץ על כפתור הפעל בסרגל הכלים כדי לפקח על אות VR.
ודא כי הקלטת VR מושגת לאחר פעילות נוירון מוטורי עם דינמיקת אות פרץ סטריאוטיפי ולס נצפו. מלאו את אלקטרודת ההקלטה האדישה ב-30 מיקרוליטרים של תמיסת חוץ-תאית והכניסו אותה למחזיק פיפטה של שלב הראש הימני. ואז להוריד אותו לתוך פתרון המנה תוך הפעלת לחץ חיובי המיוצר על ידי מתמר פנאומטי.
אתר את האלקטרודה והבא את קצה האלקטרודה מעל הדגימה. באמצעות micromanipulator, להוריד את קצה אלקטרודה afferent עד שהוא מחזיק עמדה מעל cleithrum. להגדיל את ההגדלה ל 40 פעמים טבילה ולאתר את הצומת של עצב הקו לרוחב האחורי cleithrum.
מביאים את קצה האלקטרודה מעל הגנגליון האדיש ומנמיכים את הפיפט עד שהקצה יוצר קשר עם האפיתל. בעדינות, לתמרן את האלקטרודה כך היקף הקצה כולו יוצר קשר עם גנגליון afferent. החל לחץ שלילי עם מתמר פנאומטי ולהחזיק אותו.
לאחר לחיצה על הפעל בתוכנת מהדק התיקון, ודא כי הקלטת תיקון רופף התא כולו של נוירונים afferent מושגת כאשר קוצים להתרחש באופן ספונטני בערך כל 100 עד 200 אלפיות שנייה. לאחר נוירון afferent ופעילות נוירון מוטורי מזוהים שניהם, לחץ על כפתור הקלטה בסרגל הכלים בהידוק שיא 10 כדי ללכוד הקלטות ללא פער בו זמנית בשני הערוצים. בצע עיבוד מקדים של נתונים כמתואר בכתב היד של הטקסט.
באמצעות פרוטוקול הקלטה זה ללא פערים, ניתן למדוד בו-זמנית את הפעילות בזמן אמת של נוירונים afferent ו- VR. קבצי Script שנכתבו מראש ועיבוד מראש מותאמים אישית יוצרים התוויות כדי לסייע בהדמיה של זיהוי ספייק באמצעות פרמטרים כגון סף, משך זמן מינימלי ומרווח ביניים מינימלי. אותות מבודדים הושגו על-ידי התאמת משתני הזיהוי בגבול התחתון ובגבול העליון בקובץ ה- Script שלפני העיבוד.
זיהוי ספייק שורשים גחוני עוקב אחר פרמטרים זהים עם כניסות נוספות. התפרצויות בתוך פקודה מוטורית מוגדרות על ידי מינימום של שני קוצים בתוך 0.1 אלפיות השניה שנמשכים לפחות חמש אלפיות שנייה ומתווים על ידי מינימום של שלושה התפרצויות עם מרווחי אינטרברסט של פחות מ -200 אלפיות שנייה סקריפטים לעיבוד מראש יעמיסו מקטעים של פעילות תוחמת שהוזנה על תקופה מוגדרת היטב של עניין. במקרה זה, פעילות ספונטנית ממוצעת מראה שינויים דרמטיים בתגובה לתחילת הפעילות המוטורית המתוארת על ציר ה- X כזמן השווה לאפס.
הבדלים משמעותיים התגלו בשיעורי עלייה חדים בין שיעורי עלייה חדה לפני השחייה ושיעורי עלייה חדה הן בתקופות השחייה והן בתקופות שלאחר השחייה. שיעורי הזינוק היו בקורלציה שלילית עם משך השחייה. לא זוהה מתאם בין קצב עלייה יחסי לתדירות השחייה.
בריאות בעלי חיים היא הדבר החשוב ביותר כאשר מנסים לנסות את ההליך הזה. זה חיוני כדי לפקח על זרימת דם מהירה לא רק להבטיח רווחת בעלי חיים, אלא גם להגדיל את הסבירות של הצלחה הקלטה עצבית. על ידי מינוף כלים גנטיים הזמינים ב- Zebrafish, פרוטוקול אלקטרופיזיולוגיה זה יכול להיות מוחמא על ידי קווים מהונדסים לחקור בעוצמה קישוריות מעגל אנטומי ותפקודי במערכות תאי השיער ומעבר.
שינוי פשוט זה של טכניקת המהדק התיקון מאפשר לנו לפקח על האופן שבו מערכות חושיות מתפקדות ב- vivo.
