이 프로토콜은 연구원이 척추를 손상시키지 않는 통제된 자극에 단 하나 감각 뉴런의 활동 그리고 반응을 감시하는 가능하게 합니다. 이 패치 전기 생리학은 실시간으로 개별 뉴런의 급증 활동에서 기록하는 빠르고 직접적인 방법입니다. 또한 대부분의 광학 이미징 기술보다 저렴한 비용으로 더 나은 시간 해상도와 감도를 제공합니다.
측면 선 헤어 셀은 인간의 내이에 동종입니다. 그래서이 기술은 인간의 청각 장애와 청각 장애에 적용되는 헤어 셀 회로의 특성을 공개 할 태세입니다. 전기 생리학은 볼 수 있고 물리적으로 모방해야 하는 미세 한 운동 기술을 사용하는 공예품입니다.
텍스트만 지침으로 해석할 여지가 너무 많습니다. 먼저 실가드와 같은 실리콘 엘라스토머를 얇은 층으로 분배하여 실리콘 엘라스토머 바닥 녹음 접시를 만듭니다. 해부 핀을 만들려면 DC 전원 공급 장치를 사용하여 Etchant의 100 밀리리터 비커에 5 볼트의 음전하를 제공하고 양전하 출력에 텅스텐 와이어를 부착하십시오.
팁이 날카로운 지점으로 좁힐 때까지 와이어 끝을 Etchant 욕조에 반복적으로 담급합니다. 스테레오 현미경으로, 직선 가장자리 면도날로 끝에서 약 1 밀리미터 와이어를 잘라. 이 세 번 반복한 다음 미세 한 집게를 사용하여 경화 된 녹음 접시에 핀을 삽입합니다.
전극 을 준비하려면 상자 필라멘트가있는 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 보로실리케이트 유리 모세관 튜브를 당깁니다. 전극은 후방 측삭선에서 포퍼런트 뉴런을 기록하는 데 사용되는 테이퍼가 있는 30 마이크로미터 직경 의 팁이 있어야 합니다. 1~5마이크로미터 팁 직경이 작은 전극에 추가보로실리케이트 유리 모세관 튜브를 넣습니다.
각 손에 하나의 전극을 들고, 부드럽게 팁을 깰 서로 에 걸쳐 팁을 실행합니다. 마이크로 포지를 사용하여 베벨팁을 부드러워질 때까지 닦습니다. 최종 팁 직경은 30~50마이크로미터 사이여야 합니다.
제브라피시 애벌레를 고정하고 파이펫을 옮기기 위해 큰 팁을 사용하여 35mm 페트리 접시로 옮습니다. 주변 용액을 최대한 많이 제거합니다. 약 5 분 동안 0.1 % 알파 - 분가로톡신의 10 마이크로 리터에 유충을 침수.
마비된 애벌레를 세포외 용액으로 10분간 씻으시다. 그런 다음, 이송 파이펫을 사용하여 애벌레를 세포외 용액 욕조에서 실리콘 바닥 레코딩 접시로 이동시한다. 스테레오 현미경으로, 부드럽게이 실리콘 매트의 중앙 위에 미세 팁 집게와 애벌레를 배치, 신체의 전방과 후방 끝왼쪽에서 오른쪽으로 실행.
미세 한 팁 집게를 사용하여, 항문에 직접 등쪽 의 등쪽 노토 코드를 통해 실리콘에 가장자리 핀을 직교로 삽입합니다. 꼬리 끝 부근의 노토코드를 통해 두 번째 핀을 삽입하고 가스 방광의 노토코드 등쪽을 통해 세 번째 핀을 삽입합니다. 네 번째 핀을 오틱 소포를 통해 삽입하면서 핀이 캡슐화에 삽입될 때 약간의 회전을 제공합니다.
약간의 회전이 적용됨에 따라, 자극성 소마타의 클러스터를 드러내기 위해 클리트럼과 오정 소포 사이의 조직을 조심하십시오. PIN 애벌레를 DIC 현미경의 고정 된 단계에 10 배 목표 아래에 놓고 왼쪽 헤드 스테이지 벡터와 평행하게 근육 블록의 미오셉탈 갈라진 부분을 방향을 지정합니다. 접지 와이어를 목욕 용액에 넣고 왼쪽 헤드 스테이지에 연결되어 있는지 확인합니다.
유연한 젤 로딩 파이펫 팁을 사용하여 세포 외 용액의 30 마이크로 리터로 VR 기록 전극을 채우고 왼쪽 헤드 스테이지 파이펫 홀더에 삽입하십시오. 배율을 40배로 늘리고 공압 트랜스듀서에 의해 생성된 양압을 가하면서 녹음 파이펫을 접시 용액으로 낮춥니다. 각지의 뒤쳐지는 가장자리가 상피에 부드럽게 닿을 때까지 갈라진 이면이 피펫을 낮추도록 두 근소소엽 사이의 근세동을 측면 선으로 가져옵니다.
초기 접촉 후, 파이펫을 대각선으로 기동하여 최첨단이 접촉하고 씰을 생성할 수 있도록 합니다. 공압 변환기와 음압을 적용하고 잡아. 패치 클램프 소프트웨어에서 툴바의 재생 버튼을 클릭하여 VR 신호를 모니터링합니다.
웰스 고정 관념 버스트 신호 역학을 가진 모터 뉴런 활동이 관찰되면 VR 레코딩이 달성되고 있는지 확인하십시오. 세포 외 용액의 30 마이크로 리터로 발포형 기록 전극을 채우고 오른쪽 헤드 스테이지 파이펫 홀더에 삽입하십시오. 그런 다음 공압 트랜스듀서에 의해 생성된 양압을 가하면서 접시 용액으로 낮추어 넣습니다.
전극을 찾아 시편 위에 전극 끝을 가져옵니다. 마이크로 조작기를 사용하여, 그것은 cleithrum 위의 위치를 보유 할 때까지 발포성 전극 팁을 낮춥다. 배율을 40배로 늘리고 후방 측면선 신경과 클리스럼의 교차를 찾습니다.
전극 끝을 포퍼런트 신경절 위에 넣고 팁이 상피에 닿을 때까지 파이펫을 낮춥춥시다. 부드럽게, 전체 팁 둘레가 포운성 신경절에 닿도록 전극을 기동. 공압 변환기와 음압을 적용하고 잡아.
패치 클램프 소프트웨어에서 재생을 클릭한 후 스파이크가 100~200밀리초마다 자발적으로 발생할 때 전체 셀의 느슨한 패치 기록이 달성되도록 합니다. 포심뉴런과 운동 신경 활동이 모두 감지되면, 피크 클램프 10의 도구 모음의 레코드 버튼을 클릭하여 두 채널 모두에서 동시 간격 무료 레코딩을 캡처합니다. 텍스트 원고에 설명된 대로 데이터 사전 처리를 수행합니다.
이 틈새 기록 프로토콜을 사용하여, 발신 및 VR 뉴런의 실시간 활성을 동시에 측정할 수 있다. 사용자 지정 작성, 사전 처리 스크립트는 임계값, 최소 기간 및 최소 인터스파이크 간격과 같은 매개 변수를 사용하여 스파이크 감지의 시각화를 지원하기 위해 플롯을 생성합니다. 격리된 신호는 사전 처리 스크립트에서 하한 및 상한 검출 변수를 조정하여 얻어졌다.
복부 뿌리 스파이크 감지는 추가 입력과 동일한 매개 변수를 따릅니다. 모터 커맨드 내의 버스트는 최소 5밀리초 동안 지속되는 0.1밀리초 이내에 최소 2개의 스파이크로 정의되며, 200밀리초 미만의 인터버스트 간격으로 최소 3개의 버스트로 정의되며, 사전 처리 스크립트는 잘 정의된 관심 기간에 입력된 afferent 활동의 섹션을 오버레이합니다. 이 경우, 즉 자발적 활동은 X축에 묘사된 모터 활동의 개시에 대한 응답으로 0과 동일한 시간으로 극적인 변화를 나타낸다.
수영 전 스파이크 비율과 수영 및 수영 후 기간의 스파이크 비율 사이의 포이퍼트 스파이크 비율에서 상당한 차이가 발견되었습니다. 포렌트 스파이크 비율은 수영 기간과 부정적으로 상관관계가 있었습니다. 상대 스파이크 속도와 수영 빈도 사이에는 상관 관계가 감지되지 않습니다.
동물 건강은이 절차를 시도 하려고 할 때 가장 중요 한 것은. 빠른 혈류를 모니터링하여 동물의 복지를 보장할 뿐만 아니라 신경 기록성공 가능성을 높이는 것이 중요합니다. Zebrafish에서 사용할 수 있는 유전 도구를 활용함으로써, 이 전기 생리학 프로토콜은 모발 세포 시스템 및 그 너머의 해부학적 및 기능성 회로 연결을 강력하게 조사하기 위해 형질전환선에 의해 칭찬될 수 있습니다.
패치 클램프 기법을 단순화하여 감각 시스템이 생체 내에서 어떻게 작동하는지 모니터링할 수 있습니다.
