Este protocolo permite al investigador monitorear la actividad y la respuesta de neuronas sensoriales individuales a una estimulación controlada en una vértebra que se comporta intacta. Esta electrofisiología de parche es una forma rápida y directa de registrar a partir de la actividad de spiking de neuronas individuales en tiempo real. Y eso proporciona una mejor resolución de tiempo y sensibilidad a un costo menor que la mayoría de las técnicas de imagen óptica.
Las células ciliadas de la línea lateral son homólogas a las del oído interno humano. Así que esta técnica está preparada para revelar las propiedades de los circuitos de células ciliadas que se aplican a la sordera humana y los trastornos auditivos. La electrofisiología es un arte que utiliza habilidades motoras finas que necesita ser visto e imitado físicamente.
Las instrucciones de solo texto dejan demasiado espacio para la interpretación errónea. Para comenzar, dispense una capa delgada de elastómero de silicona automezclado como Sylgard en un plato de cultivo de tejido con fondo de vidrio de cubierta para hacer un plato de grabación de fondo de elastómero de silicona. Para hacer pines de disección, proporcione una carga negativa de cinco voltios a un casto de 100 mililitros de grabador utilizando una fuente de alimentación de CC y conecte un cable de tungsteno a la salida con carga positiva.
Sumerja repetidamente la punta del alambre en el baño de grabado hasta que la punta se estreche a un punto agudo. Bajo un microscopio estéreo, corte el cable aproximadamente un milímetro de la punta con una cuchilla de afeitar de borde recto. Repita esto tres veces y luego inserte pines en el plato de grabación curado con pinzas finas.
Para preparar electrodos de grabación, tire de tubos capilares de vidrio de borosilicato utilizando un tirador de micropipeta con filamento de caja. El electrodo debe tener una punta de 30 micrómetros de diámetro con un cono que se utilizará para registrar las neuronas aferentes de la línea lateral posterior. Tire de un tubo capilar de vidrio de borosilicato adicional en un par de electrodos con diámetros de punta de uno a cinco micrómetros más pequeños.
Sosteniendo un electrodo en cada mano, ejecute suavemente las puntas unas a otras para romper las puntas. Usando un microforge, pula la punta biselada hasta que esté suave. El diámetro final de la punta debe estar entre 30 y 50 micrómetros.
Inmovilizar las larvas de pez cebra y transferirlas a una placa de Petri de 35 milímetros utilizando una punta grande para transferir pipeta. Retire la mayor cantidad posible de la solución circundante. Sumerja las larvas en 10 microlitros de 0,1% alfa-bungarotoxina durante aproximadamente cinco minutos.
Lave la larva paralizada con solución extracelular durante 10 minutos. Luego, use una pipeta de transferencia para mover la larva desde el baño de solución extracelular hasta el plato de grabación con fondo de silicona. Bajo un microscopio estéreo, coloque suavemente las larvas con pinzas de punta fina por encima del centro de esta estera de silicona, lateralmente hacia arriba con los extremos anterior y posterior del cuerpo corriendo de izquierda a derecha.
Usando pinzas de punta fina, inserte el pasador del borde ortogonalmente a la silicona a través de la notocorda dorsal de las larvas directamente dorsal al ano. Inserte el segundo pasador a través de la notocorda cerca del extremo de la cola e inserte el tercer pasador a través de la notocorda dorsal de la vejiga gaseosa. Inserte el cuarto pin a través de la vesícula ótica mientras proporciona una ligera rotación a medida que el pin se inserta en el encapsulante.
A medida que se aplica una ligera rotación, observe el tejido entre el cleithrum y la vesícula ótica para revelar el grupo de somata aferente. Coloque la larva del perno debajo del objetivo de 10 veces en una etapa fija del microscopio DIC y oriente las hendiduras mioceptal de los bloques del músculo paralelos al vector izquierdo de la etapa principal. Coloque el cable de tierra en la solución de baño y asegúrese de que esté conectado a la etapa de la cabeza izquierda.
Llene el electrodo de grabación VR con 30 microlitros de solución extracelular usando una punta de pipeta flexible de carga de gel e insértela en el soporte de la pipeta de la etapa de la cabeza izquierda. Aumente el aumento a 40 veces y baje la pipeta de grabación en la solución para platos mientras aplica la presión positiva producida por un transductor neumático. Lleve la punta del electrodo sobre un mioseptum entre los dos miómeros ventrales a la línea lateral hasta que la hendidura se centre en la abertura de la punta del electrodo VR Baje la pipeta hasta que el borde rezagado de la abertura de la punta entre en contacto suavemente con el epitelio.
Después del contacto inicial, maniobje la pipeta en diagonal para asegurarse de que el borde de ataque hace contacto y puede generar un sello. Aplique presión negativa con el transductor neumático y suba agárralo. En el software de abrazadera de parche, haga clic en el botón Reproducir en la barra de herramientas para monitorear la señal de realidad virtual.
Asegúrese de que la grabación de RV se está logrando una vez que se observe la actividad de la neurona motora con la dinámica de la señal de ráfaga estereotipada de Wells. Llene el electrodo de grabación aferente con 30 microlitros de solución extracelular e insértelo en el soporte de la pipeta de la etapa de la cabeza derecha. Luego bájelo en la solución del plato mientras aplica la presión positiva producida por un transductor neumático.
Localice el electrodo y lleve la punta del electrodo sobre la muestra. Usando un micromanipulador, baje la punta del electrodo aferente hasta que se mantenga en posición por encima del cleithrum. Aumente el aumento a 40 veces la inmersión y localice la intersección del nervio de la línea lateral posterior y el cleithrum.
Lleve la punta del electrodo sobre el ganglio aferente y baje la pipeta hasta que la punta entre en contacto con el epitelio. Suavemente, manipule el electrodo para que toda la circunferencia de la punta entre en contacto con el ganglio aferente. Aplique presión negativa con el transductor neumático y suba agárralo.
Después de hacer clic en Reproducir en el software de abrazadera de parche, asegúrese de que la grabación de parches sueltos de toda la célula de las neuronas aferentes se logra cuando los picos ocurren espontáneamente aproximadamente cada 100 a 200 milisegundos. Una vez que se detecta la actividad aferente de la neurona y la neurona motora, haga clic en el botón Grabar en la barra de herramientas en la abrazadera máxima 10 para capturar grabaciones simultáneas libres de brechas en ambos canales. Realice el pre-proceso de los datos según lo descrito en el manuscrito del texto.
Utilizando este protocolo de grabación sin brechas, la actividad en tiempo real de las neuronas aferentes y vr se puede medir simultáneamente. Los scripts escritos personalizados y de preprocesamiento generan gráficas para ayudar en la visualización de la detección de picos utilizando parámetros como el umbral, la duración mínima y el intervalo mínimo de interspike. Las señales aisladas se obtuvieron ajustando las variables de detección de límite inferior y límite superior en el script de preprocesamiento.
La detección de espigas de raíces ventrales sigue parámetros idénticos con entradas adicionales. Las ráfagas dentro de un comando de motor se definen por un mínimo de dos picos dentro de 0,1 milisegundos que duran al menos cinco milisegundos y se delinean por un mínimo de tres ráfagas con intervalos de interburst de menos de 200 milisegundos Los scripts de preprocesamiento superponerán secciones de actividad aferente ingresadas en un período de interés bien definido. En este caso, la actividad espontánea media muestra cambios dramáticos en respuesta al inicio de la actividad motora representada en el eje X como tiempo igual a cero.
Se detectaron diferencias significativas en las tasas de picos aferentes entre las tasas de picos antes de nadar y las tasas de picos de los períodos de natación y post-natación. Las tasas de picos aferentes se correlacionaron negativamente con la duración de la natación. No se ha detectado ninguna correlación entre la tasa de picos relativos y la frecuencia de natación.
La salud animal es lo más importante cuando se intenta intentar este procedimiento. Es crucial monitorear el flujo sanguíneo rápido no solo para garantizar el bienestar animal, sino también para aumentar la probabilidad de éxito en el registro neuronal. Al aprovechar las herramientas genéticas disponibles en el pez cebra, este protocolo de electrofisiología puede complementarse con líneas transgénicas para investigar poderosamente la conectividad de circuitos anatómicos y funcionales en sistemas de células ciliadas y más allá.
Esta modificación simplificada de la técnica de abrazadera de parche nos permite monitorear cómo funcionan los sistemas sensoriales in vivo.
