O PCR de gotícula digital oferece maior precisão e sensibilidade em comparação com o PCR quantitativo. Este é um método simples para PCR de gotícula digital que requer equipamentos mínimos e sem experiência. A emulsificação de modelos de partículas é um método de emulsificação sem microfluidic que não requer nenhum equipamento especializado.
Além disso, a emulsificação ocorre durante um período de segundos e escalas para o volume do contêiner. Para contas comerciais, adicione 0,5 gramas de partículas secas de poliacrilamida compatíveis com emulsificação de modelo de partículas, ou PTE, a 30 mililitros de água estéril em um tubo cônico de 50 mililitros, e misture bem. Incubar em temperatura ambiente por 30 minutos.
Para a fabricação microfluida de contas, despeje um mililitro de fotoresist no centro de um wafer de silício de três polegadas e gire-o a 500 RPM por 30 segundos, seguido por 1250 RPM por 30 segundos. Coloque o wafer em uma placa de aquecimento a 95 graus Celsius por 15 minutos para evaporar o solvente. Fixar a máscara fotográfica no wafer de silício com um slide de vidro de cobertura e expor o wafer sob um LED UV colidido por 2,5 minutos.
Coloque o wafer em uma placa de aquecimento definida para 95 graus Celsius durante cinco minutos para assar após a exposição. Desenvolva o wafer de silício fotoresist, imergindo-o em um banho de 100% PGMEA por até 15 minutos. Enxágüe o wafer com novo 100% PGMEA, seguido de isopropanol de 100%.
Seque o wafer, depois seque-o em uma placa quente fixada a 95 graus Celsius por um minuto, e coloque-o em uma placa de Petri limpa de três polegadas. Misture a base de silicone PDMS e o reagente de cura em uma proporção de 10:1, em seguida, desgas o PDMS misto usando um desiccador sob vácuo até que nenhuma bolha de ar seja observável. Despeje o PDMS desgaseado na placa de Petri, garantindo que o wafer de silício esteja completamente submerso.
Desgas o wafer de silício e PDMS, e, em seguida, curar o PDMS colocando o wafer de silício em um forno definido a 65 graus Celsius por pelo menos 60 minutos. Extite um bloco de PDMS contendo as características microfluidas da placa de Petri, usando um bisturi. Bata as entradas e as tomadas no bloco PDMS usando um soco de biópsia de 0,75 milímetros.
Em seguida, remova qualquer poeira e partículas com a aplicação repetitiva e remoção da fita de embalagem para a superfície do bloco. Limpe uma lâmina de vidro enxaguando-a com isopropanol de 100% e, posteriormente, secando a superfície. O plasma trata tanto o slide de vidro quanto o PDMS com um milibar de plasma de oxigênio por um minuto, usando um fiador de plasma.
Afixe o PDMS na lâmina de vidro colocando o PDMS tratado com plasma com características voltadas para baixo sobre o slide de vidro, lado tratado com plasma voltado para cima. Coloque o deslizamento em um forno definido a 65 graus Celsius por pelo menos 30 minutos, para completar a ligação. Trate todos os canais microfluidos com um tratamento de superfície fluorada para garantir a hidrofobiidade superficial e, em seguida, asse o dispositivo a 65 graus Celsius por pelo menos 10 minutos.
Carregue tanto poliacrilamida, ou PAA, quanto hidrofluoroether, ou HFE, seringas contendo soluções em bombas de seringa. Conecte ambas as seringas ao dispositivo microfluido usando tubos de polietileno. Execute o dispositivo de geração de gota e colete um mililitro das gotículas em um tubo de coleta de 15 mililitros, em seguida, incubar por três horas em temperatura ambiente para polimerização.
Após a incubação, remova a camada inferior do óleo por tubulação. Adicione um mililitro de 20% PFO em óleo HFE ao tubo de coleta de 15 mililitros como um demulsificador químico. Após a mistura, gire o tubo de coleta de 15 mililitros a 2000 x g, por dois minutos.
Remova a camada inferior por pipetação e repita o processo mais uma vez. Adicione dois mililitros de monooleato de 2%sorbitan em hexano ao tubo de coleta de 15 mililitros e vórtice dele. Gire o tubo a 3000 x g por três minutos e remova o supernatante por pipetação para remover a solução surfactante.
Repita isso duas vezes. Adicione cinco mililitros de tampão TEBST e misture bem, depois gire a 3000 x g por três minutos e remova o supernatante por pipetação. Repita isso três vezes e, em seguida, resuspend em cinco mililitros de TEBST.
Prepare as partículas de poliacrilamida para emulsificação de partículas modelando centrifugando a 6000 x g por um minuto para pelotar as partículas. Em seguida, remova o supernatante por pipetação, e resuspenque a pelota em água estéril. Repita três vezes para garantir a remoção de qualquer TEBST residual.
Prepare a fase de dispersão em um tubo de centrífuga de 15 mililitros fresco, usando uma mistura mestre pcr, os primers apropriados e uma sonda de hidrolise fluoresceína, como descrito no manuscrito do texto. Incubar em temperatura ambiente por cinco minutos sob agitação suave, usando um rotador de tubo. Centrifugar a fase de dispersão a 6000 x g por um minuto e remover o supernatante.
Adicione um microliter de Saccharomyces cerevisiae DNA genômico à pelota, e misture bem por pipetar ou tocar vigorosamente. Adicione 200 microlitres de 2% fluorosurfactantes em óleo HFE ao tubo, para emulsificação. Desaloja a pelota por pipetar ou tocar o tubo e, em seguida, vórtice a 3000 RPM por 30 segundos.
Deixe que as emulsões se contentem por um minuto, depois remova 100 microliters da fase inferior do óleo e substitua esse volume por um fluorosurfactante fresco de 2% no óleo HFE. Inverta suavemente o tubo várias vezes para misturar. Repita isso três vezes ou mais, até que pequenas gotículas de satélite sejam removidas.
Após dois a cinco minutos de assentamento, remova a fase inferior do óleo. Substitua este volume por 5% fluorosurfactante em óleo fluorocarbono. Pipeta 100 microliters de amostra em tubos PCR de 200 microliteres, e coloque os tubos PCR em um termociclador.
Pipeta a amostra em um slide de contagem para imagem fluorescente, e imagem da amostra. Emulsificação modelada por partículas proporciona excelente monodispersidade. À medida que o excesso de supernascer é removido estabilizador, a amostra é vórtice para gerar a emulsão.
As gotículas resultantes consistem em núcleo de partículas e amostra aquosa contendo reagentes e moléculas de amostras ou células necessárias para a reação. Gotículas polidispersadas com partículas templating indicam vórtice insuficiente. Outra questão é a geração de satélites excessivos, que reduzem a eficiência de encapsulamento.
Os satélites não devem incluir mais de 10% do volume total de amostras encapsuladas. Eles podem ser retirados da emulsão lavando com óleo fresco. A utilidade do PTE pode ser demonstrada no PCR digital quando gotículas contendo alvos amplificados se tornam fluorescentes, permitindo a quantitação direta dos alvos.
As gotículas fluorescentes produzem poucos pontos positivos quando o alvo é raro, e muitos quando é abundante. Esses resultados são repetíveis usando partículas de poliacrilamida disponíveis comercialmente, obtendo medições precisas ao longo da mesma faixa. A remoção do supernasal da fase de dispersão é importante para o encapsulamento da amostra.
Conhecer o volume da pelota e do supernatante pode ajudar a identificar a interface entre os dois. Na dúvida, erre ao lado de remover o supernaspeso.
