Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Carl June (Universidade da Pensilvânia) para ajudar a geração e fornecimento de clone AAPC # 4 e Dr. Perry Hackett (Universidade de Minnesota) para obter ajuda com o sistema SB. Conceder um apoio: Cancer Center Núcleo Grant (CA16672); SR1 (CA124782, CA120956, CA141303); R33 (CA116127); P01 (CA148600); SPORE (CA136411); Albert J Ward Foundation; Burroughs Wellcome Fundo; Gillson Longenbaugh Foundation; Prevenção do Câncer e Instituto de Pesquisa do Texas; CLL Global Research Foundation; Departamento de Defesa; Imóveis de Noelan L. Bibler; Harry T. Mangurian, Jr., Fundo de Imunoterapia Leucemia, Instituto de Terapia personalizado do câncer, leucemia e linfoma Sociedade; Fundação de Pesquisa linfoma; Irmã MDACC da Instituição Rede Fundo; Miller Foundation; Sr. Herb Simons; Sr. e Sra. Joe H. Scales, o Sr. Thomas Scott; Fundação Nacional para Pesquisa do Câncer, Fundação de Pesquisa Pediátrica Câncer; assistanc Produçãoe para terapias celulares (PACT), William Lawrence e Fundação Blanche Hughes Infância.

<html> Dia 0 ou Antes 1. Isolamento de células mononucleares (MNC) de PB e UCB <ol><li> Diluir PB com igual volume, e UCB com quatro volumes de PBS-EDTA. </li><li> Lentamente sangue camada diluída (25 ml) em Ficoll (12 ml) num tubo de centrifugação de 50 ml (s) e centrifugar a 400 xg durante 30 - 40 minutos (sem travagem). </li><li> Recolher e transferir a fracção de células mononucleares (interface) utilizando uma pipeta de transferência para um novo tubo de centrífuga de 50 ml. </li><li> Trazer o volume até 50 ml com PBS-EDTA e centrifugar a 450 xg durante 10 min. </li><li> Aspirar o sobrenadante, gentilmente re-suspender o sedimento de células (s) em 50 ml de meio de cultura completo (CCM) e, centrifugar a 400 xg durante 10 min. </li><li> Delicadamente ressuspender e piscina as pelotas de células em CCM e realizar uma contagem de células usando Trypan método de exclusão de azul (Cellometer, programa PBMC). </li><li> EMN pode agora ser utilizado para a electroporação (Nucleofection) ou criopreservados para utilização futura. </li></ol>título &quot;&gt; 2 Preparação. das Células T para Electroporation no dia 0 <ol><li> Se usar MNC criopreservado, rapidamente descongelar células suficientes para uma escala total de electroporação (2 x 10 8 a adição ~ 20% para levar em conta a perda de células durante a centrifugação e 2 horas de incubação) em banho de água a 37 ° C. Se estiver usando o recém isolado MNC avançar para o passo 2.3. </li><li> Gentilmente re-suspender as células e transferir para um tubo de centrifugação de tamanho adequado (s) pré-aquecida continha completa Fenol livre de cultura meio RPMI (PF-RPMI) e centrifugar a 200 xg durante 10 min (no freio), sobrenadante aspirado. </li><li> Re-suspender o MNC no PF-RPMI, realizar uma contagem de células (Cellometer) e transferir as células para um recipiente de tamanho adequado das células de cultura (s) a uma concentração de 10 6 células / ml. </li><li> Incubar em 37 humidificada ° C / 5% CO 2 incubadora durante 2 horas ± 30 minutos. </li><li> Transferir o MNC para tubo de centrífuga estéril (s), rotação a 200 xg durante 5 min (sem travões), aspirar o sobrenadante e r suavementee-suspender e combinar o sedimento de células (s) em meio RPMI-PF. </li><li> Realizar uma contagem de células (Cellometer) e calcular o volume de suspensão de células necessária (2 x 10 8 MNC). </li><li> Transferir o volume calculado para um tubo de centrifugação estéril de 50 mL e centrifugação a 200 xg durante 10 min (sem travagem). </li><li> Aspirar o sobrenadante para que nenhuma mídia residuais continua e suavemente volte a suspender tocando lateral do tubo. </li></ol> 3. Eletroporação (Nucleofection) de MNC (Processo de escala completa 10 Usando Cuvetes) no Dia 0 <ol><li> Pré-incubar uma placa de 12 poços estéreis com 10 poços, contendo 4 ml de RPMI morno PF-37 em uma humidificado ° C / 5% CO 2 incubadora. </li><li> Preparar e pré-aquecer a Lonza Solução Nucleofector kit de células T humanas (reconstituído por instruções do fabricante, <a href="http://www.lonza.com" target="_blank">www.lonza.com</a> ) a temperatura ambiente em um gabinete de Biossegurança (BSC). </li><li> Prepare a solução Nucleofector / master mix DNA por adding ul 100 de completada solução Nucleofector, 15 ug de transposão (superenrolado DNA plasmídeo designado como CD19RCD28/pSBSO) e 5 ug de transposase (superenrolado DNA do plasmídeo designado por pCMV-SB11) por reacção / cuvete. </li><li> Dispersa-se o sedimento de células (do passo 2.8) batendo suavemente na parte lateral do tubo de centrifugação e re-suspensão em solução Nucleofection master mix / DNA (concentração celular final: 2 x 10 7 células/100 uL). </li><li> Transferir cuidadosamente 100 ul da suspensão de células (do passo 3.4) para cada um de dez (10) cuvettes Nucleofection Lonza, tendo cuidado para evitar bolhas de ar. </li><li> Toque a cuvete uma vez, e utilizando o programa electroporate U-014 (para as células T não estimuladas). </li><li> Transferir as cuvetes e a placa de 12 poços (Passo 3.1), para o BSC. </li><li> Colher as células electroporadas a partir de cada cuvete, usando uma pipeta de transferência Amaxa ponta fina, por adição de ~ 500 uL de meio de cultura pré-aquecido a partir do correspondente poço (placa de 12 poços preparadas em Step 3,1) e voltar a placa a 37 ° C humidificado / 5% de CO 2 incubadora durante 2 horas ± 30 minutos. </li><li> Seguindo a incubação de 2 horas da colheita, e transferir as células de todas as cavidades de um tubo de centrífuga estéril. </li><li> Lave as células por centrifugação a 140 xg durante 8 minutos, a temperatura ambiente, sem travão, aspirar e desprezar o sobrenadante, de modo que nenhum meio residual cobre o pellet celular. </li><li> Dispersa-se o pellet celular batendo suavemente na parte lateral do tubo da centrífuga e suavemente re-suspender em CCM para obter uma suspensão de célula única. </li><li> Realizar a contagem de células e ajuste a concentração celular a 10 6 células / ml em CCM. </li><li> Transferir a suspensão de célula para célula frasco de cultura (s) e colocados no incubador durante a noite. </li><li> Passos do processo 2,1-3,8 foram repetidas para o controle: EGFP transfectadas células (5 x 10 6 células / cuvete com 5 ug Amaxa controle EGFP plasmídeo super-enrolado, pmaxGFP). </li></ol> º dia de 1 de 1 e SubsequenteCiclos de estimulação 4. Análise de Expressão CAR por citometria de fluxo no 1 º dia <ol><li> Colher as células electroporadas e realizar uma contagem de células utilizando Trypan método de exclusão de azul (hemocitômetro). </li><li> Células de manchas (1-2 x 10 6) com o anticorpo específico para CD3, CD4, CD8, e de IgG humana Fcy (como uma medida da expressão CAR). </li><li> Adquirir células em FACS Calibur e analisar os dados utilizando software FCS Express para calcular a expressão do CAR. <ol><li> Calcule células + carro na cultura pela fórmula: (N º de Total de células viáveis) x (CAR% + células) = Número de carro + células </li></ol></li></ol> 5. Preparação de AAPC (clone # 4) no Dia 1. AAPC (clone # 4) foram derivadas de células K562 (linha parental Obtido a partir de American Type Culture Collection) com Co-express T Molecule célula desejada Co-estimulação <ol><li> Descongelar uma alíquota congelada de AAPC 100 Gy irradiada em um 37 °; C banho de água. </li><li> As células são lavadas duas vezes por centrifugação a 400 xg, 10 min em CCM e contados utilizando Cellometer (exclusão Trypan azul). </li><li> Calcular o número de AAPC viável necessário para a estimulação: (Número de carro + células) x 2 = N º de AAPC irradiado exigido </li></ol> 6. AAPC mediada por estimulação do CAR + Células T no dia 1 Início do 1 º e ciclos de estimulação subseqüentes <ol><li> Misturar as células electroporadas (expressando CAR) e γ-irradiado AAPC (clone # 4) em um recipiente estéril numa proporção de 1:2 (células CAR +: AAPC viável) em CCM. <ol><li> Note-se a relação de AAPC é ajustado para a expressão de CAR baseado em citometria de fluxo no dia após a electroporação. </li></ol></li><li> Adicionar IL-21 (30 ng / ml) à suspensão de células. </li><li> Alíquota em T-75 cm 2 frasco (s) e / ou bolsas de Vida Vue cultura a uma concentração de 10 6 células / ml, e retornar para o incubatou. </li></ol> Dias 3, 5 7. Continuação de Cultura CAR + Células T <ol><li> Realizar uma mudança de meio media, reabastecer IL-21, e manter as células T a uma concentração de 10 6 células / ml. </li></ol> Dia 7 8. Fim do ciclo de estimulação Primeiro AAPC mediada <ol><li> Células colheita, contar e mancha para CD3, CD4, CD8, e Fcy (CAR) e vá para a etapa 10.1. </li></ol> 9. Depleção de células CD56 + (geralmente entre 7 e 14 dias após a electroporação) <ol><li> Executar uma depleção de CD56 usando esferas paramagnéticas se CD56 + CD3 linfócitos neg ≥ 10%. </li></ol> Ciclos de estimulação # 2, # 3, # 4 e correspondente aos dias 8 → 14, Dias 15 → 21, e dias 22 → 28 10. Adição recursiva da AAPC para propagar as células T a números Clinicamente-suficientes <ol><li> Repita o stimulation processo (4 vezes), tal como descrito nos passos 4,3-8,1. </li><li> Adicionar IL-2 (50U/ml) para as culturas que começam nos dias 7, 14 e 21, e em seguida, em cada mudança de mídia (três vezes por semana, em um horário de segunda a quarta-feira e sexta-feira). </li><li> Criopreservar (arquivo) excesso de células T, conforme necessário. <ol><li> As células T congeladas usando congelador taxa controlada. </li></ol></li></ol> Dia 28 11. Fim do ciclo de estimulação Última AAPC mediada: Células T Colheita <ol><li> Criopreservar células T para testes de libertação e de infusão. </li></ol>

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Não há conflitos de interesse declarados.

Transposon e sistemas de transposase, tais como a partir de 12,19 piggyBac e SB 18,20-22, são não-virais abordagens para a terapia genética, que são uma alternativa aos viral mediada por transdução do CAR grau clínico + células T. O SB foi escolhido como o sistema de transferência de genes com base no seu potencial para a terapia de gene humano 1,6,23. Nós desenvolvemos as tecnologias duais de SB transposição (para introduzir um CAR) e adição de γ recursiva irradiado AAPC (para recuperar as células T geneticamente modificadas que expressam estavelmente um CAR) para servir como plataforma de tecnologias para o fabrico de células T específicas para TAA em conformidade com cGMP para a Fase I / II de ensaios (Figura 4). Após 28 dias (quatro ciclos de 7 dias de estimulação) de co-cultura sobre γ-irradiado AAPC, que são tipicamente capazes de produzir, pelo menos, ~ 10 10 geneticamente modificados células T adequado para aplicações em seres humanos. Conforme necessário, ciclos de estimulação adicional pode ser realizada to gerar grandes números de células T geneticamente modificadas. Além disso, se as células menos CAR + T são necessários, a aproximação a electroporação e propagação pode ser reduzida para menos empregando cuvetes e levar adiante, apenas um conjunto de sub-das células T expandidas numericamente para ciclos subsequentes de proliferação de AAPC, no início de cada ciclo de estimulação. A maioria da electroporação e propagadas as células T colhidas para perfusão estavelmente expressam o CAR. A conseqüência de células CD4 + e CD8 + T que expressam nossa CAR 2 ª geração incluem as células com um fenótipo de memória / ingênuo e apresentam três características de re-direcionado especificidade. Em primeiro lugar, as células geneticamente modificadas especificamente T lisam alvos CD19 +, por outro lado, produzem IFN-γ em resposta a células CD19 + do estimulador e, em terceiro lugar, se proliferam em resposta a CD19 + células alimentadoras, todos de uma maneira dependente da CAR 13,18. Nossa abordagem para integrcomeu um transgene CAR por eletro-transferência de plasmídeos não-virais de DNA a partir do sistema SB pode ser realizado em repouso células T primárias derivadas de PB e UCB. Nós e outros autores geneticamente modificado células K562 para servir como AAPC para propagar eficientemente números clinicamente suficiente de células T para infusão de 24,25. A AAPC e ambiente de cultura de tecidos (por exemplo, a adição de IL-21) foram foram modificadas para gerar paciente e doador-derivado de células CD19-T específicas para a infusão após o transplante de células-tronco hematopoiéticas (Tabela 1) 13,18. Nós podemos produzir CAR + células T de PB simplesmente obtidas por punção venosa que evita o custo, desconforto e inconveniência de se obter a partir de PB MNC por aférese. A capacidade de derivar um grande número de células T + CAR de pequenos números de MNC é particularmente atraente para a infusão de células T após transplante alogénico da UCB. O pequeno tamanho e anonimato do doador neonatal impede re-Aceder a este indivíduo em um ponto de tempo mais tarde, e apenas um número limitado de colheita MNC estão disponíveis como material de partida para a fabricação de células T para evitar interferir com a hematopoiese. Outros avanços para o processo de fabricação estão em andamento para incluir um dispositivo de electroporação elevado rendimento acoplado com um biorreactor WAVE totalmente fechada para minimizar a manipulação. No agregado, o SB e AAPC plataformas são atraentes para gerar CD19 específico CAR + células T que podem ser adaptados para gerar grandes números de células T geneticamente modificadas que podem reconhecer alternativas da superfície celular TAAs em conformidade com cGMP.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagentes </td><td> Vendedor </td><td> Número de catálogo </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagentes </td></tr><tr><td> DNA expressando GFP plasmídeo (pmaxGFP) </td><td> Lonza </td><td> APV-1002 (kit) </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Sigma </td><td> D8537 </td><td></td></tr><tr><td> CliniMACS PBS-EDTA </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 70026 </td><td></td></tr><tr><td> HyQ RPMI-1640 </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30096.01 </td><td></td></tr><tr><td> Fenol livre de RPMI-1640 </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30605.01 </td><td></td></tr><tr><td> De soro fetal bovino Hyclone </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH3007003HI </td><td></td></tr><tr><td> GlutaMAX(100x) </td><td> Gibco </td><td> 3505-061 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoll-Paque </td><td> GE Healthcare Biosciences </td><td> 17-1440-02 </td><td></td></tr><tr><td> IL-21 humana recombinante </td><td> PeproTech </td><td> AF-200-21 </td><td></td></tr><tr><td> IL-2 recombinante humano (Proleukin) </td><td> Novartis </td><td> NDC 65483-116-07 </td><td></td></tr><tr><td> Kit de células T humanas (Solução Nucleofector) </td><td> Lonza </td><td> VPA-1002 </td><td></td></tr><tr><td> CliniMACS Reagente CD56 </td><td> Miltenyi </td><td> 70206 </td><td></td></tr><tr><td> Conjugado com FITC para rato mAb específico para CD3 humano </td><td> BD Biosciences </td><td> 349201 </td><td></td></tr><tr><td> APC-conjugado com o mAb de rato específico para CD4 humano </td><td> BD Biosciences </td><td> 340443 </td><td></td></tr><tr><td> PerCPCy5.5 conjugadopara rato mAb específico para CD8 humano </td><td> BD Biosciences </td><td> 341051 </td><td></td></tr><tr><td> PE-conjugados com F (ab &#39;) 2 de fragmento de anticorpo de cabra específico para o humano Fcy </td><td> Invitrogen </td><td> H10104 </td><td></td></tr><tr><td> Azida de sódio </td><td> Sigma </td><td> S2002 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Descartáveis </td></tr><tr><td> Placa de 12 poços </td><td> Corning </td><td> 3513 </td><td></td></tr><tr><td> T-75 cm 2 balão </td><td> Corning </td><td> 430641 </td><td></td></tr><tr><td> Sacos de Cultura </td><td> Vue Vida </td><td> 290C; 750C </td><td></td></tr><tr><td> 50 tubo de centrífuga ml </td><td> BD Biosciences </td><td> 352098 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><strong&gt; Equipamentos </td></tr><tr><td> Amaxa Nuceleofector II </td><td> Lonza </td><td> AAB-1001 </td><td></td></tr><tr><td> Cellometer </td><td> Nexcelom Bioscience </td><td> Visão Cellometer </td><td></td></tr><tr><td> Sorvall Legend Centrífuga RT </td><td> Sorvall </td><td> 75004377 </td><td></td></tr><tr><td> BD FACS Calibur </td><td> BD Biosciences </td><td> 342975 </td><td></td></tr><tr><td> Congelador taxa controlada </td><td> Cunha </td><td> Kryo 750 </td><td></td></tr><tr><td> Irradiador </td><td> CIS bio Internacional </td><td> IBL-437 C # 09433 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> Expressão de moléculas (endógena e Introduzido) </td></tr><tr><td> Linha Celular </td> &lt;Nome&gt; td comum </td><td> Tipo de célula </td><td> Moléculas expressas </td></tr><tr><td> CJKT64.86.41BBL.GFP-IL15.CD19 </td><td> Clone 4 </td><td> K562 </td><td> CD86, CD64, CD137L, CD19, GFP co-expresso com a membrana ligada a IL-15 </td></tr></tbody></table> Meios de cultura completos (CCM) (armazenada a 4 ° C durante até 30 dias) HyQ RPMI-1640/Phenol-free RPMI-1640 FBS a 10% 1% GlutaMAX Tampão de Citometria de Fluxo (armazenada a 4 ° C durante até 30 dias) PBS FBS 2% 0,1% Azida de sódio </td></tr></tbody></table>

clinical application of sleeping beauty and artificial antigen presenting cells to genetically modify t cells from peripheral and umbilical cord blood

A potência das células de grau clínico T pode ser melhorado através da combinação de terapia de genes com a imunoterapia de engendrar um produto biológico, com o potencial de reconhecimento (i) superior de antigénios associados a tumores (TAAs), (ii) após a infusão de persistência, (iii) potencial de migração para o local do tumor, e (iv) a capacidade de reciclar as funções efectoras dentro do microambiente do tumor. A maioria das abordagens para a manipulação genética de células T modificadas para aplicação em seres humanos usaram lentivírus dos retrovírus e para a expressão estável de CAR 1-3. Esta abordagem, apesar de compatível com Boas Práticas de Fabricação (BPF), pode ser caro, uma vez que conta com a produção e liberação de clínica-grade vírus recombinante a partir de um número limitado de unidades de produção. A transferência de plasmídeos electro-não-virais é uma alternativa atraente para a transdução de ADN uma vez que as espécies podem ser produzidos ao grau clínico em cerca de 1/10 de o custo de recombinformiga vírus GMP-grade. Para melhorar a eficiência da integração nos adaptamos Bela Adormecida (SB) transposon e transposase para aplicação humana 4-8. O nosso sistema SB utiliza dois plasmídeos de ADN, que consistem de um transposão que codifica para um gene de interesse (por exemplo, 2 ª geração CD19 específico transgene CAR, designado CD19RCD28) e uma transposase (por exemplo, SB11), que insere o transgene no dinucleótido TA repete 9-11 . Para gerar números suficientes de clinicamente geneticamente modificados células T que usamos K562 células derivadas de antigénios artificiais que apresentam (AAPC) (clone # 4) modificados para expressar um TAA (por exemplo, CD19), assim como as moléculas de co-estimulação de células T CD86, CD137L, uma ligada à membrana versão de interleucina (IL) -15 (péptido fundido a modificação região Fc de IgG4) e CD64 (Fc-receptor γ 1) para o carregamento de anticorpos monoclonais (mAb) 12. Neste relatório, demonstrar os procedimentos que podem ser realizados em compliance com cGMP para gerar CD19 específico CAR + células T adequadas para aplicação em seres humanos. Isto foi conseguido através da electro-transferência síncrona de dois plasmídeos de ADN, de um transposão SB (CD19RCD28) e uma transposase SB (SB11) seguido por recuperação de integrantes estáveis ​​pelas adições cada-7-dia (ciclo de estimulação) de γ-irradiado AAPC (clone # 4), na presença de IL-2 recombinante humano solúvel e IL-21 13. Tipicamente quatro ciclos (28 dias de cultura contínua) são realizadas para gerar números clinicamente atraentes de células T que expressam estavelmente o CAR. Esta metodologia de fabrico de grau clínico de células T específicas para CD19 pode ser aplicada a células T derivadas do sangue periférico (PB) ou sangue de cordão umbilical (UCB). Além disso, esta abordagem pode ser aproveitado para gerar células T para diversos tipos de tumores, emparelhando a especificidade do CAR introduzida com a expressão do TAA, reconhecido pela CAR, na AAPC.

Relatamos que a transferência de electro-de cosmídeos e propagação de células T em γ-irradiado AAPC pode ser usado para gerar números clinicamente atraentes de células T derivadas de PB e UCB para aplicações em seres humanos. Estas células T geneticamente modificadas de expressar uma CAR introduzida que reconhece o CD19 TAA, independente do complexo de histocompatibilidade principal. Os plasmídeos derivados de SB DNA para expressar o transposão (i), uma 2 ª geração CAR (CD19RCD28) que os sinais por meio de CD28 e CD3 ε-14, e (ii) transposase, SB11 15, foram descritos anteriormente 13, 16,17 . Os plasmídeos utilizados no presente estudo foram produzidas comercialmente por Waisman unidade de biomanufatura clínica (Madison, WI). A AAPC (clone # 4), derivada de células K562 (linha parental obtida American Type Culture Collection), co-express de células T desejados moléculas co-estimuladoras (cada molécula introduzida em 3 a 90% na superfície das células de AAPC),como previamente descrito 12. Aqui, mostramos que as células T específicas para CD19 podem ser gerados a partir de células mononucleares (MNC) a partir de derivados PB ou SB UCB utilizando transposição para introduzir o CAR, seguido pela adição de AAPC para numericamente expandir as células T de uma forma dependente do CAR (Figuras 1 , 4) 13,18. Dez cuvetes (2x10 7 MNC / cuvete) são electroporados para cada destinatário, utilizando 15 ug de ADN do plasmídeo (CD19RCD28/pSBSO) que codifica para a transposão (CAR) e 5 ug de ADN do plasmídeo (pCMV-SB11) que codifica para a transposase (SB11). O número de cubetas pode ser reduzido se MNC estão limitando ou reduzidas para o trabalho de laboratório. O dia da electroporação é definido como &quot;0 Dia&quot; ciclo de estimulação # 1. Como controles para a citometria de fluxo e as condições de cultura, as células T autólogas são electroporated simulado (sem ADN de plasmídeo) e numericamente expandido em γ-irradiado AAPC (clone # 4) que tinha sido pré-carregada com OKT3 para atravessar link-CD3 das células T para sustentar proliferação. Nós routinely avaliar a eficiência de electrotransferência e viabilidade das células T no dia após a electroporação (Figura 2B). A expressão de GFP de controlo de ADN de plasmídeo (designado pmaxGFP) e CAR, neste ponto de tempo inicial reflicta a expressão da proteína a partir do plasmídeo integrado e epissomal. Normalmente, o dia após a eletroporação medimos expressão EGFP em ~ expressão 60% e CARRO em ~ 40% (Figura 2) com T viabilidade celular entre 40-50%. Adições recursivas de γ-irradiado AAPC, na presença de IL-2 recombinante humano solúvel e IL-21 recuperar as células T que expressam estavelmente CARRO (CD19RCD28). CD3 neg células CD56 + NK estão esgotados a partir da cultura usando esferas paramagnéticas CD56-específicos, se a percentagem das células NK é ≥ 10% e, especialmente, se a percentagem de CAR expressado nas células T é baixa. Isto impede que o esgotamento rápido crescimento excessivo das células NK, que interfere com a capacidade de sustentar a AAPC proliferation da CAR + células T. Em certas ocasiões, a depleção de células NK de CAR + células T é realizada durante os últimos dois ciclos de estimulação, mas introduz-se uma perda de células desejadas devido a co-expressão de CD56 em alguns CAR + células T. As células T foram cultivadas em um sistema funcionalmente fechado usando sacos de cultura Vue Vida passado dia 14. Um subconjunto de células geneticamente modificadas e propagadas T são tipicamente criopreservadas no Dia 14 ou Dia 21 (fim dos ciclos de estimulação # 2 ou # 3) de co-cultura em AAPC para servir como uma fonte de material de arquivo para análises futuras e ser descongelado, se problemas imprevistos posteriormente ocorrer durante o processo de fabricação. As células T são tipicamente colhidas em ou cerca do dia 28 de cultura (Figura 3) que expressam rotineiramente&gt; CAR de 90% e são&gt; 80% de viabilidade (Figura 2C e D). Nós já haviam demonstrado que, após quatro semanas de co-cultura sobre AAPC a média de expansão vezes maior de células T CD3 + é 19.800 ± 11.313 com CA<html> R expressão + sendo 90% ± 7,5 13. Estas células T são criopreservadas e sofrer em processo e testes de liberação que informa sobre a segurança e potencial terapêutico do produto fabricado. Testes de liberação é realizada em conformidade com as alterações laboratoriais clínicos de melhora (CLIA) para gerar um certificado de análise antes da infusão para destinatários em ensaios clínicos. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50070/50070fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50070/50070fig1.jpg" /> Figura 1. Passos delineando o processo de electroporate e propagar CAR + células T de PB e UCB. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50070/50070fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . upload/50070/50070fig2highres.jpg &quot;src =&quot; files/ftp_upload/50070/50070fig2.jpg / &quot;/&gt; Figura 2. Caracterização das células T geneticamente modificadas de PB. (A) A expressão de GFP no Dia 0 do ciclo de estimulação primeiro a avaliar a eficiência da transferência de genes. A expressão de CD19-specific CARRO (CD19RCD28), tal como avaliado por citometria de fluxo em células CD3 +, CD8 + e células T CD4 + em (B), aproximadamente, 24 horas após a electroporação e (C) 28 dias após a co-cultura em AAPC. Expressão semelhante da CAR foi observado com as células T derivadas de SCU. (D) Cinética de expressão CAR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50070/50070fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50070/50070fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50070/50070fig3.jpg" /> Figura 3. Propagação da PB-derived CAR+ T células Rate. De expansão numérica de células CD3 + e + CAR células T derivadas de PB repetido por co-cultura em γ-irradiada na presença de AAPC solúvel recombinante humano IL-2 e IL-21. Setas ascendentes indicam as adições de γ-irradiado AAPC que marcam o início de cada ciclo de estimulação. Células UCB derivado carro + T apresentam taxas semelhantes de expansão numérica. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50070/50070fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50070/50070fig4.jpg" /> Figura 4. Esquemática do processo de fabricação usando SB e sistemas AAPC modificar geneticamente e propagar CAR + células T derivadas de PB e UCB. CD19 específico CAR + células T foram geradas pela transferência de electro-SB-derivados plasmídeos de ADN super-enrolado e subsequente co-cultura em K562-derived AAPC (clone # 4), na presença of IL-2 humana recombinante solúvel e IL-21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50070/50070fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <table border="1"><tbody><tr><td width="5"> A origem das células T </td><td width="9"> Transposon * </td><td width="9"> Transposase </td><td width="26"> Infusão de células T </td><td width="1"> IRB # </td><td width="1"> NIH-OBA # </td><td width="1"> # IND </td></tr><tr><td> Autólogo (paciente derivado) ** </td><td> CD19RCD28 </td><td> SB11 </td><td> Depois de transplante autólogo de células-tronco hematopoiéticas </td><td> 2007-0635 </td><td> 0804-922 </td><td> 14193 </td></tr><tr><td> Alogênico (doador-derivada) </td><td> CD19RCD28 </td><td> SB11 </td><td> Após o transplante alogênico de células-tronco hematopoéticas </td><td> 2009-0525 </td><td> 0910-1003 </td><td&gt; 14577 </td></tr><tr><td> Alogênico (doador-derivada) </td><td> CD19RCD28 </td><td> SB11 </td><td> Após o transplante alogênico de sangue de cordão umbilical </td><td> 2010-0835 </td><td> 1001-1022 </td><td> 14739 </td></tr></tbody></table> * Tabela 1. Os ensaios clínicos, sob os auspícios da FDA em MDACC para infundir CD19 específico CAR células T + propagado em AAPC. As células T são prestados específico para CD19 através da expressão forçada de SB transposon codifica para uma CAR 2 ª geração, CD19RCD28 designado, que os sinais através de CD28 e CD3-ε. ** Teste descrito na referência 5.

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Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

As células T que expressam um receptor CD19 específico de antigénio quimérico (CAR) são infundidos como tratamento experimental de células B malignas nos nossos primeiro-em-humanos, os ensaios de terapia génica. Descrevemos a modificação genética das células T utilizando o<em&gt; A Bela Adormecida</em&gt; Sistema (SB) para introduzir CD19 específico CAR e propagação seletivo em designer de antígeno CD19 + células artificiais apresentando.

Aplicação Clínica de<em&gt; A Bela Adormecida</em&gt; Artificial e Antigen Presenting Cells para modificar geneticamente células T de Sangue do Cordão Umbilical e periférica

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

clinical-application-sleeping-beauty-artificial-antigen-presenting

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

18.2K visualizações.  U.T. MD Anderson Cancer Center. As células T que expressam um receptor CD19 específico de antigénio quimérico (CAR) são infundidos como tratamento experimental de células B malignas nos nossos primeiro-em-humanos, os ensaios de terapia génica. Descrevemos a modificação genética das células T utilizando o A Bela Adormecida Sistema (SB) para introduzir CD19 específico CAR e propagação seletivo em designer de antígeno CD19 + células artificiais apresentando.

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HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals may exhibit suppressive immune microenvironment and, in contrast to activating CTL, their autologous antigen presenting cells may tend to tolerize or anergize antigen specific CTL. As a result, although still in the experimental phase, CTL-based adoptive immunotherapy has evolved to become a promising treatment for various diseases such as cancer and virus infections. In initial experiments ex vivo expanded CMV (cytomegalovirus) specific CTL have been used for treatment of CMV infection in immunocompromised allogeneic bone marrow transplant patients. While it is common to have life-threatening CMV viremia in these patients, none of the patients receiving expanded CTL develop CMV related illness, implying the anti-CMV immunity is established by the adoptively transferred CTL1. Promising results have also been observed for melanoma and may be extended to other types of cancer2. 
While there are many ways to ex vivo stimulate and expand human CTL, current approaches are restricted by the cost and technical limitations. For example, the current gold standard is based on the use of autologous DC. This requires each patient to donate a significant number of leukocytes and is also very expensive and laborious. Moreover, detailed in vitro characterization of DC expanded CTL has revealed that these have only suboptimal effector function 3. 
Here we present a highly efficient aAPC based system for ex vivo expansion of human CMV specific CTL for adoptive immunotherapy (Figure 1). The aAPC were made by coupling cell sized magnetic beads with human HLA-A2-Ig dimer and anti-CD28mAb4. Once aAPC are made, they can be loaded with various peptides of interest, and remain functional for months. In this report, aAPC were loaded with a dominant peptide from CMV, pp65 (NLVPMVATV). After culturing purified human CD8+ CTL from a healthy donor with aAPC for one week, CMV specific CTL can be increased dramatically in specificity up to 98% (Figure 2) and amplified more than 10,000 fold. If more CMV-specific CTL are required, further expansion can be easily achieved by repetitive stimulation with aAPC. Phenotypic and functional characterization shows these expanded cells have an effector-memory phenotype and make significant amounts of both TNF&alpha; and IFN&gamma; (Figure 3).

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

A new DC independent method for induction and expansion of antigen-specific T cells is described. HLA A2-Ig based artificial Antigen Presenting Cells (aAPC) are loaded with HLA-A2 restricted peptides to efficiently expand CTL of diverse antigen specificity. This technology holds great potential for CTL-based adoptive immunotherapy.

HLA-Ig Baseado Artificial células apresentadoras de antígenos para a eficiente Ex vivo Ampliação da CTL Humanos

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Imunologia e Infecção

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and anti-infective activity.1 The majority of &gamma;&delta; T cells in peripheral blood have the V&gamma;9V&delta;2 T cell receptor. These cells recognize antigen in a major histocompatibility complex-independent manner and develop strong cytolytic and Th1-like effector functions.1Therefore, &gamma;&delta; T cells are attractive candidate effector cells for cancer immunotherapy. V&gamma;9V&#x03B4;2 T cells respond to phosphoantigens such as (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate (HMBPP), which is synthesized in bacteria via isoprenoid biosynthesis;2 and isopentenyl pyrophosphate (IPP), which is produced in eukaryotic cells through the mevalonate pathway.3 In physiological condition, the generation of IPP in nontransformed cell is not sufficient for the activation of &gamma;&delta; T cells. Dysregulation of mevalonate pathway in tumor cells leads to accumulation of IPP and &gamma;&delta; T cells activation.3 Because aminobisphosphonates (such as pamidronate or zoledronate) inhibit farnesyl pyrophosphate synthase (FPPS), the enzyme acting downstream of IPP in the mevalonate pathway, intracellular levels of IPP and sensitibity to &gamma;&delta; T cells recognition can be therapeutically increased by aminobisphosphonates. IPP accumulation is less efficient in nontransfomred cells than tumor cells with a pharmacologically relevant concentration of aminobisphosphonates, that allow us immunotherapy for cancer by activating &gamma;&delta; T cells with aminobisphosphonates. 4 Interestingly, IPP accumulates in monocytes when PBMC are treated with aminobisphosphonates, because of efficient drug uptake by these cells. 5 Monocytes that accumulate IPP become antigen-presenting cells and stimulate V&gamma;9V&delta;2 T cells in the peripheral blood.6 Based on these mechanisms, we developed a technique for large-scale expansion of &gamma;&delta; T cell cultures using zoledronate and interleukin-2 (IL-2).7 Other methods for expansion of &gamma;&delta; T cells utilize the synthetic phosphoantigens bromohydrin pyrophosphate (BrHPP)8 or 2-methyl-3-butenyl-1-pyrophosphate (2M3B1PP).9 All of these methods allow ex vivo expansion, resulting in large numbers of &gamma;&delta; T cells for use in adoptive immunotherapy. However, only zoledronate is an FDA-approved commercially available reagent. Zoledronate-expanded &gamma;&delta; T cells display CD27-CD45RA- effector memory phenotype and thier function can be evaluated by IFN-&gamma; production assay. 7

Expansion of Human Peripheral Blood  &amp;#947;&amp;#948; T Cells using Zoledronate

A method to expand &gamma;&delta; T cells from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) is described. PBMC-derived &gamma;&delta; T cells are stimulated and expanded using zoledronate and interleukin-2 (IL-2). Large scale expansion of &gamma;&delta; T cells can be applied to autologous cellular immunotherapy of cancer.

Expansão do sangue periférico humano γδ células T usando zoledronato

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and ...

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where the CB does not contain appreciable numbers of virus-experienced T cells which can protect the recipient from infection.1-4 We and others have shown that virus-specific CTL generated from seropositive donors and infused to the recipient are safe and protective.5-8 However, until recently, virus-specific T cells could not be generated from cord blood, likely due to the absence of virus-specific memory T cells. 
In an effort to better mimic the in vivo priming conditions of na&iuml;ve T cells, we established a method that used CB-derived dendritic cells (DC) transduced with an adenoviral vector (Ad5f35pp65) containing the immunodominant CMV antigen pp65, hence driving T cell specificity towards CMV and adenovirus.9 At initiation, we use these matured DCs as well as CB-derived T cells in the presence of the cytokines IL-7, IL-12, and IL-15.10 At the second stimulation we used EBV-transformed B cells, or EBV-LCL, which express both latent and lytic EBV antigens. Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL are used to stimulate the T cells in the presence of IL-15 at the second stimulation. Subsequent stimulations use Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL and IL-2. 
From 50x106 CB mononuclear cells we are able to generate upwards of 150 x 106 virus-specific T cells that lyse antigen-pulsed targets and release cytokines in response to antigenic stimulation.11 These cells were manufactured in a GMP-compliant manner using only the 20% fraction of a fractionated cord blood unit and have been translated for clinical use.

Here we describe the first good manufacturing practice (GMP)-compliant method of producing virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) from umbilical cord blood, a source of predominantly na&#238;ve T cells.

Expandindo linfócitos T citotóxicos do sangue do cordão umbilical que citomegalovírus Target, vírus de Epstein-Barr, e Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike classical T cells, NKT cells recognize lipid antigen in the context of CD1 molecules2. NKT cells express an invariant TCR&alpha; chain rearrangement: V&alpha;14J&alpha;18 in mice and V&alpha;24J&alpha;18 in humans, which is associated with V&beta; chains of limited diversity3-6, and are referred to as canonical or invariant NKT (iNKT) cells. Similar to conventional T cells, NKT cells develop from CD4-CD8- thymic precursor T cells following the appropriate signaling by CD1d 7. The potential to utilize NKT cells for therapeutic purposes has significantly increased with the ability to stimulate and expand human NKT cells with &alpha;-Galactosylceramide (&alpha;-GalCer) and a variety of cytokines8. Importantly, these cells retained their original phenotype, secreted cytokines, and displayed cytotoxic function against tumor cell lines. Thus, ex vivo expanded NKT cells remain functional and can be used for adoptive immunotherapy. However, NKT cell based-immunotherapy has been limited by the use of autologous antigen presenting cells and the quantity and quality of these stimulator cells can vary substantially. Monocyte-derived DC from cancer patients have been reported to express reduced levels of costimulatory molecules and produce less inflammatory cytokines9,10. In fact, murine DC rather than autologous APC have been used to test the function of NKT cells from CML patients11. However, this system can only be used for in vitro testing since NKT cells cannot be expanded by murine DC and then used for adoptive immunotherapy. Thus, a standardized system that relies on artificial Antigen Presenting Cells (aAPC) could produce the stimulating effects of DC without the pitfalls of allo- or xenogeneic cells12, 13. Herein, we describe a method for generating CD1d-based aAPC. Since the engagement of the T cell receptor (TCR) by CD1d-antigen complexes is a fundamental requirement of NKT cell activation, antigen: CD1d-Ig complexes provide a reliable method to isolate, activate, and expand effector NKT cell populations.

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Here we describe a method for activating and expanding human NKT cells from bulk T cell populations using artificial antigen presenting cells (aAPC). The use of CD1d-based aAPC provides a standardized method for generating high numbers of functional NKT cells.

Antígeno Artificial célula apresentadora de ativação mediada (AAPC) e expansão de células T Natural Killer

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for isolating precursor B-cells at four different stages of differentiation. Because genes are expressed and epigenetic modifications occur in a tissue specific manner, it is vital to discriminate between tissues and cell types in order to be able to identify alterations in the genome and the epigenome that may lead to the development of disease. This method can be adapted to any type of cell present in umbilical cord blood at any stage of differentiation.	
This method comprises 4 main steps. First, mononuclear cells are separated by density centrifugation. Second, B-cells are enriched using biotin conjugated antibodies that recognize and remove non B-cells from the mononuclear cells. Third the B-cells are fluorescently labeled with cell surface protein antibodies specific to individual stages of B-cell development. Finally, the fluorescently labeled cells are sorted and individual populations are recovered. The recovered cells are of sufficient quantity and quality to be utilized in downstream nucleic acid assays.

Here we describe a protocol for isolating subsets of precursor B-cells from umbilical cord blood. A sufficient quantity and quality of nucleic acids may be extracted from the cells and used in subsequent assays utilizing DNA or RNA.

Isolamento de precursor de células B subconjuntos de Sangue do Cordão Umbilical

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied by adverse side effects such as a reduced ability to control infections or malignancies. Therefore, new approaches need to be developed that target only the disease mediating cells and leave the remaining immune system intact. Over the past decade a variety of cell based immunotherapy strategies to modulate T cell mediated immune responses have been developed. Most of these approaches rely on tolerance-inducing antigen presenting cells (APC). However, in addition to being technically difficult and cumbersome, such cell-based approaches are highly sensitive to cytotoxic T cell responses, which limits their therapeutic capacity. Here we present a protocol for the generation of non-cellular killer artificial antigen presenting cells (KaAPC), which allows for the depletion of pathologic T cells while leaving the remaining immune system untouched and functional. KaAPC is an alternative solution to cellular immunotherapy which has potential for treating autoimmune diseases and allograft rejections by regulating undesirable T cell responses in an antigen specific fashion.

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Guidelines are presented for the generation of killer artificial antigen presenting cells, KaAPC, an efficient tool for in vitro depletion of human antigen-specific T cells and an alternative solution to cellular immunotherapy for the treatment of T cell-mediated autoimmune diseases in an antigen-specific fashion without compromising the remaining immune system.

Assassino Artificial células apresentadoras de antígenos (KaAPC) para a eficiente<em&gt; In Vitro</em&gt; Depleção de células T humanas antígeno específico da

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

Geração de Células T humanas alo-específicos a partir de Sangue Periférico

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological mechanisms involved during the disease is the T cell transfer model of colitis. In this model, immunodeficient mice (RAG-/- recipients) are reconstituted with naive CD4+ T cells from healthy wild type hosts.
This model allows examination of the earliest immunological events leading to disease and chronic inflammation, when the gut inflammation perpetuates but does not depend on a defined antigen. To study the potential role of antigen presenting cells (APCs) in the disease process, it is helpful to have an antigen-driven disease model, in which a defined commensal-derived antigen leads to colitis. An antigen driven-colitis model has hence been developed. In this model OT-II CD4+ T cells, that can recognize only specific epitopes in the OVA protein, are transferred into RAG-/- hosts challenged with CFP-OVA-expressing E. coli. This model allows the examination of interactions between APCs and T cells in the lamina propria.

In this antigen-driven colitis model, OT-II CD4+ T cells expressing a red fluorescent protein were adoptively transferred into RAG-/- mice that express a green fluorescent protein in mononuclear phagocytes (MPs). The hosts were challenged with Escherichia coli (E.coli) expressing the ovalbumin protein (OVA) fused to a cyan fluorescent protein (CFP).

Desenvolvimento de uma colite Modelo Antigen-driven para o Estudo de apresentação de antígenos por células apresentadoras de antígenos às células T

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Platelet production occurs principally in the bone marrow in a process known as thrombopoiesis. During thrombopoiesis, hematopoietic progenitor cells differentiate to form platelet precursors called megakaryocytes, which terminally differentiate to release platelets from long cytoplasmic processes termed proplatelets. Megakaryocytes are rare cells confined to the bone marrow and are therefore difficult to harvest in sufficient numbers for laboratory use. Efficient production of human megakaryocytes can be achieved in vitro by culturing CD34+ cells under suitable conditions. The protocol detailed here describes isolation of CD34+ cells by magnetic cell sorting from umbilical cord blood samples. The necessary steps to produce highly pure, mature megakaryocytes under serum-free conditions are described. Details of phenotypic analysis of megakaryocyte differentiation and determination of proplatelet formation and platelet production are also provided. Effectors that influence megakaryocyte differentiation and/or proplatelet formation, such as anti-platelet antibodies or thrombopoietin mimetics, can be added to cultured cells to examine biological function.

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

A highly pure population of megakaryocytes can be obtained from cord blood-derived CD34+ cells. A method for CD34+ cell isolation and megakaryocyte differentiation is described here.

Megacariócito diferenciação e formação de plaquetas de humanos cabo hemoderivados CD34 células+

Platelet production occurs principally in the bone marrow in a process known as thrombopoiesis. During thrombopoiesis, hematopoietic progenitor cells ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the antibody needs to distinguish between highly related structures (e.g., a normal protein and a mutated version thereof). The current way of generating such discriminative mAbs involves extensive screening of multiple Ab-producing B cells, which is both costly and time consuming. We propose here a rapid and cost-effective method for the generation of discriminative, fully human mAbs starting from human blood circulating B lymphocytes. The originality of this strategy is due to the selection of specific antigen binding B cells combined with the counter-selection of all other cells, using readily available Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC). Once specific B cells are isolated, cDNA (complementary deoxyribonucleic acid) sequences coding for the corresponding mAb are obtained using single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technology and subsequently expressed in human cells. Within as little as 1 month, it is possible to produce milligrams of highly discriminative human mAbs directed against virtually any desired antigen naturally detected by the B cell repertoire.

We describe a method for the production of human antibodies specific for an antigen of interest, starting from rare B cells circulating in human blood. Generation of these natural antibodies is efficient and rapid, and the antibodies obtained can discriminate between highly related antigens.

Geração dos anticorpos monoclonais humanos discriminativa de rara B antígeno-específicas células circulantes no sangue

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...