Nossa pesquisa se concentra no desenvolvimento de uma terapia celular CAR pronta para uso para infecções fúngicas invasivas. Nosso objetivo é identificar os melhores alvos, designs de CAR e combinação de células imunes para alcançar resultados terapêuticos ideais. Desenvolvimentos recentes, incluindo nosso próprio trabalho, se concentraram no desenvolvimento de terapias com células T CAR direcionadas ao Aspergillus fumigatus.
Essas células modificadas mostraram resultados promissores em modelos pré-clínicos, reduzindo significativamente a carga fúngica, controlando a imunidade antifúngica e melhorando a sobrevida global. Atualmente, a maioria das pesquisas no campo está concentrada na produção de células T CAR específicas para um conjunto muito limitado de alvos usando vetores virais ou sistema de transposons da bela adormecida. Os principais desafios envolvem a identificação de alvos fúngicos ideais e a produção de um produto celular pronto para uso que seja eficaz e escalável para aplicações clínicas.
Com este protocolo, estamos abordando a necessidade de métodos econômicos e escaláveis para gerar células CAR-NK não virais. Ele fornece uma abordagem acessível para a triagem de novos alvos antifúngicos, fornecendo um passo fundamental para a terapia celular CAR-NK pronta para uso para infecções fúngicas. Para começar, verifique as células NK-92 sob o microscópio em busca de aglomerados em um fundo claro, adicione 2 mililitros de meio de cultura de células por poço para cada condição em uma placa de seis poços e coloque a placa em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.
Transferir 8 vezes 10 elevado a 6 células NK-92 para um tubo inferior cónico de 15 mililitros e centrifugar o tubo a 200 G durante cinco minutos com uma aceleração e desaceleração de 3. Depois de descartar o sobrenadante, encha o tubo contendo o pellet celular com até 15 mililitros de PBS pré-aquecido e centrifugue novamente. Durante a centrifugação, pipete 8 microgramas de DNA de plasmídeo Af-CAR e 4 microgramas de minicírculo SB100X em um tubo de reação e mantenha o DNA do segundo tubo livre para servir como um controle simulado.
Para o sistema de transfecção, adicione 3 mililitros de tampão eletrolítico no primeiro tubo e coloque-o na estação de pipeta. Após a centrifugação, descarte suavemente o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 200 microlitros de tampão de ressuspensão. Em seguida, adicione 100 microlitros da suspensão celular em cada um dos dois tubos de reação e misture delicadamente.
Pipete a mistura de células de DNA do primeiro tubo de reação usando a pipeta do sistema de transfecção, insira a pipeta de transfecção verticalmente no tubo na estação de pipeta. Defina o primeiro pulso em 1.650 volts e o tempo de pulso por 20 milissegundos antes de pressionar start para iniciar o pulso. Após o primeiro pulso, ajuste o segundo pulso em 500 volts e o tempo de pulso em 100 milissegundos e inicie o segundo pulso.
Quando o segundo pulso estiver concluído, remova lentamente a pipeta da estação de pipeta. Transfira imediatamente as células para um poço da placa de cultura preparada contendo 2 mililitros de meio de cultura de células pré-aquecido e mova suavemente a placa em movimentos circulares para distribuir uniformemente as células. Incube a placa em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.
Após 30 minutos de incubação, adicione interleucina-2 aos poços a uma concentração final de 150 unidades internacionais por mililitro. Para começar, transfecte as células NK-92 com o plasmídeo desejado. Transfira as células para um tubo inferior cônico de 15 mililitros.
Em seguida, centrifugue as células e dilua-as a uma concentração de 1 a 2 vezes 10 elevado à potência de 6 células por 100 microlitros usando o tampão. Adicione um microlitro de biotina anti-EGFR-T por 1 vezes 10 à potência de 6 células e misture suavemente para garantir que a solução seja distribuída uniformemente. Incube o tubo por 25 minutos a 4 graus Celsius.
Após a incubação, encha o tubo com até 10 mililitros de tampão. Em seguida, centrifugar o tubo a 200 G durante cinco minutos com aceleração e desaceleração de 3 e rejeitar o sobrenadante após centrifugação. Em seguida, adicione 8 microlitros de tampão frio seguido por dois microlitros de esferas magnéticas anti-biotina por 1 vezes 10 à potência de 6 células.
Incube o tubo por 15 minutos a 4 graus Celsius. Para lavar as células, encha o tubo com até 10 mililitros de tampão e centrifugue. Depois de descartar o sobrenadante, ressuspenda as células em 500 microlitros de tampão.
Coloque uma coluna LS no ímã máximo e lave-a com 3 mililitros de buffer. Adicione a suspensão da célula depois que o buffer tiver migrado completamente pela coluna. Depois de lavar a coluna, remova-a do ímã e coloque-a em um tubo inferior cônico limpo de 15 mililitros.
Adicione 5 mililitros de tampão à coluna e use o êmbolo para liberar as células EGF-R positivas o mais rápido possível. A eficiência de transfecção pós-recuperação atingiu 10 a 20% e o enriquecimento máximo aumentou a pureza da célula Af-CAR-NK-92 para mais de 95% Para começar, obtenha células NK-92 enriquecidas que expressam transgenes usando a técnica de classificação de células ativadas por magnetismo. Em seguida, prepare uma suspensão de conídios de Aspergillus fumigatus a uma concentração de 2,5 vezes 10 elevado a 5 conídios por mililitro no meio.
Dispense 100 microlitros da suspensão de conídios em cada poço de uma placa de cultura de 96 poços e incube a placa a 25 graus Celsius por 16 horas. No segundo dia, lave as células NK-92 simuladas e transfectadas com plasmídeo duas vezes com o meio e adicione 5 vezes 10 à potência de 4 células NK-92 em 100 microlitros de meio por poço da placa contendo o fungo para co-cultura. Incube a placa a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono umidificada por pelo menos 6 horas.
Depois de centrifugar a placa a 300 G por cinco minutos, colher 100 microlitros de sobrenadante de cada poço sem tocar no fundo. Por fim, transfira os sobrenadantes para tubos de reação para realizar o ELISA. As células Af-CAR-NK-92 mostraram secreção de interferon gama significativamente maior em comparação com as células NK-92 simuladas durante a co-cultura com tubos germinativos de aspergillus fumigatus.
