Este protocolo permite que os pesquisadores aqueçam precisamente uma bicamada de interface de gotícula, ou DIB, membrana modelo, que permite estudar uma variedade de efeitos relacionados à temperatura que ocorrem em ambientes celulares. A vantagem central decorre da capacidade de medir localmente e controlar a temperatura do banho em um reservatório de baixo volume sem obstruir o acesso para as caracterizações elétricas ou ópticas do DIB. A capacidade de aquecer precisamente o banho de fluido desbloqueia a possibilidade de estudar as propriedades de transporte e sinalização em DIBs formadas a partir de uma variedade muito maior de constituintes de membrana, incluindo extratos celulares naturais.
Trata-se de um protocolo de várias etapas que utiliza vários equipamentos que devem ser seguidos de perto para alcançar precisão experimental suficiente, assim qualquer ambiguidade no processo escrito pode ser esclarecida via demonstração visual. Para começar, junte duas peças de borracha isolante de 1 milímetro de espessura aparadas a 25 por 40 milímetros de comprimento, dois pedaços de uma borracha de seis milímetros de espessura que também são de 25 por 40 milímetros, um conjunto de luminária de alumínio preparado e um reservatório de óleo acrílico que se encaixa na janela de visualização da luminária base de alumínio. Coloque as peças de borracha mais finas sobre o palco do microscópio de tal forma que a borda longa de cada peça seja tangencial à abertura do palco.
Posicione a luminária da base de alumínio em cima das almofadas isolantes com a janela de visualização da luminária centrada acima da lente objetiva. Coloque um pedaço de borracha mais grosso em cima de cada elemento de aquecimento resistivo, em seguida, use um clipe de estágio de microscópio para mantê-lo no lugar para proteger os elementos de aquecimento dos danos causados pelos clipes do palco e para isolar contra curto-circuito elétrico acidental. Dobre cuidadosamente a extremidade de medição de um termopar para alcançar um ângulo de 90 graus a cerca de quatro milímetros do final.
Insira a ponta dobrada do termopar no canto inferior esquerdo da luminária de alumínio e fixe-a suavemente com um parafuso de travamento. Coloque o reservatório de acrílico no poço da luminária de alumínio antes de adicionar óleo de hexadecano ao poço da luminária de alumínio para minimizar o risco de aprisionar bolhas de ar entre a janela de visualização e o fundo do reservatório acrílico. Dispense cerca de 1.000 microlitros de óleo de hexadecano no poço da luminária de alumínio para fornecer uma área máxima de superfície para a transferência de calor ocorrer enquanto não permite que o óleo derrame sobre as bordas da luminária sobre o estágio do microscópio ou lente objetiva.
Distribua cerca de 1.000 microliters de óleo hexadecano no reservatório acrílico sem enchá-lo. Meça a capacitância nominal da membrana enquanto reduz a temperatura do banho de óleo a partir de um ponto de partida que permite a formação de bicamadas para identificar transições de fase termotrópico dos lipídios na membrana. Clique com o botão direito do mouse no gráfico de temperatura na GUI e limpe os dados de exibição para garantir que o espaço suficiente no buffer esteja disponível para gravações subsequentes.
Usando o gerador de forma de onda conectado ao amplificador de grampo de remendo, aplique uma forma de onda de tensão triangular através do bicamador de interface de gotícula, ou DIB, eletrodos e regise a resposta de corrente induzida através da bicamadas. Esfrie a bicamada reduzindo a temperatura do ponto de set em incrementos de cinco graus, esperando um mínimo de cinco minutos na nova temperatura de estado estável entre as mudanças de temperatura até que a temperatura desejada seja alcançada. Após o banho de óleo e o resfriamento da bicamada até a temperatura mínima desejada, clique com o botão direito do mouse no gráfico de temperatura na GUI novamente e exporte os dados de temperatura versus tempo para um software de planilha.
Pare a gravação atual. A partir da corrente medida, calcule a capacitância nominal da resposta corrente de onda quadrada versus o tempo durante o período de resfriamento. Plote a capacitância nominal versus a temperatura para observar como a capacitância da membrana mudou e, em seguida, localizar alterações não monotônicas na capacitância versus temperatura para identificar a temperatura de fusão.
Da mesma forma, avalie a capacidade quase estática específica da bicamada a temperaturas fixas, aumentando sucessivamente a temperatura do banho de óleo e da área de bicamadas. Altere a temperatura do ponto de set em incrementos de 10 graus Celsius usando a GUI e permita que o sistema se equilibre à nova temperatura. Execute etapas descritas anteriormente para iniciar a medição da corrente capacitiva e da gravação.
Altere a área da bicamadas ajustando cuidadosamente as posições dos eletrodos usando os micro manipuladores. Permita que a corrente de onda quadrada atinja uma amplitude de estado estável e colete imagens do DIB para permitir o cálculo da área da membrana versus o tempo. Use uma câmera montada no microscópio para imaginar o bicamado como visto da abertura.
Adicione simultaneamente uma tag digital ao software de gravação atual para marcar o ponto de tempo correspondente para a coleta de imagens. Obtenha um total de cinco imagens DIB e regiões de estado estável de corrente bicamada, em seguida, reinicie a temperatura e repita a imagem. Analise as gravações atuais e as imagens DIB nos pontos de tempo marcados correspondentes às áreas de bicamadas de estado estável, extraia capacitância bicamada e área para cada temperatura.
Plote capacitância versus área para cada temperatura e calcule a inclinação da regressão da primeira ordem, que representa a capacitância específica da bicamada a cada temperatura. Em seguida, plote valores de capacitância específica versus suas respectivas temperaturas. Examine os dados específicos de capacitância versus temperatura para variações não monótônicas para identificar temperaturas de fusão.
Avalie a dinâmica da formação do canal de íons dependentes da tensão gerando uma entrada de passo de tensão DC através da bicamada. Ajuste a tensão inicial ao valor da etapa desejada em milívolts e a tensão final e o tamanho da etapa a um valor superior ao passo desejado. Defina o tempo de duração desejado para a entrada da etapa em segundos e escolha a polaridade desejada para a entrada de passo.
Alterne o amplificador do grampo de remendo para enviar a tensão de comando originária da visualização de laboratório ou do módulo de saída de tensão para o estágio da cabeça, ligue a tensão e regisse a resposta de corrente induzida, o que deve inibir uma resposta em forma de S a uma tensão crítica. Obtenha separadamente relações dinâmicas de tensão de corrente para uma membrana a temperaturas desejadas para revelar relações dependentes de tensão, como comportamentos de canais de íons. Alterne o amplificador do grampo de remendo para enviar a tensão de comando originária do gerador de forma de onda para o estágio da cabeça e inicie gravações de corrente.
No gerador de forma de onda, exaia uma forma de onda sinusoidal contínua com amplitude, deslocamento e frequência desejadas. Regissão a resposta corrente induzida em um ou vários ciclos e repita conforme desejado para diferentes amplitudes de ondas senoidais, frequências e temperaturas. O sistema de controle de temperatura foi usado para mostrar a dependência de temperatura de um DIB formado a partir de extrato lipídedo total cerebral, ou BTLE, lipídios.
Medições de corrente capacitiva e temperatura versus tempo são mostradas durante um ciclo de aquecimento da temperatura ambiente a aproximadamente 60 graus Celsius. Foram documentadas alterações na capacitância nominal versus temperatura em um ciclo completo de resfriamento/aquecimento, após a formação inicial de bicamadas a 60 graus Celsius. Medições quase estáticas de capacitância específica em diferentes temperaturas podem ser usadas para identificar a temperatura de fusão lipídica.
A capacidade de plotagem de uma área bicamada versus bicamada permite uma regressão linear, onde a inclinação representa o valor da capacitância específica. A imagem do DIB mostra que, quando a temperatura está abaixo da temperatura de fusão, a membrana adota um estado altamente adesivo, mesmo sob tensão de gotículas esticadas causadas por eletrodos bem separados. Os traços de corrente versus tensão mostrados foram obtidos aplicando tensões sinusoidais de membrana, medindo a corrente induzida a duas temperaturas diferentes.
As setas e os números subsequentes ajudam a visualizar os sucessivos trimestres da tensão sinusoidal em relação ao tempo. A densidade de corrente medida para uma membrana BTLE dopada por monazomicina no mesmo nível de tensão e duas temperaturas diferentes é mostrada aqui. É crucial distribuir o óleo de hexadecano no poço da luminária de alumínio corretamente.
Se isso for feito fora de sequência ou não com cuidado, as bolhas de ar se formarão sob o poço acrílico, o que obstruirá a visão inferior para cima do DIB. O usuário também deve se lembrar de limpar o buffer de dados no software de controle de temperatura antes de cada medição para garantir a gravação completa. Este procedimento permite caracterizar membranas biomiméticas em uma faixa de temperaturas, que é necessária para estudar a dependência de temperatura da estrutura e transporte da membrana.
Além disso, essa capacidade poderia ser usada para revelar efeitos nanoescala de outras espécies ativas da membrana, como canais de íons biológicos e nanomateriais projetados.
