Agradecemos a Mike Vahey do Lab Fletcher, da Universidade da Califórnia, em Berkeley para aconselhamento sobre os parâmetros microjetting. Este trabalho foi patrocinado pelo NIH conceder DP2 HL117748-01.

1. Infinito Câmara Fabricação <ol><li> Projetar a câmara infinito (nomeado para a sua forma), utilizando um software de desenho assistido computador (CAD), e salve o arquivo de tal forma que seja compatível com um cortador de laser. Para criar esta forma, separados dois círculos de diâmetro 0,183, em por uma distância centro-a-centro de 0,15 cm Corte da câmara de 1/8- 3/16 em acrílico transparente com o cortador a laser. A forma infinito facilita interface de formação em bicamada gota e estabilidade. </li><li> Broca de 1/16 em buraco através da borda da caixa de acrílico para o infinito em forma de poço. Repita no lado oposto. Corte um pequeno rectângulo de uma folha de acrílico 0,2 milímetros com uma tesoura ou um cortador a laser para servir como uma base para os poços. </li><li> Aplicar uma camada fina, mas completa da cola de secagem rápida, para um lado do acrílico 0,2 mm e colá-la para o fundo da câmara. Segurar o acrílico 0,2 milímetros firmemente no lugar contra o fundo da câmara e dispensara cola na interface para permitir que a cola para criar uma vedação, mas evitar que cobre a área de visualização. Certifique-se de alinhar o acrílico de modo que sua borda fique nivelada com a borda da parede da câmara e cobre completamente o recorte câmara infinito. Isto irá permitir a penetração de jacto suficientes e evitar fugas do poço. </li><li> Corte dois pequenos pedaços de borracha natural para cobrir os furos. Aplicar a cola de secagem rápida ao redor do buraco. Coloque a borracha em cima do buraco e de imprensa em todas as áreas com um par de fórceps para fixar. Repita o procedimento para os dois furos. Certifique-se de que todas as ligações são coladas juntas completas, de modo a impedir qualquer fuga. </li><li> Usando um 23 L, 1 em agulha, fazer um buraco na borracha natural em ambos os lados da câmara a fim de facilitar a inserção da ponta do jacto de tinta piezoeléctrica. </li></ol> 2. Preparação Experimental Solução estoque loja de lipídios em clorofórmio em um freezer -20 ° C. Para este estudo, ou 1,2-diphytanoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPhPC) ou 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) foi usado. 2 ml de 25 mg / ml de solução de lípido é tipicamente preparado neste protocolo e vai durar durante dois meses, quando armazenada a -20 ° C. <ol><li> Para voltar a suspender o lípido em n-decano, primeiro transferi-lo de um frasco de estoque para um pequeno frasco de vidro, e seca suavemente sob árgon ou azoto. Segurar o frasco num ângulo durante a secagem para expor mais a área de superfície para o gás, permitindo o lípido para secar mais rapidamente. </li><li> Com a tampa do frasco apenas ligeiramente enroscada, permitir que a solução foi seca ao sentar-se sob vácuo num exsicador durante 1-2 horas. Em seguida, adicionar n-decano, para ressolubilizar o lípido de 25 mg / ml. Vortex a solução brevemente lipídico e sonicate-lo em um banho de ultra-sons para 15 min. Armazenar o lípido reconstituído em n-decano, a -20 ° C. </li><li> Prepara-se uma solução estoque de sacarose. Num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, adicionar 900 ul de 300 mM de sacarose e 100 ulde 1% de metilcelulose (MC). A metilcelulose é adicionado para aumentar a viscosidade da solução, o que ajuda no jacto. Etapa opcional: Adicionar um opcionais 1 ml de corante alimentar de cor escura ou partículas fluorescentes para dar mais contraste ou fluorescência em imagem, respectivamente. Esta solução é uma solução de 300 mOsm sacarose concebido para corresponder a osmolaridade celular e para proporcionar contraste durante microjetting. </li><li> Desenhar a solução numa seringa de 1 ml descartável de plástico. Enquanto segura a seringa com a ponta virada para cima, apertar o eixo várias vezes para expulsar as bolhas em direção à ponta, e empurre o êmbolo para retirar o ar aprisionado. Certifique-se de evacuar todo o ar da seringa antes de prosseguir, uma vez que irá interferir com a contração adequada piezoelétrico responsável por jateamento. </li><li> Instalar um filtro de 0,22 um na extremidade da seringa. Para evitar que o ar fique preso no filtro, segure a seringa na vertical e empurre o êmbolo até que uma gota se forma acima da ponta. Nota: A33 milímetros de diâmetro unidade de filtro de seringa foi encontrada a funcionar melhor, mas os filtros alternativos tão pequeno como um diâmetro de filtro seringa de 3 mm podem ser utilizados para reduzir o volume morto. </li><li> Soltar o adaptador Luer fêmea do jato de tinta, e pressione-o firmemente no lugar durante o fim do filtro. Mais uma vez, ejetar fluido para evitar a retenção de ar. Aperte a parte superior do jato de tinta. Fluid deve viajar para a ponta do jato de tinta depois que ele é completamente conectado. </li></ol> 3. Preparando o Equipamento <ol><li> Usando um v-braçadeira, montar o conjunto de seringa na platina do microscópio. Ligue o fio do jato de tinta para o controlador de jato de tinta. Nota: A fase de costume foi construído para este protocolo, enquanto que a concepção fase pode ser determinada pelo utilizador, que é crítico para o controle xyz independente da seringa e controlo xy do suporte da amostra. </li><li> Determinar a ampliação e combinação necessária para atingir a lente de imagem desejada. Aqui, uma objetiva de 10X e 10X ocular são usados. </li&gt; <li> Use uma câmera de alta velocidade (≥ 1.000 fps) para visualizar a jorrar e geração de vesícula. Antes de imagem, executar necessário calibração da câmara. Utilize auto-trigger com base em imagens dentro do software da câmera para iniciar a captura de imagem. </li><li> Monte a câmara infinito para o palco microscópio. Fixe a câmara gravando-o no lugar no palco. </li><li> Alinhe cuidadosamente a ponta de jato de tinta com o buraco perfurado na borracha natural (ver Figura 1b). Para fazer isso, trazer a jato de tinta próximo da câmara e ajustar o posicionamento por olho, em seguida, fazer ajustes mais precisos através da lente do microscópio. Proceda com cautela, como movimentos grosseiros pode danificar a ponta de jato de tinta. </li><li> Uma vez que o jacto de tinta é alinhada, voltar o conjunto da seringa para fora da câmara para impedir qualquer dano para o jacto de tinta, durante o carregamento dos poços. Certifique-se que o movimento do jato de tinta é unidirecional para que ele permaneça alinhado com o furo na membrana. </li><li> Pressione suavemente sobre a plunger do conjunto da seringa até que uma pequena gota de formas no bico jato de tinta. Isso irá fornecer algum contrapressão inicial. </li><li> Introduza os parâmetros de jateamento. Para uma onda bipolar trapezoidal, utilize os seguintes parâmetros: frequência de 20 kHz de pulso, tempo de 3 ms ascensão, 35 ms de duração de pulso, tempo de 3 ms queda, 65 V de tensão aplicada (amplitude de pulso), e 100 pulsos por jato de gatilho (número de pulsos) . No entanto, a tensão aplicada (a amplitude do pulso) e o número de impulsos (pulsos de jacto por gatilho) pode ser variado para controlar o tamanho das vesículas. </li></ol> 4. Vesícula Geração <ol><li> Adicionar 25-30 uL solução lipídica suspensa em n-decano, para a câmara de infinito, que cobre toda a superfície de ambos os poços. </li><li> Adicionar 25 mL de glicose (de mesma osmolaridade que a solução de sacarose) para a borda externa de um bem, pipetagem lenta e suavemente. Após a deposição, uma queda de glicose devem formar, porque a glicose e de lipídios não se misturam. Adicione mais 251; l de glicose para o bem de frente, o que fará com que uma gota e formar a membrana de dupla camada de lípido no meio da câmara dentro de 5-10 min. </li><li> Insira a jato de tinta através da borracha natural e, cuidadosamente, orientá-la para a bicamada interface de gota. Aproxime-se da bicamada lentamente, como a jato de tinta introduzida deslocará volume e pode romper a bicamada. </li><li> Quando o jato de tinta é dentro de ~ 200 mM, aplique o jateamento com as definições descritas no passo 3.8. A distância a partir da bicamada pode variar dependendo principalmente da quantidade de tensão e de impulso, entre outros parâmetros. Este protocolo recomenda aumentando lentamente configurações (tensão e número de pulsos) e observando a deformação bicamada. </li></ol> 5. Limpeza do equipamento <ol><li> Separe o conjunto seringa do estágio do microscópio, e dispor do 1 ml seringa de plástico e filtro. </li><li> Para limpar a jato de tinta, aspirar as seguintes soluções na ordem mergulhando a ponta na solution 7-10x cada: etanol a 70%, solução a 2% Neutrad em água quente, etanol a 70%, e ddH 2 O. Se a jato de tinta não se encaixa com segurança na pipeta de aspiração, corte uma ponta de pipeta para formar um adaptador. </li><li> Seca-se a câmara com o tecido. Coloque a câmara de infinito em um copo de 250 ml com 2% v / v Neutrad em água morna, e sonicado por 5-10 min. Após sonicação, seque cuidadosamente os poços sob ar comprimido. Qualquer humidade em poços pode comprometer a estabilidade da membrana de bicamada lipídica, de modo que também é recomendável que as câmaras são colocadas num forno a 60 ° C durante 15 min. </li></ol>

<ol>
	<li>Liu, A. P., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+under+construction:+in+vitro+reconstitution+of+cellular+function.">Biology under construction: in vitro reconstitution of cellular function.</a> Nature reviews. Mol. Cell Biol. 10, 644-650 (2009).</li><li>Yeh, B. J., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+biology:+lessons+from+the+history+of+synthetic+organic+chemistry.">Synthetic biology: lessons from the history of synthetic organic chemistry.</a> Nat. Chem. Biol. 3, 521-525 (2007).</li><li>Richmond, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forming+giant+vesicles+with+controlled+membrane+composition,+asymmetry,+and+contents.">Forming giant vesicles with controlled membrane composition, asymmetry, and contents.</a> Proc. Natl. Acad. Soc. U.S.A. 108, 9431-9436 (2011).</li><li>Liu, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-induced+bundling+of+actin+filaments.">Membrane-induced bundling of actin filaments.</a> Nat. Phys. 4, 789-793 (2008).</li><li>Brown, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+tropicalis+egg+extracts+provide+insight+into+scaling+of+the+mitotic+spindle.">Xenopus tropicalis egg extracts provide insight into scaling of the mitotic spindle.</a> J. Cell Biol. 176, 765-770 (2007).</li><li>Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Ries, J., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+regulators+for+bacterial+cell+division+self-organize+into+surface+waves+in+vitro.">Spatial regulators for bacterial cell division self-organize into surface waves in vitro.</a> Science. 320, 789-792 (2008).</li><li>Angelova, M. I., Dimitrov, D. 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C., Li, S., Malmstadt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Fabrication+of+Asymmetric+Giant+Lipid+Vesicles.">Microfluidic Fabrication of Asymmetric Giant Lipid Vesicles.</a> ACS Appl. Mater. Inter. 3, 1434-1440 (1021).</li><li>Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+droplet+interface+bilayers.">Asymmetric droplet interface bilayers.</a> J. Am. Chem. Soc. 130, 5878-5879 (2008).</li><li>Stachowiak, J. C., Richmond, D. L., Li, T. H., Brochard-Wyart, F., Fletcher, D. 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A., Pott, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+unilamellar+vesicle+electroformation+from+lipid+mixtures+to+native+membranes+under+physiological+conditions.">Giant unilamellar vesicle electroformation from lipid mixtures to native membranes under physiological conditions.</a> Methods Enzymol. 465, 161-176 (2009).</li><li>Nishimura, K., Suzuki, H., Toyota, T., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+control+of+giant+unilamellar+vesicles+prepared+from+inverted+emulsion+droplets.">Size control of giant unilamellar vesicles prepared from inverted emulsion droplets.</a> J. Colloid Interface Sci. 376, 119-125 (2012).</li><li>Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+Microfluidics.">Droplet Microfluidics.</a> Lab Chip. 8, 198-220 (2008).</li><li>Stachowiak, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unilamellar+vesicle+formation+and+encapsulation+by+microfluidic+jetting.">Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4697-4702 (2008).</li><li>Osaki, T., Yoshizawa, S., Kawano, R., Sasaki, H., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-coated+microdroplet+array+for+in+vitro+protein+synthesis.">Lipid-coated microdroplet array for in vitro protein synthesis.</a> Anal. Chem. 83, 3186-3191 (2011).</li><li>Liu, A. P., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+polymerization+serves+as+a+membrane+domain+switch+in+model+lipid+bilayers.">Actin polymerization serves as a membrane domain switch in model lipid bilayers.</a> Biophys. J. 91, 4064-4070 (2006).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Muitas técnicas têm sido desenvolvidas para a produção de vesículas, incluindo eletropolimerização, emulsão, e de geração de gotículas 14-16. No entanto, novas técnicas experimentais são necessários para permitir a concepção de sistemas biológicos com a crescente semelhança com os sistemas vivos. Métodos microfluídicos em particular, têm oferecido um aumento do nível de controle que regem unilamellarity membrana, monodispersity de tamanho e conteúdo interno 17,18, trazendo mo...

<html> Tornou-se cada vez mais claro que a biologia celular é um problema multi-escala que envolve a integração de nossa compreensão a partir de moléculas às células. Consequentemente, sabendo exatamente como as moléculas trabalhar individualmente não é suficiente para compreender os comportamentos celulares complexos. Isto é em parte devido à existência de comportamentos emergentes de sistemas multi-componentes, como exemplificado pela reconstituição de interação da rede de actina com vesículas bicamada lipídica 4, montagem do fuso mitótico em Xenopus extrair 5 e dinâmica espacial de bactérias máquinas divisão celular 6. Uma maneira de complementar a abordagem do reducionista de dissecar os processos moleculares dos sistemas vivos é tomar o caminho inverso de reconstituir comportamentos celulares usando um conjunto mínimo de componentes biológicos. Uma parte crítica dessa abordagem envolve o encapsulamento confiável de biomoléculas em um volume confinado, uma característica fundamental de uma célula. e_content &quot;&gt; Várias estratégias existentes para o encapsulamento de biomoléculas para estudar sistemas biomiméticos. O sistema mais biologicamente relevante é membranas de bicamadas de lípidos, que imitam os constrangimentos físicos e bioquímicos impostas pela membrana plasmática da célula. Formação de vesículas unilamelares gigantes (GUVs) por eletropolimerização 7, uma das técnicas mais amplamente utilizadas para a geração de GUV 14, tem, tipicamente, uma baixa eficiência de encapsulação devido à sua incompatibilidade com tampão de alto teor salino 8. eletropolimerização também requer grandes volumes de amostra (&gt; 100 mL), o qual pode ser um problema para o trabalho com proteínas purificadas , e de forma ineficiente incorpora moléculas grandes, devido à dificuldade de difusão entre as camadas lipídicas espaçados. Várias abordagens de microfluidos para gerar vesículas lipídicas foram desenvolvidos. Os métodos de emulsão dupla, que passam através de duas componentes de interfaces entre as camadas de água-óleo-água (W / O / W), baseia-se na evaporação de um volatile solvente para conduzir a formação de bicamada lipídica 9. Outros utilizaram uma linha de montagem de microfluidos, que produz um fluxo contínuo de vesículas lipídicas de duas camadas 10 ou em duas etapas independentes de 11. Desenvolvemos uma técnica alternativa baseada em rápida aplicação de impulsos de fluido de encontro a uma bicamada de interface gota 12 para produzir GUVs de tamanho controlado, composição, e de encapsulamento. A nossa abordagem, conhecida como jacto de microfluidos, oferece as vantagens combinadas de várias técnicas de geração de vesículas existentes, proporcionando uma abordagem para a criação de sistemas de biomoléculas funcionais para investigar uma variedade de problemas biológicos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:633px;" width="633">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Name</td>
			<td style="width:163px;">Company</td>
			<td style="width:157px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:160px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:153px;">Piezoelectric Inkjet</td>
			<td style="width:163px;">MicroFab Technologies</td>
			<td style="width:157px;">MJ-AL-01-xxx</td>
			<td style="width:160px;">xxx denotes orifice diameter in microns</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Jet Drive III Controller</td>
			<td style="width:163px;">MicroFab Technologies</td>
			<td style="width:157px;">CT-M3-02</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">High-speed camera</td>
			<td style="width:163px;">Vision Research</td>
			<td style="width:157px;">MiroEX2</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:153px;">DPhPC lipid in chloroform</td>
			<td style="width:163px;">Avanti</td>
			<td style="width:157px;">850356C</td>
			<td style="width:160px;">Ordered in small aliquots in vials</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:153px;">33mm PVDF filters, 0.2 &#181;m</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:157px;">SLGV033RS</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">1ml syringes</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:157px;">14823434</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">n-Decane</td>
			<td style="width:163px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:157px;">111871000</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Glucose</td>
			<td style="width:163px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:157px;">410950010</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Sucrose</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">S7903-1KG</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Methylcellulose</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:157px;">NC9084958</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:153px;">1/8&#34; Acrylic</td>
			<td style="width:163px;">McMaster Carr</td>
			<td style="width:157px;">8560K239</td>
			<td style="width:160px;">CAD designs for the infinity-shaped chamber are available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">0.2 mm Acrylic</td>
			<td style="width:163px;">Astra Products</td>
			<td style="width:157px;">Clarex clear 001</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Acrylic Cement</td>
			<td style="width:163px;">TAP Plastics</td>
			<td style="width:157px;">10693</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Loctite 495 Superglue</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:157px;">NC9011323</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:153px;">Loctite 3494 UV Strengthening Adhesive</td>
			<td style="width:163px;">Strobels Supply</td>
			<td style="width:157px;">30765</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Natural rubber</td>
			<td style="width:163px;">McMaster Carr</td>
			<td style="width:157px;">85995K14</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:153px;">Custom stage</td>
			<td style="width:163px;">Home made</td>
			<td style="width:157px;">N/A</td>
			<td style="width:160px;">CAD designs are available upon request</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lipid bilayer vesicle generation using microfluidic jetting

Biologia sintética Bottom-up apresenta uma nova abordagem para investigar e reconstituir sistemas bioquímicos e, potencialmente, organismos mínimos. Este campo emergente envolve engenheiros, químicos, biólogos e físicos para projetar e montar componentes biológicos básicos em funcionamento de sistemas complexos, a partir de baixo para cima. Tais sistemas bottom-up pode levar ao desenvolvimento de células artificiais para investigações biológicas fundamentais e terapias inovadoras 1,2. Vesículas unilamelares gigantes (GUVs) pode servir como um modelo para a plataforma de biologia sintética, devido à sua estrutura da membrana celular-como e tamanho. Jacto de microfluidos, ou microjetting, é uma técnica que permite a geração de GUVs com tamanho controlado, a composição da membrana, a incorporação da proteína transmembranar, e encapsulação 3. O princípio de base deste método é o uso de vários impulsos de fluido, de alta-frequência gerados por um dispositivo de jacto de tinta piezo-actuada para deformar uma l suspensobicamada IPID num GUV. O processo é semelhante ao soprar bolhas de sabão a partir de uma película de sabão. Através da variação da composição da solução de hidromassagem, a composição da solução que engloba, e / ou os componentes incluídos na camada dupla, os investigadores podem aplicar esta técnica para criar vesículas personalizadas. Este artigo descreve o procedimento para gerar vesículas simples a partir de uma bicamada interface de gota por microjetting.

Nós montamos uma configuração jorrando microfluídicos em um microscópio de fluorescência invertido convencional com um palco personalizado montado a partir de peças usinadas e micrômetros manuais (Figura 1). Caracterização do jato de tinta fornece insights sobre o processo de geração de vesícula. Variando a distância entre o bico de jacto de tinta e bicamada lipídica afecta a força aplicada para provocar a deformação da membrana. Perto da bicamada concentra a corrente de jacto e impede...

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Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Jorrando Microfluidic contra uma bicamada lipídica interface de gota fornece uma maneira confiável para gerar vesículas com controle sobre a assimetria da membrana, a incorporação de proteínas transmembrana, e encapsulamento do material. Esta técnica pode ser aplicada ao estudo de uma grande variedade de sistemas biológicos, onde são desejados biomoléculas compartimentadas.

Lipid Bilayer Vesicle Geração Usando Microfluidic jateamento

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.7K visualizações.  University of Michigan.  Jorrando Microfluidic contra uma bicamada lipídica interface de gota fornece uma maneira confiável para gerar vesículas com controle sobre a assimetria da membrana, a incorporação de proteínas transmembrana, e encapsulamento do material. Esta técnica pode ser aplicada ao estudo de uma grande variedade de sistemas biológicos, onde são desejados biomoléculas compartimentadas. 

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Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related processes while conferring biocompatibility and biofunctionality to solid substrates. The spontaneous adsorption and rupture of phospholipid vesicles is the most commonly used method to form SLBs. However, under physiological conditions, vesicle fusion (VF) is limited to only a subset of lipid compositions and solid supports. Here, we describe a one-step general procedure called the solvent-assisted lipid bilayer (SALB) formation method in order to form SLBs which does not require vesicles. The SALB method involves the deposition of lipid molecules onto a solid surface in the presence of water-miscible organic solvents (e.g., isopropanol) and subsequent solvent-exchange with aqueous buffer solution in order to trigger SLB formation. The continuous solvent exchange step enables application of the method in a flow-through configuration suitable for monitoring bilayer formation and subsequent alterations using a wide range of surface-sensitive biosensors. The SALB method can be used to fabricate SLBs on a wide range of hydrophilic solid surfaces, including those which are intractable to vesicle fusion. In addition, it enables fabrication of SLBs composed of lipid compositions which cannot be prepared using the vesicle fusion method. Herein, we compare results obtained with the SALB and conventional vesicle fusion methods on two illustrative hydrophilic surfaces, silicon dioxide and gold. To optimize the experimental conditions for preparation of high quality bilayers prepared via the SALB method, the effect of various parameters, including the type of organic solvent in the deposition step, the rate of solvent exchange, and the lipid concentration is discussed along with troubleshooting tips. Formation of supported membranes containing high fractions of cholesterol is also demonstrated with the SALB method, highlighting the technical capabilities of the SALB technique for a wide range of membrane configurations.

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

We present an experimental protocol to form a supported lipid bilayer on solid substrates without using lipid vesicles. We demonstrate a one-step method to form a lipid bilayer on silicon dioxide and gold as well as supported membranes with cholesterol-enriched domain for various biological applications.

Biomembrane Fabrication pelo Solvent-assistida Lipid bicamada (SALB) Método

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Bioengenharia

Automated Lipid Bilayer Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Thin Film

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for biosensor applications. However, conventional BLM formation techniques have several drawbacks and they often require specific expertise and laborious processes. In particular, conventional BLMs suffer from low formation success rates and inconsistent membrane formation time. Here, we demonstrate a storable and transportable BLM formation system with controlled thinning-out time and enhanced BLM formation rate by replacing conventionally used films (polytetrafluoroethylene, polyoxymethylene, polystyrene) to polydimethylsiloxane (PDMS). In this experiment, a porous-structured polymer such as PDMS thin film is used. In addition, as opposed to conventionally used solvents with low viscosity, the use of squalene permitted a controlled thinning-out time via slow solvent absorption by PDMS, prolonging membrane lifetime. In addition, by using a mixture of squalene and hexadecane, the freezing point of the lipid solution was increased (~16 &#176;C), in addition, membrane precursors were produced that can be indefinitely stored and readily transported. These membrane precursors have reduced BLM formation time of &#60; 1 hr and achieved a BLM formation rate of ~80%. Moreover, ion channel experiments with gramicidin A demonstrated the feasibility of the membrane system.

We demonstrate a storable, transportable lipid bilayer formation system. A lipid bilayer membrane can be formed within 1 hr with over 80% success rate when a frozen membrane precursor is brought to ambient temperature. This system will reduce laborious processes and expertise associated with ion channels.

Formação Automated Lipid bicamada da membrana Usando um polidimetilsiloxano Thin Film

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for ...

Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological studies. In the past years, it has become increasingly clear that living cells respond, not only to the biochemical nature of the molecules presented to them but also to the way these molecules are presented. Creating protein micro-patterns is therefore now standard in many biology laboratories; nano-patterns are also more accessible. However, in the context of cell-cell interactions, there is a need to pattern not only proteins but also lipid bilayers. Such dual proteo-lipidic patterning has so far not been easily accessible. We offer a facile technique to create protein nano-dots supported on glass and propose a method to backfill the inter-dot space with a supported lipid bilayer (SLB). From photo-bleaching of tracer fluorescent lipids included in the SLB, we demonstrate that the bilayer exhibits considerable in-plane fluidity. Functionalizing the protein dots with fluorescent groups allows us to image them and to show that they are ordered in a regular hexagonal lattice. The typical dot size is about 800 nm and the spacing demonstrated here is 2 microns. These substrates are expected to serve as useful platforms for cell adhesion, migration and mechano-sensing studies.

We present a protocol to functionalize glass with nanometric protein patches surrounded by a fluid lipid bilayer. These substrates are compatible with advanced optical microscopy and are expected to serve as platform for cell adhesion and migration studies.

Matrizes ligando Nano-fragmentação em uma bicamada lipídica Compatível

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to entry for non-specialists who would benefit greatly from the ability to develop their own microfluidic devices to address research questions. Particularly lacking has been the open dissemination of protocols related to photolithography, a key step in the development of a replica mold for the manufacture of polydimethylsiloxane (PDMS) devices. While the fabrication of single height silicon masters has been explored extensively in literature, fabrication steps for more complicated photolithography features necessary for many interesting device functionalities (such as feature rounding to make valve structures, multi-height single-mold patterning, or high aspect ratio definition) are often not explicitly outlined. 
Here, we provide a complete protocol for making multilayer microfluidic devices with valves and complex multi-height geometries, tunable for any application. These fabrication procedures are presented in the context of a microfluidic hydrogel bead synthesizer and demonstrate the production of droplets containing polyethylene glycol (PEG diacrylate) and a photoinitiator that can be polymerized into solid beads. This protocol and accompanying discussion provide a foundation of design principles and fabrication methods that enables development of a wide variety of microfluidic devices. The details included here should allow non-specialists to design and fabricate novel devices, thereby bringing a host of recently developed technologies to their most exciting applications in biological laboratories.

Multilayer microfluidic devices often involve the fabrication of master molds with complex geometries for functionality. This article presents a complete protocol for multi-step photolithography with valves and variable height features tunable to any application. As a demonstration, we fabricate a microfluidic droplet generator capable of producing hydrogel beads.

Multi-passo fotolitografia Variável Altura para Valved multicamada microfluídicos Devices

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

Geração de Condições Ambientais Dinâmicas usando um dispositivo microfluido de alto rendimento

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform

Lipid-based drug carriers have been used for clinically and commercially available delivery systems due to their small size, biocompatibility, and high encapsulation efficiency. Use of lipid nanoparticles (LNPs) to encapsulate nucleic acids is advantageous to protect the RNA or DNA from degradation, while also promoting cellular uptake. LNPs often contain multiple lipid components including an ionizable lipid, helper lipid, cholesterol, and polyethylene glycol (PEG) conjugated lipid. LNPs can readily encapsulate nucleic acids due to the ionizable lipid presence, which at low pH is cationic and allows for complexation with negatively charged RNA or DNA. Here LNPs are formed by encapsulating messenger RNA (mRNA) or plasmid DNA (pDNA) using rapid mixing of the lipid components in an organic phase and the nucleic acid component in an aqueous phase. This mixing is performed using a precise microfluidic mixing platform, allowing for nanoparticle self-assembly while maintaining laminar flow. The hydrodynamic size and polydispersity are measured using dynamic light scattering (DLS). The effective surface charge on the LNP is determined by measuring the zeta potential. The encapsulation efficiency is characterized using a fluorescent dye to quantify entrapped nucleic acid. Representative results demonstrate the reproducibility of this method and the influence that different formulation and process parameters have on the developed LNPs.

Lipid nanoparticles are developed using a microfluidic mixing platform approach for mRNA and DNA encapsulation.

Formulando e caracterizando nanopartículas lipídicas para entrega de genes usando uma plataforma de mistura microfluida

Lipid-based drug carriers have been used for clinically and commercially available delivery systems due to their small size, biocompatibility, and high ...

Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of concept, a simplified and undifferentiated human skin containing a dermal (stromal) and an epidermal (epithelial) compartment has been modelled. To accomplish this, a versatile and robust, vinyl-based device divided into two chambers has been developed, overcoming some of the drawbacks present in microfluidic devices based on polydimethylsiloxane (PDMS) for biomedical applications, such as the use of expensive and specialized equipment or the absorption of small, hydrophobic molecules and proteins. Moreover, a new method based on parallel flow was developed, enabling the in situ deposition of both the dermal and epidermal compartments. The skin construct consists of a fibrin matrix containing human primary fibroblasts and a monolayer of immortalized keratinocytes seeded on top, which is subsequently maintained under dynamic culture conditions. This new microfluidic platform opens the possibility to model human skin diseases and extrapolate the method to generate other complex tissues.

Here, we present a protocol to generate a three-dimensional simplified and undifferentiated skin model using a micromachined microfluidic platform. A parallel flow approach allows the in situ deposition of a dermal compartment for the seeding of epithelial cells on top, all controlled by syringe pumps.

Geração de um modelo simplificado de pele em um chip tridimensional em uma plataforma microfluida micromaquinda

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of ...

Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial protective barrier for all cell types, separating the internal cellular components from the extracellular environment. These membranes are composed largely of a lipid bilayer, which contains outer hydrophilic head groups and inner hydrophobic tail groups, along with various proteins and cholesterol. The composition and structure of the lipids themselves play a crucial role in regulating biological function, including interactions between cells and the cellular microenvironment, which may contain pharmaceuticals, biological toxins, and environmental toxicants. In this study, methods to formulate uni-lipid and multi-lipid supported and suspended cell mimicking lipid bilayers are described. Previously, uni-lipid phosphatidylcholine (PC) lipid bilayers as well as multi-lipid placental trophoblast-inspired lipid bilayers were developed for use in understanding molecular interactions. Here, methods for achieving both types of bilayer models will be presented. For cell mimicking multi-lipid bilayers, the desired lipid composition is first determined via lipid extraction from primary cells or cell lines followed by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS). Using this composition, lipid vesicles are fabricated using a thin-film hydration and extrusion method and their hydrodynamic diameter and zeta potential are characterized. Supported and suspended lipid bilayers can then be formed using quartz crystal microbalance with dissipation monitoring (QCM-D) and on a porous membrane for use in a parallel artificial membrane permeability assay (PAMPA), respectively. The representative results highlight the reproducibility and versatility of in vitro cell membrane lipid bilayer models. The methods presented can aid in rapid, facile assessment of the interaction mechanisms, such as permeation, adsorption, and embedment, of various molecules and macromolecules with a cell membrane, helping in the screening of drug candidates and prediction of potential cellular toxicity.

This protocol describes the formation of cell mimicking uni-lipid and multi-lipid vesicles, supported lipid bilayers, and suspended lipid bilayers. These in vitro models can be adapted to incorporate a variety of lipid types and can be used to investigate various molecule and macromolecule interactions.

Montagem de Modelos de Bicamadas lipídicas apoiadas e suspensas para o estudo de interações moleculares

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial ...

Testing the In Vitro and In Vivo Efficiency of mRNA-Lipid Nanoparticles Formulated by Microfluidic Mixing

Lipid nanoparticles (LNPs) have attracted widespread attention recently with the successful development of the COVID-19 mRNA vaccines by Moderna and Pfizer/BioNTech. These vaccines have demonstrated the efficacy of mRNA-LNP therapeutics and opened the door for future clinical applications. In mRNA-LNP systems, the LNPs serve as delivery platforms that protect the mRNA cargo from degradation by nucleases and mediate their intracellular delivery. The LNPs are typically composed of four components: an ionizable lipid, a phospholipid, cholesterol, and a lipid-anchored polyethylene glycol (PEG) conjugate (lipid-PEG). Here, LNPs encapsulating mRNA encoding firefly luciferase are formulated by microfluidic mixing of the organic phase containing LNP lipid components and the aqueous phase containing mRNA. These mRNA-LNPs are then tested in vitro to evaluate their transfection efficiency in HepG2 cells using a bioluminescent plate-based assay. Additionally, mRNA-LNPs are evaluated in vivo in C57BL/6 mice following an intravenous injection via the lateral tail vein. Whole-body bioluminescence imaging is performed by using an in vivo imaging system. Representative results are shown for the mRNA-LNP characteristics, their transfection efficiency in HepG2 cells, and the total luminescent flux in C57BL/6 mice.

Testing the In Vitro and In Vivo Efficiency of mRNA-Lipid Nanoparticles Formulated by Microfluidic Mixing

Here, a protocol for formulating lipid nanoparticles (LNPs) that encapsulate mRNA encoding firefly luciferase is presented. These LNPs were tested for their potency in vitro in HepG2 cells and in vivo in C57BL/6 mice.

Testando a Eficiência In Vitro e In Vivo de Nanopartículas de RNAm-Lipídios Formuladas por Mistura Microfluídica

Lipid nanoparticles (LNPs) have attracted widespread attention recently with the successful development of the COVID-19 mRNA vaccines by Moderna and ...

Configuração de um dispositivo microfluídico para produção combinatória de plugues

Bilayer Microfluidic Device for Combinatorial Plug Production

Droplet microfluidics is a versatile tool that allows the execution of a large number of reactions in chemically distinct nanoliter compartments. Such systems have been used to encapsulate a variety of biochemical reactions - from incubation of single cells to implementation of PCR reactions, from genomics to chemical synthesis. Coupling the microfluidic channels with regulatory valves allows control over their opening and closing, thereby enabling the rapid production of large-scale combinatorial libraries consisting of a population of droplets with unique compositions. In this paper, protocols for the fabrication and operation of a pressure-driven, PDMS-based bilayer microfluidic device that can be utilized to generate combinatorial libraries of water-in-oil emulsions called plugs are presented. By incorporating software programs and microfluidic hardware, the flow of desired fluids in the device can be controlled and manipulated to generate combinatorial plug libraries and to control the composition and quantity of constituent plug populations. These protocols will expedite the process of generating combinatorial screens, particularly to study drug response in cells from cancer patient biopsies.

Autor em destaque: Integrando abordagens computacionais e experimentais em oncologia de precisão

The fabrication of a polydimethylsiloxane (PDMS)-based bilayer device for the production of combinatorial libraries in water-in-oil emulsions (plugs) is presented here. The necessary hardware and software required to automate plug production are detailed in the protocol, and the production of a quantitative library of fluorescent plugs is also demonstrated.

Dispositivo microfluídico bicamada para produção de plugue combinatório

Droplet microfluidics is a versatile tool that allows the execution of a large number of reactions in chemically distinct nanoliter compartments. Such ...