Os autores agradecem Tracy Young-Pearse e Atsushi Kamiya para a prestação de plasmídeos. Este trabalho foi financiado pela Neuron-ERANET Discover para OU e CK (BMBF 01EW1003), DFG (Ko 1679/3-1; GRK1033) para CK, e (DE 792/2-4) para MASS

Todos os experimentos com animais foram autorizados pela Landesministerium responsável für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV NRW; 87-51.05.2010.A301), de acordo com a legislação nacional e europeia. 1. In utero Eletroporação Este método foi descrito pormenorizadamente na JOVE para o rato por Walantus et al. 3, bem como Rice et al. 4 e é aqui resumida brevemente. Um tamanho de ninhada de 6-8 filhotes rende um bom resultado. Deve haver, pelo menos, dois embriões não electroporadas, a fim de aumentar a taxa de sobrevivência global (ver abaixo). <ol><li> Preparar DNA-mistura que contém 1,5 mg / mL de meta-Plasmid (shRNA: pENTR-U6; Invitrogen, Eugene, OR / Disc1 superexpressão: pCAX 21), 0,5 mg / mL de luciferase contendo plasmídeo (pCAX), 0,5 ug / uL GFP contendo plasmídeo (pCAGGS 22) em 1x PBS solução manchado blu luze com Fast Green Dye. </li><li> Prepare agulhas de injeção de capilares de vidro com uma agulha Pipeta Extrator. E esterilizar instrumentos cirúrgicos ou em autoclave ou a incubação com um desinfetante à base de álcool (kodan Tinktur forte). </li><li> Administrar uma dose pré-operatória de buprenorfina (0,05 mg / kg) 15 minutos antes da cirurgia para uma rata grávida 16 dias após a fertilização (E16). Então anestesiar os animais numa câmara de isoflurano. <ol><li> Após a anestesia, coloque o rato em decúbito dorsal sobre uma mesa de operação 37 ° C-aquecido com máscara de respiração ligado ao aparelho de anestesia, usando configuração de oxigênio em 0,4 L / min e isoflurano em 1,8%. </li><li> Depois de raspar o abdômen, desinfetar a área depilada três vezes com kodan Tinktur Forte (um desinfetante à base de álcool). </li><li> Cubra o rato com panos estéreis, expondo apenas o campo de operação raspada. </li></ol></li><li> Execute in utero eletroporação. <ol><li> Corte o abdômen com uma Tesourasr ao longo da linha alba (~ 2cm). </li><li> Expor os cornos uterinos cuidadosamente com um anel de fórceps. </li><li> Tome cuidado para manter a parede do útero molhado com aquecido PBS estéril durante toda a cirurgia. </li><li> Injectar solução de ADN com uma agulha de vidro fino para um dos ventrículos laterais de embriões. </li><li> Coloque o eletrodo 7 milímetros ao redor da cabeça do embrião. Para bater uma população de células de camadas corticais superiores, realizar a IUE em E16 23 e posicionar o eletrodo positivo no hemisfério acima do ventrículo injetado com uma ligeira dorsal / lateral, tendência. Para atingir as células do hipocampo de alterar a colocação do eléctrodo positivo para o lado oposto do que o ventrículo lateral, injectados com a direcção ligeiramente dorsal (Figura 1). </li><li> Realize eletroporação por cinco a 50 pulsos ms a 55 V com 950 breaks ms com uma onda de pulso electroporador quadrado. </li><li> Poupar o primeiro embrião no final vaginal de cada trompa do útero, a fim de aumentar a tele as chances de sobrevivência de todos os embriões. </li><li> Coloque os chifres do útero de volta para o rato mãe. </li><li> Stich da parede abdominal com uma Vicryl material absorvível sutura cirúrgica. </li><li> Fechar a pele com o material de sutura de Vicryl ou com grampos de sutura. </li><li> Coloque o rato mãe de volta para a gaiola e mantê-lo quente por 2-3 horas. </li><li> Segure os ratos sozinho em sua gaiola na sala de instalações para animais e ração à vontade. Eles dão à luz entre E22-24. </li><li> Manter os filhotes de ratos com sua mãe por três semanas e depois separá-los por gênero. </li></ol></li></ol> 2. Bioluminescência Imagens ao vivo da reação enzimática da luciferase Este método é utilizado para analisar a posição das células transfectadas no útero. Co-electroporados cDNA firefly luciferase é traduzido em luciferase ativo, que após metabolização de D-luciferina para oxiluciferina, emite um fóton (Figura 2 </strong&gt;). A luminescência resultante pode ser detectado no cérebro de ratos jovens positivos electroporadas em um espectro IVIS-se com a idade de cerca de 35 dias após o parto (Figura 4). No presente estudo, o ensaio de luciferase e a bioluminescência de imagem foi realizado a partir de P7. Este ponto de tempo foi escolhido para permitir que a mãe e os filhotes para recuperar do stress do nascimento. Quando inicialmente trabalhando com os filhotes no P0, a sobrevivência das crias foi severamente afetado em que os filhotes foram encontrados mortos ou comido pela mãe. Inicialmente, os filhotes de rato com a electroporação de sucesso são identificados por uma imagem 2D-bioluminescência com um tempo de exposição de três minutos. Posteriormente, os filhotes positivos são utilizados para a criação de imagens 3D, a fim de especificar a localização da área electroporados. <ol><li> Dilui-se o sal de sódio D-luciferina em PBS a uma concentração de 15 mg / ml e esterilizar por filtração através de um filtro de seringa estéril. </li><li> Pesar os filhotes. </li><li> Leve o filhote em um lado com o abdômen em cima e esticar o abdômen ligeiramente. Injectar 10 mL / g de peso corporal de solução de luciferina intraperitoneal. Para os mais velhos e mais ágeis, pré-anestesiar os filhotes com isoflurano na câmara de indução antes de injetar a luciferina. </li><li> Ligue o influxo isoflurano da XGI-8 Gas Anestesia Sistema dentro do IVIS Spectrum com 3% de isoflurano. </li><li> Coloque o focinho do animal para os cones do nariz de vidro do sistema de anestesia. </li><li> Mantenha o animal em uma posição propensa até que esteja em anestesia profunda (2-3 min). Em seguida, reduzir o influxo de isoflurano a 1,5%. </li><li> Escolha uma medição 2D-bioluminescência para selecionar filhotes positivos de toda a ninhada. Use as seguintes configurações <img alt="Tela 1" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen1.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <ol><li> Defina um checkmark na fotografia com binning médio e F / Stop em 8, a câmera tira uma foto de cima após o início da medição. </li><li> Definir filtro de excitação: block. </li><li> Definir filtro de Emissão: aberto. </li><li> Definir Binning para médio. </li><li> Defina F / Stop em 1. </li><li> Definir o nível de Estágio A. </li><li> Definir luminescência tempo de exposição a 180 seg. </li></ol></li><li> Para a criação de imagens 3D, a fim de melhor quantificar a área electroporados dos filhotes positivos, use as seguintes configurações DLIT para luciferase de vaga-lume. <img alt="Tela 3" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen3.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <ol><li> Definir uma marca de seleção na fotografia, a câmera tira uma foto de cima após o início da medição. </li><li> Definir uma marca de verificação na estrutura, a superfície do animal é digitalizado pela IVIS antes da medição da bioluminescência. </li><li> Use após filtros de emissão e configurações de tempo de exposição até a idade de duas semanas; Filtro de emissão de 1: 590 nm, tempo de exposição de 300 seg Filtro de emissão 2: 600 nm, tempo de exposição de 240 seg Filtro de emissão 3: 620 nm, tempo de exposição de 180 seg Filtro de emissão de 4: 640 nm, tempo de exposição de 120 seg Para os ratos com mais de P20 Filtro de emissão de 1: 600 nm, tempo de exposição de 300 seg Filtro de emissão 2: 620 nm, tempo de exposição de 300 seg Filtro de emissão 3: 640 nm, tempo de exposição de 300 seg <img alt="Tela 3" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen3.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . Devido à diminuição da intensidade do sinal em animais velhos, o tempo de exposição é ampliada para os três melhores filtros de emissão. </li><li> Definir o nível de Estágio B </li><li> Definir Binning para médio. </li><li> Defina F / Stop em 1 </li></ol></li><li> Após a medição, mar<html> k os ratos por um código Earhole para diferenciá-los uns dos outros e combiná-los com as fotos de imagem IVIS Vivo </li><li> No final do procedimento de medição, desligar isoflurano afluxo e manter o rato sobre a placa aquecida durante alguns minutos, antes de voltar para a sua jaula. </li></ol> 3. Análise de Imagens bioluminescência A geração de imagens em 3D, os filmes em 3D e a quantificação do volume da fonte de sinal é feita pelo software de estar imagem pré-instalado no IVIS Spectrum. <ol><li> Geração de imagens em 3D <ol><li> Primeiro, reconstruir a topografia da superfície, portanto, definir o limite entre 20-30%. <img alt="Tela 4" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen4.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt="Tela 5" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen5.jpg" /> een 6 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50146/50146screen6.jpg &quot;/&gt; </li><li> Comece DLIT reconstrução 3D com um limite de imagem de 10% para cada comprimento de onda. <img alt="Tela 7" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen7.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen7large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt="Tela 8" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen8.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen8large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt="Tela 9" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen9.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen9large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . </li><li> Crie filmes em 3D usando o botão animado dentro da barra de ferramentas 3D. </li><li> Escolha diferentes orientações da imagem em 3D, bem como visualizações de zoom como quadros-chave e pressione o &#39;Record &amp; #39; botão, registrando a passagem de uma posição / orientação para o outro. <img alt="Tela 10" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen10.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen10large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . </li></ol></li></ol> 4. Teste Comportamental Teste comportamental foi realizado a fim de determinar se as manipulações do gene IUE mediadas no rato pode iniciar efeitos de longo prazo que persistem na idade adulta. No presente caso, o efeito do transiente, unilateral comprimento total DISC1 humano cortical superexpressão após IUE foi investigada por meio de testes de locomoção em um campo aberto (OF), com e sem uma dose baixa de anfetamina, como um teste específico para dopamina relacionada comportamento 24. Num procedimento semelhante realizada por Niwa et al. Em ratinhos IUE usando knockdown Disc1, ratinhos IUE mas não controlos mostraram hipersensibilidadea anfetamina 18. Os ratos que foram no útero electroporated com um overexpressing vetor DISC1 foram realizados em condições de laboratório, com luz 12 horas sete horas - sete horas e foram alimentados ad libitum. Aos 3 meses de idade, os ratos foram submetidos a testes de comportamento. Para quantificar a locomoção como uma leitura dos efeitos da anfetamina, um campo aberto de um sistema de atividade Tru digitalização situado em uma câmara de som e de luz isolado foi usado. Este sistema mede o tempo de duração e distância os movimentos de animais, tempo e distância passados ​​na margem ou no centro do campo aberto, bem como a criação de comportamento 25. <ol><li> No primeiro dia, depois de testar a injecção de soro fisiológico <ol><li> Pesar os animais. </li><li> Injectar por via intraperitoneal 1 ul / g de peso corporal de uma solução salina (PBS 1x). </li><li> Logo após a injeção, colocar o animal para o campo aberto e iniciar a medição do sistema TruScan. Record para 15 min umad subdividir dados em 3 x 5 min partes. </li><li> Coloque o animal de volta para sua gaiola. </li></ol></li><li> Segundo dia, teste na injeção de anfetamina <ol><li> Pesar os animais. </li><li> Injectar por via intraperitoneal 1 ul / g de peso corporal de uma solução a anfetamina 0,5 mg / ml. </li><li> Logo após a injeção de colocar o animal para o campo aberto e iniciar a medição do sistema TruScan. Recorde durante 15 min e subdividir dados em 3 x 5 min partes. </li><li> Devolver o animal para sua gaiola. </li></ol></li><li> Analisar locomoção e criação de comportamento gerado pelo software de digitalização Tru específico. Crie gráficos com GraphPad (Prisma) e calcular estatísticas pelo software SPSS Statistics. </li></ol>

<ol>
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Os autores deste estudo não têm interesse financeiro neste estudo e não foram patrocinados pela indústria para este estudo. Taxas de acesso aberto foram contribuídas por PerkinElmer Inc. publicação post.

O nosso estudo mostra que IUE é adequado para gerar ratos adultos com os neurónios que expressam um transgene em uma área selectivo do cérebro e que, como resultado desta intervenção, estes animais apresentam mudanças de comportamento, indicando a funcionalidade da manipulação realizada. Neste estudo, por exemplo, os ratos que sobrexpressam Disc1 unilateralmente em uma pequena parte do córtex pré-frontal mostraram hipersensibilidade direcção anfetamina (Figura 9). Seleção de ratos para o sucesso eletroporação in vivo por bioluminescência imagem foi eficiente no controle da variabilidade inerente de transfecção de células IUE e foi aplicado para gerar grupos com uma área homogênea IUE de baixa variabilidade inter-sujeitos para investigações posteriores. Neste estudo, não fomos capazes de selecionar filhotes electroporados da ninhada por detecção de fluorescência induzida por GFP co-electroporados no animal recém-nascido, mesmo thourg, ao mesmo tempo e no mesmo animal um sinal de bioluminescência da luciferase igualmente co-electroporado poderia ser detectado após a injecção de luciferina (Figura 6), e o GFP expressando neurónios estavam ainda presentes no cérebro com uma idade de seis meses. Conclui-se que, no rato, a reacção da luciferase / luciferina é bem adequada para diferenciar animais com cérebros electroporadas sucesso (Figura 3). O controlo quantitativo de sucesso IUE relaciona-se com a intensidade do sinal de bioluminescência que é medida pela contagem de fotões dentro do mesmo tempo de exposição (Figura 3) e corresponde à actividade enzimática de luciferase co-expressa. Sinais de bioluminescência pequenas são detectáveis ​​por 100-200 contagens de fótons, e, em um esplendor de ~ 1x10 4 fótons / seg / cm 2 / show esterradiano 1.000-2.000 as células marcadas com GFP na histologia no 6 meses de idade cérebro de rato. A maior disp sinalDefiniu um brilho de até ~ 5x10 6 fótons / seg / cm 2 / esterradiano e ~ 64.000 contagens. Na estirpe de ratos Sprague Dawley utilizado, observou-se um enfraquecimento do sinal de bioluminescência longitudinalmente com o aumento da idade e do sinal desapareceu para além da idade de P35 (Figura 4). Neste momento, nós não sabemos se quer o transitório, expressão baseada em vetor plasmídeo de luciferase diminui, ou se o sinal de bioluminescência enfraquece devido ao aumento da massa cerebral, ou ambas são as causas para o sinal desaparecer. Para o presente ensaio funcional em ratos adultos, a selecção para os estudos de comportamento foi feita apenas com base na localização do sinal, mas não pela intensidade do sinal da bioluminescência. Apesar de a monitorização da bioluminescência quantitativa 3D permitiram a diferenciação entre as diferentes áreas de electroporação (Figura 5), o seu rigor foi limitada para as células localizadas na profundidade dimension do cérebro. Figura 6 mostra um exemplo de uma electroporação do hipocampo onde a medição da bioluminescência no 2D e a imagem 3D indicado um bom posicionamento da electroporação. No cérebro post mortem dissecados, um sinal de GFP foi detectado por fluorescência mais ou menos na mesma posição que o sinal de bioluminescência, indicando correcto direccionamento do hipocampo. Mas mostra histologia que também as células do córtex dorsal do hipocampo foram alvo (Figura 7). Isso indica que o ensaio de bioluminescência é uma ferramenta útil para detectar, filhotes IUE positivos e também para ter uma idéia da área electroporados, mas, em última instância, a imagem não pode substituir histologia post mortem a exatamente localizar células-alvo de forma positiva. Nossa demonstração indica promessa para a aplicação da tecnologia de IUE para gerar manipulações sutis alvo de regiões cerebrais corticais ou do hipocampo para simular aberrações em cmigração ortical ou outros defeitos do desenvolvimento neurológico que podem influenciar o animal adulto. Enquanto electroporação bilateral 26 tem a vantagem de um possível efeito maior sobre o comportamento, há também mais a mortalidade dos embriões. Eletroporação unilateral foi escolhido a fim de comparar os dois hemisférios com um como um controle interno, bem como para mostrar que, mesmo manipulando IUE em um unilateral, pequena região é suficiente para mudar o comportamento. Mudanças induzidas pelo IUE na conectividade entre os neurônios ou arquitetura pode, assim, ser induzido sem evocar uma lesão eo jogo necessário da região para-ser-IUE-manipulado com o teste comportamental apropriada depende da questão científica. Resolução de problemas Tamanho da ninhada reduzida Há várias sugestões sobre o aumento da sobrevivência dos filhotes IUE. Em primeiro lugar, a utilização de capilares de vidro muito finas durante a electroporação, a fim de minimizar o tecido Lesion é recomendada. Em segundo lugar, não electroporate o primeiro embrião no final vaginal de cada trompa do útero: a morte do primogênito embrião aumenta as chances de um aborto de todos os outros embriões. Em terceiro lugar, após o nascimento, ratas mães muitas vezes matar parte de sua descendência devido ao estresse perinatal. A fim de reduzir o estresse adicional, não comece com a imagem ao vivo logo após o nascimento, mas esperar por sete dias. Detecção de fluorescência da GFP-dos filhotes Em uma semana após o nascimento, nenhum sinal de fluorescência ou usando fluorescência binocular ao vivo imagens microscópicas ou imagens de fluorescência com o IVIS Spectrum (modos de epifluorescência e transfluorescence, pois GFP excitação / emissão: 465/520 nm e 500/540 nm). É possível que ambos, a transmissão limitada de curto comprimento de onda de excitação e emissão de luz através do tecido como o crânio e o fundo alto autofluorescência da pele prevenir utilizando fluorescência sob a desccondições ribed no rato. Como mostrado na Figura 6, o sinal de luciferase no animal vivo também pode ser detectada no cérebro dissecado (sem crânio) e há, também um sinal de fluorescência é detectável (Figura 6D). Diferenciação de bioluminescência em áreas do cérebro espaçados Mesmo na figura 3D a localização da área de bioluminescência não pode ser previsto a 100%. Especialmente as células sobre ou abaixo da área prevista também pode ser acidentalmente direccionada e transfectadas. A posição exacta tem de ser controlado por post-mortem (fluorescência) histologia (ver Figura 7).

O desenvolvimento da eletroporação in utero método (IUE), que permite a modulação da expressão gênica no cérebro em desenvolvimento, tem sido um break-through, uma vez que permitiu estudar neurodesenvolvimento com relativa facilidade. 1-7 Alterações nos níveis de um gene alvo na expressão uma região específica do cérebro durante o desenvolvimento embrionário e / ou perinatal em roedores foram demonstrados criticamente influência proliferação neuronal, migração, arborização e conectividade. 8-10 A esquizofrenia é uma doença mental complexa, com sintomas agudos e crônicos que tem sido relacionados com anormalidades do desenvolvimento neurológico 11, 12 e, portanto, muitos dos genes candidatos identificados para a esquizofrenia são investigados os efeitos potenciais sobre a modulação do neurodesenvolvimento, como por exemplo para a interrompeu-in-esquizofrenia -1 (Disc1) gene 13-15. O desenvolvimento do cérebro é regued por fatores genéticos e suas interações com o meio ambiente que desempenham papéis em, pré-períodos de desenvolvimento peri e pós-natal. Um importante factor de risco genético para várias desordens comportamentais é Disc1 os 16 genes. DISC1 knockdown leva a defeitos de migração em ratinhos 13, 17, e a manipulação de expressão Disc1 no córtex desenvolvimento por IUE foi mostrado para impactar o comportamento de ratinhos adultos 18. Manipulando a expressão genética do cérebro por IUE tem várias vantagens em relação à geração 19 de linhagens de animais transgênicos. Em primeiro lugar, a expressão de genes dentro das áreas de interesse é alcançado dentro de semanas ou meses, em vez de várias gerações de criação de linhas de roedores transgênicos. Em segundo lugar, os mecanismos compensatórios durante o desenvolvimento precoce, que pode protegê fenótipos em animais de engenharia de 20 germinativas são evitados. Em terceiro lugar, apenas por meio de direccionamento numa população de células específico ou área específica do cérebro, migratiem ou diferenças de proliferação pode ser comparado diretamente com o não-mutante ou controlar lado contralateral se electroporations unilaterais são escolhidos. Por outro lado, IUE não tem a precisão de cre / lox-sincronismo induzido accionado o promotor de expressão e apenas uma sub-população de células de uma determinada zona é orientada conduzindo a uma espécie de mosaico da expressão genética padrão. Para muitas aplicações experimentais em roedores adultos, a transfecção transiente de um número limitado de células, em uma região do cérebro, pode ser suficiente, ou mesmo desejado, de modo que a maior vantagem da estabilidade da linha germinativa, roedores transgénicos é negligenciável. Na verdade, IUE é útil para investigar se algumas células anormalmente desenvolvidos podem afectar toda uma rede de células ou circuitos. Outra vantagem pode ser a capacidade de demonstrar os efeitos das células-autônoma não de um gene, devido à natureza mosaico do hit. Além disso, a geração de ratos transgênicos e knockout ainda está em sua infância e do usode IUE nesta espécie para estudar as consequências do desenvolvimento do cérebro aberrantes é de alta de juros. Até o momento, o maior obstáculo de usar IUE para investigar as conseqüências de intervenção nos animais como adultos é a falta de sucesso de monitoramento eletroporação. Até agora, a GFP co-transfectadas neurónios fluorescentes nas crias de ratos recém-nascidos vivos não podiam ser detectadas com um microscópio de fluorescência binocular adequado ou com a imagem de fluorescência do IVIS Spectrum. Para superar este obstáculo, nós co-transfectadas de um gene repórter de luciferase e realizada bioluminescência imagens ao vivo de filhotes por três dimensões (3D) a quantificação da área do cérebro IUE. Como um exemplo para demonstrar a aplicabilidade deste método num ensaio funcional depois testando a manipulação genética do neurodesenvolvimento, uma co-injecção de plasmídeos contendo Disc1 humano, luciferase e GFP no ventrículo lateral de embriões de rato <sup&gt; 3 seguido por electroporação com um eléctrodo de pinça foi realizada. Embora os sinais de fluorescência não pôde ser detectado na fase pós-natal in vivo, um sinal de bioluminescência sólido derivado do metabolismo luciferina pelo gene da luciferase de co-transfectado foi detectado até cinco semanas após o nascimento. 3D-medidas da área do cérebro quantificação permitiu electroporados pelo qual foram identificados filhotes com eletroporação insuficiente ou equivocada desde o início, assim, permitindo a atribuição de animais IUE (gene de interesse e mexidos controle) para os grupos experimentais com áreas cerebrais eletroporados combinados de baixa variabilidade . A utilização de ratos adultos em IUE paradigmas comportamentais foi demonstrada como um exemplo da utilidade deste protocolo.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent name</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190-250</td>
			<td>without calcium, without magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin, sodium salt</td>
			<td>SynChem OHG, Germany</td>
			<td>BC218</td>
			<td>CAS number: 103404-75-7 substrate for firefly-luciferase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>F7258-25G</td>
			<td>CAS: 2353-45-9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Amphetamine</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>A 5880</td>
			<td>CAS: 51-63-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kodan Tinktur forte</td>
			<td>Sch&#252;lke &#38; Mayr GmbH, Germany</td>
			<td>104 005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Material / product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>Novato, California, USA</td>
			<td>borosilicate glass O.D.:1 mm, I.D.: 0.78 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Pipette Puller</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>Tujunga, California, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer electrode</td>
			<td>Nepa Gene CO., LTD.</td>
			<td>Shioyaki, Ichikawa, Chiba, Japan</td>
			<td>7 mm in diameter platinum disc electrodes (<a href="http://www.sonidel.com/product_info.php?products_id=129" target="_blank">CUY650P7</a>)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>Heidelberg, Germany</td>
			<td>Straight, 12 cm (14002-12)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>Heidelberg, Germany</td>
			<td>2.2 mm ID, 3 mm OD (11021-12)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square wave pulse electroporator (CUY21SC)</td>
			<td>Nepa Gene CO., LTD.</td>
			<td>Shioyaki, Ichikawa, Chiba, Japan</td>
			<td>(CUY21SC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicryl surgical suture material</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>Norderstedt, Germany</td>
			<td>3-0; 2 Ph. Eur;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound Clip Applicator</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>Heidelberg, Germany</td>
			<td>Reflex 9 mm (12032-09)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Darmstadt, Germany</td>
			<td>0.45 &#956;m cellulose acetate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Spectrum</td>
			<td>Caliper Life Science / PerkinElmer</td>
			<td>Waltham, MassachusettsUSA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XGI-8 Gas Anesthesia System</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>Waltham, Massachuset tsUSA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Open-field</td>
			<td>Coulbourn Instruments</td>
			<td>Allentown, USA</td>
			<td>(40 x 40 x 39 cm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tru Scan activity system</td>
			<td>Coulbourn Instruments</td>
			<td>Allentown, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			<table border="1">
				<tbody>
					<tr>
						<td colspan="4">Table of recipes</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Number</td>
						<td>Buffer name</td>
						<td>Content</td>
						<td>Comments </td>
					</tr>
					<tr>
						<td>1</td>
						<td>DNA-Mixture for DISC-1 overexpressing</td>
						<td>1.5 &#956;g/&#956;l pCAX humanDISC-1, 
						0.5 &#956;g/&#956;l pCAX-luciferase, 
						10x PBS (10%) Fast Green Dye (0.5%) add H2O</td>
						<td>100 &#956;l of the mixture are enough for ~5 IUE</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>2</td>
						<td>DNA-Mixure for control</td>
						<td>0,75 &#956;g/&#956;l control shRNA1, 0,75 &#956;g/&#956;l control shRNA2, 0.5 &#956;g/&#956;l pCAX-luciferase, 0.5 &#956;g/&#956;l pCAGGS-GFP 10x PBS (10%) Fast Green Dye (0.5%) add H2O</td>
						<td>100 &#956;l of the mixure are enough for ~5 IUE</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>3</td>
						<td>Fast green Dye</td>
						<td>10 mg/ml Fast Green FCF in ddH2O</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td>4</td>
						<td>D-luciferin solution</td>
						<td>15 mg/ml D-luciferin, sodium salt in PBS</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td>5</td>
						<td>Amphetamine solution</td>
						<td>0.5 mg/ml D-Amphetamine in PBS</td>
						<td></td>
					</tr>
				</tbody>
			</table>
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of topically transgenic rats by in utero electroporation and in vivo bioluminescence screening

No útero electroporação (IUE) é uma técnica que permite a modificação genética das células do cérebro para investigar o desenvolvimento neuronal. Até agora, o uso de IUE para investigar o comportamento ou neuropatologia no cérebro adulto tem sido limitada por métodos insuficientes para o controlo do sucesso da transfecção IUE por técnicas não invasivas em animais após o nascimento. Para o presente estudo, os ratos E16 foram utilizados para IUE. Após a injecção intraventricular de ácidos nucleicos para os embriões, o posicionamento dos eléctrodos de pinça é crítico para o direccionamento tanto do córtex ou do hipocampo em desenvolvimento. Ventricular co-injecção e de electroporação de um gene de luciferase permitiu a monitorização das células transfectadas postnatally após injecção intraperitoneal luciferina no cão anestesiado P7 vivo por in vivo a bioluminescência, utilizando um dispositivo de IVIS Espectro com software de quantificação 3D. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; definição de área de bioluminescência poderia diferenciar claramente entre electroporations corticais e do hipocampo e detectar um sinal longitudinalmente ao longo do tempo até 5 semanas após o nascimento. Esta técnica de imagem nos permitiu selecionar filhotes com um número suficiente de células transfectadas assumidos necessário para desencadear efeitos biológicos e, posteriormente, para realizar investigações comportamentais em três meses de idade. Como um exemplo, este estudo demonstra que IUE com o gene humano de comprimento completo Disc1 no córtex do rato levou à hipersensibilidade anfetamina. GFP cotransfectados pode ser detectado em neurônios por post mortem microscopia de fluorescência em criosecções indicando a expressão do gene presente em ≥ 6 meses após o nascimento. Conclui-se que a imagem de bioluminescência pós-natal permite avaliar o sucesso de transfections transitórios com IUE em ratos. As investigações sobre a influência de manipulações genéticas tópicos durante neurodevelopment no cérebro adulto e sua conectividade está muito facilitada. Para muitas questões científicas, esta técnica pode complementar ou mesmo substituir o uso de ratos transgênicos e fornecer uma nova tecnologia para a neurociência comportamental.

<html> A Figura 3 mostra viver medições de imagem de três filhotes de ratos em P7 após a injeção de 150 mg luciferina / kg de peso corporal. As diferenças de intensidade do sinal, indicando a variabilidade na eficiência da IUE são visíveis. Bioluminescência sinais fortes foram registados até P36 (Figura 4). Na Figura 5, a capacidade de definir cortical (Figuras 5A e 5C) e hipocampo (Figuras 5B e 5D), eletroporação de imagem de bioluminescência estão representados. A correlação entre o sinal de bioluminescência (Figura 7A), com o seu sinal de fluorescência após a remoção do crânio (Figura 7B) e as células electroporadas-GFP correspondentes no cérebro cryosectioned (Figura 8) ao P14 estão ilustrados nas Figuras 6-8. De nota, não houve detecção de um sinal de fluorescência em ratos vivos em qualquer ponto de tempo. tenda &quot;&gt; in vivo bioluminescência imagiologia permite discriminação aproximado de diferentes áreas do cérebro electroporadas por 2D (Figuras 5A e 5B), que é melhorada com o programa de software DLIT IVIS Espectro de gerar imagens 3D (Figuras 5C e 5D). Nos exemplos mostrados , electroporação do córtex pré-frontal e hipocampo podem ser distinguidos. Deve notar-se que, enquanto que aponta para electroporar o hipocampo, algumas células progenitoras para o córtex deitada dorsal do hipocampo pode também ser atingido (Figura 7). Rats unilateralmente no útero eletroporados com pCAX vetor para o córtex e, posteriormente, com superexpressão completo DISC1 humano comprimento foram investigados tanto espontânea e hiperatividade induzida por anfetamina como adultos. Rats eletroporados com pCAX-DISC1 foram hipersensíveis a uma dose baixa de anfetamina. Estes ratos movido significativamente more após o tratamento do que as anfetaminas após a injecção de soro fisiológico, enquanto os animais de controlo não o fez (Figura 10). <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig1.jpg" /> Figura 1. Esquema da posição do eletrodo para A) eletroporação e B córtex) eletroporação hipocampo; verde = DNA injetado-Mix dentro do ventrículo. <img alt="Figura 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig2.jpg" /> Figura 2. Reacção da luciferase. <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig3.jpg" /> Figura 3. A medição de luminescência do P7 ratos após injecção de 150 mg / kg de peso corporal luciferina; tempo de exposição de 180 seg; A) ratos com nenhum sinal de luminescência, B) de rato<html> com um sinal de bioluminescência fraca, C rato) com um sinal de luminescência forte. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig4.jpg" /> Figura 4. A linha do tempo da medição de bioluminescência consecutivas do mesmo rato após injecção de 150 mg / kg de luciferina demonstrando uma grande janela de tempo em que o sucesso IUE pode ser detectada. <img alt="Figura 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig5.jpg" /> . Figura 5 Ilustração de diferenças entre eletroporação cortical e hipocampal no P7 A) e B) as imagens 2D;. C) e D) as imagens em 3D; A) e C) do córtex; B) e D) do hipocampo.files/ftp_upload/50146/50146fig5highres.jpg &quot;&gt; Clique aqui para ver maior figura. <img alt="Figura 6" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig6.jpg" /> Figura 6. Ilustração de E16 eletroporação do hipocampo de um filhote de rato em P14 A) 2D imagem de bioluminescência B) ilustração 3D da bioluminescência sinal C) dissecado cérebro com sinal de bioluminescência D) cérebro com GFP sinal epi-fluorescência. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt="Figura 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig7.jpg" /> Figura 7. Detalhe de uma imagem de fluorescência de uma seção crio 20 mM do mesmo P14 cérebro de rato electroporados com GFP contendo plasmídeo e luciferasevetor, coloração núcleos com DAPI; CA1-3 = Cornu Ammonis 1-3; DG = giro denteado; FC = Fasciolarum cinereum. Video 1. Animação em 3D de um hipocampo electroporados rato em P14. <img alt="Figura 8" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig8.jpg" /> Figura 8. Esquema de ensaio anfetamina: a injeção de solução salina primeiro dia, antes de 15 min o julgamento, 24 horas mais tarde anfetamina injeção antes do teste na câmara de campo aberto. <img alt="Figura 9" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig9.jpg" /> Figura 9. Teste de anfetamina. Gráfico de barras mostrando distância percorrida (em cm) do animal gravado por um sistema TrueScan mais de 15 min barras brancas = grupo controle;. Barras cinza = grupo superexpressão DISC1; grupo controle n = 10; DISC1 grupo superexpressão n = 11; ANOVA: geno * Tratamento p = 0,043; T-Test para salina tempo total vs ns = não significativo anfetaminas Pcontrol = 0,172, pDISC1 = 0,001.

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Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Genes podem ser manipulados durante o desenvolvimento do córtex ou do hipocampo do rato via in utero eletroporação (IUE) em E16, para permitir modificações rápidas e direcionadas na conectividade neuronal para estudos posteriores do comportamento ou neuropatologia em animais adultos. Pós-natal em imagem in vivo para o controle do sucesso IUE é realizada por bioluminescência de ativar luciferase cotransfectados.

Geração de topicamente transgênicas Rats por<em&gt; In utero</em&gt; Eletroporação e<em&gt; In vivo</em&gt; Triagem Bioluminescência

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

generation-topically-transgenic-rats-utero-electroporation-vivo

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

13.4K visualizações.  Medical School Düsseldorf.  Genes podem ser manipulados durante o desenvolvimento do córtex ou do hipocampo do rato via in utero eletroporação (IUE) em E16, para permitir modificações rápidas e direcionadas na conectividade neuronal para estudos posteriores do comportamento ou neuropatologia em animais adultos. Pós-natal em imagem in vivo para o controle do sucesso IUE é realizada por bioluminescência de ativar luciferase cotransfectados. 

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In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

No útero Eletroporação seguido por Cultura Neuronal primário para estudar a função do gene no subconjunto dos neurônios corticais

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Neurociência

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Transfecção de células de camundongo por Ganglionares da Retina In vivo Eletroporação

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental pathways. Several powerful and well established transgenic technologies are available to manipulate gene expression levels in mouse, allowing for the generation of both loss- and gain-of-function models. However, the generation of mouse transgenics is both costly and time consuming. Alternative methods of gene manipulation have therefore been widely sought. In utero electroporation is a method of gene delivery into live mouse embryos1,2 that we have successfully adapted3,4. It is largely based on the success of in ovo electroporation technologies that are commonly used in chick5. Briefly, DNA is injected into the open ventricles of the developing brain and the application of an electrical current causes the formation of transient pores in cell membranes, allowing for the uptake of DNA into the cell. In our hands, embryos can be efficiently electroporated as early as embryonic day (E) 11.5, while the targeting of younger embryos would require an ultrasound-guided microinjection protocol, as previously described6. Conversely, E15.5 is the latest stage we can easily electroporate, due to the onset of parietal and frontal bone differentiation, which hampers microinjection into the brain. In contrast, the retina is accessible through the end of embryogenesis. Embryos can be collected at any time point throughout the embryonic or early postnatal period. Injection of a reporter construct facilitates the identification of transfected cells.
To date, in utero electroporation has been most widely used for the analysis of neocortical development1,2,3,4. More recent studies have targeted the embryonic retina7,8,9 and thalamus10,11,12. Here, we present a modified in utero electroporation protocol that can be easily adapted to target different domains of the embryonic CNS. We provide evidence that by using this technique, we can target the embryonic telencephalon, diencephalon and retina. Representative results are presented, first showing the use of this technique to introduce DNA expression constructs into the lateral ventricles, allowing us to monitor progenitor maturation, differentiation and migration in the embryonic telencephalon. We also show that this technique can be used to target DNA to the diencephalic territories surrounding the 3rd ventricle, allowing the migratory routes of differentiating neurons into diencephalic nuclei to be monitored. Finally, we show that the use of micromanipulators allows us to accurately introduce DNA constructs into small target areas, including the subretinal space, allowing us to analyse the effects of manipulating gene expression on retinal development.

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

In utero electroporation allows for rapid gene delivery in a spatially- and temporally-controlled manner in the developing central nervous system (CNS). Here we describe a highly adaptable in utero electroporation protocol that can be used to deliver expression constructs into multiple embryonic CNS domains, including the telencephalon, diencephalon and retina.

Entrega Gene eficiente em múltiplos territórios CNS Usando In Utero Eletroporação

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

Mouse No Utero Eletroporação: Transfecção Gênica Controlled Spatiotemporal

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Neuroimagem Funcional Usando rompimento da barreira hemato-encefálica ultra-sônico e Manganês-RM

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for tissue formation during embryonic development and tissue homeostasis during adulthood 1. Currently, great efforts are invested towards controlling the switch of somatic stem cells from expansion to differentiation because this is thought to be fundamental for developing novel strategies for regenerative medicine 1,2. However, a major challenge in the study and use of somatic stem cell is that their expansion has been proven very difficult to control.
Here we describe a system that allows the control of neural stem/progenitor cell (altogether referred to as NSC) expansion in the mouse embryonic cortex or the adult hippocampus by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, a major regulator of the G1 phase of the cell cycle and somatic stem cell differentiation 3,4. Specifically, two different approaches are described by which the cdk4/cyclinD1 complex is overexpressed in NSC in vivo. By the first approach, overexpression of the cell cycle regulators is obtained by injecting plasmids encoding for cdk4/cyclinD1 in the lumen of the mouse telencephalon followed by in utero electroporation to deliver them to NSC of the lateral cortex, thus, triggering episomal expression of the transgenes 5-8. By the second approach, highly concentrated HIV-derived viruses are stereotaxically injected in the dentate gyrus of the adult mouse hippocampus, thus, triggering constitutive expression of the cell cycle regulators after integration of the viral construct in the genome of infected cells 9. Both approaches, whose basic principles were already described by other video protocols 10-14, were here optimized to i) reduce tissue damage, ii) target wide portions of very specific brain regions, iii) obtain high numbers of manipulated cells within each region, and iv) trigger high expression levels of the transgenes within each cell. Transient overexpression of the transgenes using the two approaches is obtained by different means i.e. by natural dilution of the electroporated plasmids due to cell division or tamoxifen administration in Cre-expressing NSC infected with viruses carrying cdk4/cyclinD1 flanked by loxP sites, respectively 9,15.
These methods provide a very powerful platform to acutely and tissue-specifically manipulate the expression of any gene in the mouse brain. In particular, by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, our system allows the temporal control of NSC expansion and their switch to differentiation, thus, ultimately increasing the number of neurons generated in the mammalian brain. Our approach may be critically important for basic research and using somatic stem cells for therapy of the mammalian central nervous system while providing a better understanding of i) stem cell contribution to tissue formation during development, ii) tissue homeostasis during adulthood, iii) the role of adult neurogenesis in cognitive functions, and perhaps, iv) better using somatic stem cells in models of neurodegenerative diseases.

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Controlling the expansion of somatic stem cells is a major factor hampering their study and use in therapy. Here we describe a system to temporally control neural stem cells expansion during development and adulthood, which can be used to increase the number of neurons generated in the mouse brain.

Expansão da embrionárias e adultas células-tronco neurais por<em&gt; In Utero</em&gt; Eletroporação ou injeção estereotáxica Viral

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

Visualização e manipulação genética de dendritos e espinhas no córtex cerebral e hipocampo do rato usando<em&gt; In utero</em&gt; Eletroporação

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very powerful experimental approach. However, generating novel mouse mutants is often frustratingly slow. It has been shown that access to the mouse brain developing in utero with reasonable post-operatory survival is possible. Still, results with this procedure have been reported almost exclusively for the most superficial and easily accessible part of the developing brain, i.e. the cortex. The thalamus, a narrower and more medial region, has proven more difficult to target. Transfection into deeper nuclei, especially those of the hypothalamus, is perhaps the most challenging and therefore very few results have been reported. Here we demonstrate a procedure to target the entire hypothalamic neuroepithelium or part of it (hypothalamic regions) for transfection through electroporation. The keys to our approach are longer narcosis times, injection in the third ventricle, and appropriate kind and positioning of the electrodes. Additionally, we show results of targeting and subsequent histological analysis of the most recessed hypothalamic nucleus, the mammillary body.

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Despite the functional and medical importance of the hypothalamus, in utero genetic manipulation of its development has rarely been attempted. We show a detailed procedure for in utero electroporation into the mouse hypothalamus and show representative results of total and partial (regional) hypothalamic transfection.

Manipulação genética do rato em desenvolvimento Hipotálamo através<em&gt; In utero</em&gt; Eletroporação

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

Simultâneo<em&gt; Ex vivo</em&gt; Teste Funcional de Dois retinas por<em&gt; In vivo</em&gt; Sistema Eletrorretinograma

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils

To study the prion-like behavior of misfolded alpha-synuclein, mouse models are needed that allow fast and simple transmission of alpha-synuclein prionoids, which cause neuropathology within the central nervous system (CNS). Here we describe that intraglossal or intraperitoneal injection of alpha-synuclein fibrils into bigenic Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) mice, which overexpress human alpha-synuclein with the A53T mutation from the prion protein promoter and firefly luciferase from the promoter for glial fibrillary acidic protein (Gfap), is sufficient to induce neuropathologic disease. In comparison to homozygous Tg(M83+/+) mice that develop severe neurologic symptoms beginning at an age of 8 months, heterozygous Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) animals remain free of spontaneous disease until they reach an age of 22 months. Interestingly, injection of alpha-synuclein fibrils via the intraperitoneal route induced neurologic disease with paralysis in four of five Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) mice with a median incubation time of 229 &#177;17 days. Diseased animals showed severe deposits of phosphorylated alpha-synuclein in their brains and spinal cords. Accumulations of alpha-synuclein were sarkosyl-insoluble and colocalized with ubiquitin and p62, and were accompanied by an inflammatory response resulting in astrocytic gliosis and microgliosis. Surprisingly, inoculation of alpha-synuclein fibrils into the tongue was less effective in causing disease with only one of five injected animals showing alpha-synuclein pathology after 285 days. Our findings show that inoculation via the intraglossal route and more so via the intraperitoneal route is suitable to induce neurologic illness with relevant hallmarks of synucleinopathies in Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) mice. This provides a new model for studying prion-like pathogenesis induced by alpha-synuclein prionoids in greater detail.

Peripheral injection of alpha-synuclein fibrils into the peritoneum or tongue of Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) mice, which express human alpha-synuclein with the familial A53T mutation and firefly luciferase, can induce neuropathology, including neuroinflammation, in their central nervous system.