Método generalizado para determinar a composição livre de ácido fenólico solúvel e capacidade antioxidante de cereais e leguminosas. Grãos integrais, incluindo cereais e leguminosas, formam uma parte substancial das dietas humanas. Sua relevância nutricional para os seres humanos tem sido reconhecida há muito tempo.
No entanto, mais recentemente, seus benefícios antioxidantes para a saúde protetora foram relatados. Os ácidos fenólicos encontrados nas camadas externas de grãos de cereais e a camada de sementes de leguminosas contribuem para as propriedades antioxidantes dos grãos integrais. Eles escolúngem radicais livres que causam danos oxidativos às biomoléculas.
As duas classes de ácidos fenólicos encontrados em grãos integrais são ácidos hidroxibenómicos e ácidos hidroxicinâmicos. Este estudo fornece um método simples para extrair ácidos fenólicos de grãos integrais e determinar sua capacidade antioxidante in vitro. Use cinco amostras de grãos integrais para este estudo, trigo durum, milho amarelo, feijão-de-olho-preto, soja e feijão-rim vermelho.
Pesar com precisão 100 miligramas de farinha de grão inteira diretamente em um tubo de micro centrífuga de capacidade mililiter, de cor âmbar. A cor escura do tubo ajuda a evitar a exposição da mistura à luz. Adicione um mililitro de metanol aquoso de 80% aquoso a cada um dos tubos que contenham exemplos.
Vórtice brevemente para misturar a solução de metanol e a amostra. Sonicar as amostras por 60 minutos para extrair os compostos fenólicos solúveis livres. Coloque uma tampa sobre as amostras durante a sônica para obter proteção adicional contra a luz.
Após a sônicação, centrifufique as misturas a 20.000 vezes G durante cinco minutos para sedimentar os resíduos sólidos, deixando o sobrenatante em cima. Compostos fenólicos gratuitos estarão presentes no supernasce após centrifugação. O supernatante precisa ser filtrado antes de injetar no instrumento HPLC.
Para filtrar o supernaspe, remova o êmbolo de uma seringa de 3 mL e conecte um filtro de seringa. O filtro deve ter um tamanho de poros não maior que 0,22 micrômetros. Pipeta aproximadamente 0,4 mililitros do supernatante no topo da seringa.
Reinserir o êmbolo e empurrar o líquido através do filtro em um frasco HPLC contendo uma pastilha de frasco. Uma vez que o instrumento tenha sido configurado para executar o método descrito no manuscrito para análise hplc, carregue os frascos no carrossel para corresponder à lista de amostras. Obtenha cromatógramas HPLC a 320 nanômetros e 280 nanômetros, mostrando picos distintos representando diferentes compostos fenólicos.
Usando curvas padrão apropriadas, quantifique ácidos hidroxicinnômicos a 320 nanômetros, uma vez que eles têm uma absorvância máxima neste comprimento de onda. Pelo mesmo princípio, quantifique ácidos hidroxibenóicos a 280 nanômetros. Use Trolox, um análogo solúvel em água de vitamina E, como padrão para estimar a capacidade antioxidante in vitro de extratos inteiros de grãos.
Pesar com precisão um miligrama de Trolox em um tubo Falcon. Dissolva com quatro mililitros de metanol aquoso de 50% para preparar uma solução de estoque de um milimole por litro, que é o mesmo que 1000 micromole por litro. Prepare seis concentrações de Trolox que é de 50, 100, 200, 400, 600 e 800 micromole por litro para traçar curvas padrão para a estimativa da capacidade radical de limpeza do DPPH e da capacidade antioxidante equivalente ao Trolox, TEAC.
Da mesma forma, prepare 6,25, 12,5, 25 e 50 micromole por litro concentrações trolox para estimar a capacidade de absorção radical de oxigênio, ORAC. Compõem o volume total de cada concentração para 500 microliters, como mostrado na tabela um. Diluir os extratos amostrais com metanol antes da análise.
Aqui, os extratos de milho amarelo e ervilha foram diluídos duas vezes. Os extratos de trigo e feijão foram diluídos cinco vezes, enquanto o extrato de soja foi diluído 10 vezes com metanol. Pesar 8,23 miligramas de ABTS em uma capacidade limpa, dois mililitros, tubo de micro centrífuga âmbar.
Em seguida, pese 1,62 miligramas de persulfato de potássio em uma capacidade limpa de dois mililitros, tubo de micro centrífuga âmbar. Dissolva cada um dos produtos químicos pesados em um mililitro destilado água por vórtice. Isso resulta em uma solução ABTS milimililar e uma solução de persulfeto de potássio de seis milimólares.
Prepare a solução de estoque ABTS misturando as soluções de persulfeto de ABTS e potássio em volumes iguais. A solução mudará imediatamente para uma cor escura. Deixe essa mistura incubar na escuridão por 12 a 16 horas.
Diluir a solução de estoque ABTS 30 vezes com salina tamponada com fosfato de 200 milimilas para formar a solução de trabalho ABTS. Para isso, adicione 58 mililitros de 200 mililitros PBS a dois mililitros da solução de trabalho ABTS. A solução de trabalho conterá ABTS de 0,27 milimão e persulfeto de potássio milimão.
Para a análise, coloque 10 microlitadores de cada extrato diluído em uma microplacão de 96 poços. Adicione 190 microliters de solução de trabalho ABTS a cada poço e incubar por 60 minutos. Meça a absorvência das misturas de reação em 750 nanômetros em um leitor de microplaca.
Use os padrões Trolox em concentrações que variam de 100 a 800 micromole por litro para traçar uma curva de calibração. O ensaio antioxidante DPPH requer um composto gerador radical, DPPH. Pesar 1,2 miligramas de DPPH em um tubo vazio de centrífuga de capacidade de 15 mililitros.
Dissolva o DPPH em metanol para preparar uma solução de 60 micromolares. O ensaio DPPH testa a capacidade dos extratos amostrais de coletar radicais livres produzidos pela DPPH. Adicione cinco microliters de extrato de amostra nos poços de microplacão.
Em seguida, adicione 195 microliters de 60 micromolar solução methanolic DPPH e incubar por 60 minutos. Meça a absorvância em 515 nanômetros. Use os padrões Trolox para traçar uma curva de calibração.
A figura um mostra a estrutura dos ácidos hidroxibenóicos encontrados em grãos inteiros. Neste estudo atual, o ácido vanlícía foi o único ácido hidroxibenómico identificado. A figura dois mostra a estrutura dos ácidos hidroxicinamâmicos encontrados em grãos integrais.
No presente estudo, foram identificados ácidos p-coumarico, cafeic e ferúlico nas amostras. A tabela dois mostra os ácidos fenólicos identificados nas amostras. Como mencionado anteriormente, o ácido vanillico foi o único ácido hidroxibenómico identificado nas amostras.
Foi identificado apenas no extrato de ervilha. O ácido hidroxcinnâmico ácido cafeína foi identificado apenas em feijão renal, enquanto o ácido p-coumérico foi identificado em milho amarelo, vaquinha e soja. O ácido ferúlico foi identificado em todas as amostras e foi o ácido fenólico predominante nas amostras.
A concentração total dos ácidos fenólicos em ordem de maior para o mínimo foi na ordem soja, vaqueiro, milho amarelo e feijão-rim ou equivalente, seguido pelo trigo. A tabela três mostrou o teor fenólico total e a capacidade antioxidante das amostras. A capacidade antioxidante compreendeu a capacidade radical de limpeza do DPPH, TEAC, ORAC e capacidade antioxidante total das amostras.
A capacidade antioxidante total é a soma dos valores DPPH, TEAC e ORAC. Semelhante à tabela dois, a soja apresentou a maior capacidade antioxidante total. No entanto, em vez de ervilha, foi sim feijão-rim que tinha a segunda maior capacidade antioxidante total, embora a ervilha tivesse o segundo maior teor total de ácido fenólico.
Esta anomalia está relacionada com as estruturas dos ácidos fenólicos individuais e o possível efeito antagônico do ácido vanlícíaco ácido hidroxibenómico sobre os efeitos antioxidantes dos ácidos hidroxicinnômicos em cowpea. Este estudo concluiu que os grãos integrais diferem em suas composições de ácido fenólico. Entre os grãos integrais estudados, a soja possui a maior quantidade total de ácidos fenólicos e, correspondentemente, a maior capacidade antioxidante.
