Este protocolo descreve a preparação da amostra de RNA e a configuração de RMR para medições de dispersão de relaxamento de prótons R1rho para examinar a troca de confirmação em moléculas de RNA. Uma vez que os prótons são sondados, o método não precisa de rotulagem isotópica e pode acessar recursos estruturais como emparelhamento de base deslocado diretamente. A pipeta é bastante modular no sentido de que a dispersão de relaxamento R1rho pode ser medida mesmo que a amostra seja produzida com um método diferente.
Comece preparando a amostra plasmida e configurando uma transcrição in vitro e reação de decote, conforme descrito no manuscrito do texto. Incubar a reação a 37 graus Celsius por uma hora. Em seguida, dilua um microliter da amostra dez vezes na solução de carregamento.
E executar um microliter em um gel PAGE desnaturing. Se a reação do decote for bem sucedida, dimensione a reação ao volume desejado e execute-a durante a noite. Em seguida, execute outro gel PAGE desnaturação e avalie se a reação do decote foi concluída.
Em caso de decote incompleto, aqueça a solução de reação em um micro-ondas convencional a 450 watts por 15 segundos. Em seguida, esfrie a solução lentamente a 37 graus Celsius por 40 minutos para reanneal o RNA e o guia de decote. E note a formação de um novo precipitado.
Adicione mais pirofosfatase inorgânica e RNase H.Incubar a reação por uma a três horas a 37 graus Celsius. Em seguida, confirme a conclusão da reação do decote com a DEsnaturação PAGE. Quando a reação de decote RNase H estiver completa, sacie a reação adicionando EDTA a uma concentração final de 50 mililitros.
E vórtice completamente. Filtre a solução através de um filtro de seringa de 0,2 míingo. E concentrar a solução em um volume injetável em um sistema HPLC para purificação.
Antes de adicionar a amostra concentrada e purificada ao tubo NMR, limpe o tubo lavando com água abundante. Em seguida, rnase reagente descontaminação, água e 95% etanol. Depois da lavagem final com água, deixe-a secar.
Enxágüe o êmbolo com água e use um lenço sem fiapos para limpar com reagente de descontaminação RNase e 95% de etanol. Depois de secar o tubo e o êmbolo, adicione 10% D2O à amostra de RMN. Use uma grande ponta de pipeta para transferir a amostra de RNA para o tubo NMR, fluindo-a ao longo da lateral da parede do tubo.
Insira o êmbolo no tubo empurrando-o para baixo com um movimento de torção rápida para remover bolhas de ar, em seguida, puxe o êmbolo lentamente sem criar novas bolhas de ar. E conserte com filme de cera de parafina. Crie um novo conjunto de dados baseado em um conjunto de dados HSQC de carbono de próton aromático usado em amostras de RNA totalmente rotuladas para atribuição de RNA.
Defina os parâmetros gerais e parâmetros específicos do RD. Em seguida, defina a potência de bloqueio de giro de prótons para 1,2 kilohertz para testes. Gere uma lista vd de teste com apenas uma entrada, zero milissegundos, defina TDF1 para um e atualize o D30 para executar um espectro de teste.
Depois de configurar uma lista vd de teste, atualize D30 e TDF1. E plote a intensidade do pico para diferentes comprimentos de bloqueio de giro. Identifique o comprimento do bloqueio de rotação no qual a intensidade do pico original diminui para um terço.
A partir do resultado dos testes, crie a lista final de vds a ser usada no experimento. Selecione o número de varreduras para que o pico mais fraco da lista tenha uma relação sinal/ruído de pelo menos 10. Os resultados de várias reações de decote de transcrições tandem são mostrados aqui.
Um RNA de alvo de nucleotídeo de 20 nucleotídeos foi gerado em uma reação bem sucedida. Reações mal sucedidas resultaram em decote incompleto e falha da amostra. A injeção de HPLC da amostra de RNA revelou um pico para RNA de alvo puro em 38 minutos.
Enquanto produtos mais longos e mais curtos foram bem separados do pico de interesse. A análise do grampo de cabelo do RNA mostrou que o número de prótons imino observados correspondia ao número de prótons imino esperados a partir de uma simulação de estrutura secundária. O espectro de carbono de prótons HSQC das ressonâncias aromáticas do RNA mostrou quatro sinais após a dobra.
E apenas três sinais antes de dobrar. No representante em curvas de ressonância obtidas para dois átomos H8 diferentes e dois grampos sintéticos diferentes de RNA, o G6H8 experimenta troca de confirmação. Enquanto o A4H8 não.
Para g6H8, os poderes de bloqueio de giro colorido foram selecionados e os dados de ressonância foram registrados. Na construção CG onde a troca é lenta, os valores da linha R1rho versus o gráfico offset já apresentavam uma leve assimetria da curva, indicando o sinal da diferença de mudança química delta ômega. Isso se torna ainda mais evidente no gráfico R2 plus REX onde a contribuição R1 é removida.
Por outro lado, a construção do GC experimenta troca mais rápida e os valores R1rho versus parcela offset apresentaram uma curva mais ampla onde a extração de delta ômega torna-se menos óbvia mesmo na trama R2 plus REX. Uma vez que a dinâmica do RNA tenha sido elucidada, os estados podem ser caracterizados e presos. Esses estados presos podem, por exemplo, ser testados em ensaios biológicos.
Este método nos permite observar mudanças de pareamento de base funcionais e relevantes em um complexo ativo de microRNA miRNA, rearranjos de loop no RNA ribossômico e estabilidade do par base de protuberâncias de nucleotídeos únicos.
