O objetivo geral do artigo do método seguinte é demonstrar um protocolo útil para estudar interações de RNA com proteínas ou outros fatores usando pinças ópticas aliadas à microscopia confocal. Na última década, várias técnicas sofisticadas foram desenvolvidas para investigar as propriedades de macromoléculas únicas. Uma dessas técnicas é uma pinça óptica de molécula única.
Com a nova pinça óptica assistida pela fluorescência, não apenas as forças necessárias para o desdobramento de moléculas de RNA, bem como eventos de ligação durante a tradução podem ser monitoradas detalhadamente. Aqui focamos em medidas nas quais as moléculas de RNA são esticadas com e sem fatores de transação que regulam a tradução. Também ilustramos como a técnica pode ser aplicada para monitorar a tradução usando ribossomos rotulados.
O protocolo será demonstrado por dois estudantes de pós-graduação do meu grupo, Lukas Pekarek e Stefan Park. Neste vídeo, vamos guiá-lo através da configuração e execução de um experimento de pinça óptica. Também descrevemos o simples fluxo de trabalho de análise de dados.
A vantagem dessa técnica é que ela é simples e robusta. Uma molécula é amarrada entre duas contas, amarradas no foco de raios laser, e a mudança e a força no deslocamento podem ser precisamente medidas nos chamados experimentos de rampa de força. Estruturas secundárias dentro de uma corda se desdobram em uma certa força dependendo da energia interna da molécula.
Essa transição dinâmica entre múltiplas estruturas pode ser investigada com medições constantes de força. Além disso, o uso paralelo de imagens fluorescentes pode ser usado para visualizar eventos de ligação em tempo real. Um perfil de distância de força distinto de uma corda pode variar após a vinculação de potenciais fatores de transação que influenciam sua estabilidade.
Primeiro, o RNA de interesse tem que ser clonado em um vetor de DNA. Rio acima e rio abaixo desta sequência, partes adicionais, as alças são necessárias para amarrar a construção final dna-RNA entre as contas. Após a clonagem e amplificação bem sucedidas do plasmídeo, três reações diferentes de PCR são realizadas.
Para cada reação pcr, misture os reagentes de acordo com a tabela um no protocolo. Execute o PCR em 50 alíquotas de microliter em um cicloviário térmico apropriado. O primeiro resulta em um DNA duplo encalhado de toda a construção com o promotor T7 para transcrição in vitro subsequente.
O segundo PCR produz as cinco alças principais. Considerando que a última reação resulta nas três alças principais. Ambas as alças prime e 3 prime precisam ser rotuladas de acordo com as contas usadas.
As três alças principais são rotuladas durante o PCR usando um primer reverso rotulado de digoxigenina, e as cinco alças principais devem ser rotuladas em um passo extra através da biotiningação. A biotintilação principal das cinco alças principais é realizada usando T 40 e uma polimerase. A reação é realizada por uma a duas horas em temperatura ambiente.
Em seguida, realize a transcrição in vitro usando polimerase T7. Incubar a reação em 37 graus por duas a quatro horas, dependendo da duração do RNA. Em um último passo, as alças são resmuídas com o RNA da transcrição in vitro para obter a construção final dna-RNA com a única região encalhada de interesse entre as alças duplas encalhadas.
Para ressar o híbrido RNA-DNA desejado, misture as alças e o RNA no buffer de ressarcimento. Aqueça, a mistura de ressarcimento até 85 graus por 10 minutos e, em seguida, esfrie lentamente a amostra até quatro graus. Misture a amostra resfriada com 1/10 de volume de três acetato de sódio molar, e três volumes de etanol gelado e incubar menos 80 graus por pelo menos uma hora.
Centrifugar as amostras a 15.000 xg por 30 minutos a quatro graus. Descarte o supernatante e seque a pelota sob o vácuo. Pequenas alíquotas da pelota resuspended são congeladas em nitrogênio líquido e mantidas a menos 80 graus até serem usadas.
Primeiro remova o alvejante das seringas e preencha um mL de água livre de RNase. Adicione 50 microliteres de 0,5 molar de sódio tiossulfato e lave o sistema com uma barra. Tenha cuidado para que o sistema microfluido nunca seque para evitar bolhas de ar no sistema.
Em seguida, descarte a solução de tiossulfato de sódio restante e substitua as seringas por novas. Em seguida, lave novamente com pelo menos 0,5 mL de água livre RNase. Para configurar o sistema óptico da máquina, coloque duas gotas de óleo de imersão no objetivo.
Coloque a célula de fluxo no lugar e levante o objetivo até que o líquido toque a célula de fluxo. Em seguida, coloque duas gotas de óleo de imersão em cima da célula de fluxo. Agora ligue a unidade de direção da armadilha e o laser de armadilhas.
O objetivo é ajustado utilizando a ferramenta Z finder das câmeras de diagnóstico da máquina. Ao girar o micro parafuso, o eixo Z é ajustado para o meio da câmara entre a segunda e a terceira reflexão. Onde os anéis de refração são os maiores.
Mude as câmeras de diagnóstico para o modo lunar e reduza o laser de trapping para cerca de 50% Em seguida, baixe o condensador e ajuste sua posição para que você veja aproximadamente 10 faixas de luz. A câmara de medição tem cinco canais e, antes do experimento, diferentes possibilidades de configuração devem ser consideradas. Para um simples experimento de rampa de força, contas-tampão-contas é um arranjo de canal conveniente.
Para medidas com o quarto composto, como ribossomos fluorescentes ou fatores de transação, o fator tampão de contas é um arranjo melhor, mas torna mais difícil capturar contas. Uma alíquota da construção enaltada é incubada com três suspensão de contas de DC microliter, um microliter RNase inibidores e oito microliteres do tampão de ensaio em temperatura ambiente por 10 a 20 minutos. Em seguida, a amostra é diluída em 500 tampão de ensaio microliter e colocada no respectivo canal.
Para o segundo tipo de contas, 0,8 microliter de contas de ensaio são misturados com um mL de tampão de ensaio e administrados no canal correspondente. Os canais são abertos e lavados com baixa pressão. Agora ligue o laser de armadilhas.
Para pegar contas, os lasers são movidos separados um do outro e uma conta da AD é presa na armadilha um. Em seguida, o estágio é movido para o canal de contas SA e uma conta é presa na armadilha dois. Para evitar perder as contas, ou pegar uma segunda na mesma armadilha, o palco é movido para o canal tampão e todos os canais estão fechados.
No buffer, é realizada uma calibração de armadilha. As contas capturadas devem ser definidas como modelos visuais para medições subsequentes. E o escore de semelhança deve ser mantido acima de 90% entre as medidas para garantir a comparabilidade.
Finalmente, as contas são movidas mais perto e pode-se começar a pegar uma única corda. Isso é feito movendo as contas para perto por alguns segundos e, em seguida, lentamente sair as contas novamente. Uma formação de corda resulta em um aumento de força medida ao puxar as duas contas para longe uma da outra.
O número e a qualidade das amarras podem ser verificados encontrando o planalto de alongamento excessivo e comparando a trajetória com a cadeia livremente articulada ou modelo de cadeia semelhante a vermes. O planalto de alongamento deve ser entre 50 a 60 piconewton para uma única corda. Para realizar as medições de fluorescência, ligue os lasers confocal e a contagem de fótons na máquina de pinças unitárias e ópticas.
Depois, ligue o laser de excitação do comprimento de onda desejado e a interface de software e defina a potência do laser para 5% ou mais, dependendo do fluorforeiro. Agora, a imagem pode ser iniciada usando as funções de imagem ou kymograph do software. Para obter imagens bem focadas, certifique-se de que o plano focal do microscópio confocal e das armadilhas ópticas estejam alinhados.
Para isso, pode-se empregar a autofluorescência das contas de poliestireno no canal laser azul. Mova-se para cima e para baixo com o plano focal das armadilhas ópticas até que a autofluorescência das contas atinja seu diâmetro mais alto. Nesta posição, os sinais de fluorescência que ocorrem na molécula amarrada podem ser detectados.
Para ambas as funções é importante selecionar as regiões de interesse apropriadas. Ao longo da composição do buffer de medição pode ser facilmente alterada movendo as contas para diferentes canais, ou alterando o buffer fornecido no sistema microfluido. Para evitar fotobleaching, desligue sempre o laser de excitação quando não estiver medindo.
A saída de dados brutos do dispositivo muitas vezes contém muito ruído. Portanto, para analisar melhor os dados dispersos, é preciso primeiro pré-processá-los. O primeiro passo é baixar a amostra e filtrar os dados com o filtro Butterworth de baixa passagem, foram obtidos bons resultados.
Para experimentos de rampa de força, os eventos desdobrados devem ser marcados nas regiões dobradas e desdobradas correspondentes da primeira curva de distância podem ser montados usando cadeia semelhante a vermes ou modelos de cadeia livremente articulados. Para os dados de força constante, a distância ao longo do tempo pode ser plotada e é útil para gerar um histograma para quantificar a conformação predominante em uma determinada força. Aqui é mostrado que os parâmetros do filtro são cruciais para distinguir diferentes estados dobráveis.
Para entender melhor o que pode ser alcançado com essa técnica, alguns resultados representativos são mostrados. É assim que uma curva padrão de distância de força de um experimento de rampa de força se parece. Neste caso, estudamos o elemento de mudança de quadro SARS-coronavirus-2.
Observamos desdobramentos em vários degraus em torno de 15 piconewton. Quando a direção é invertida e as contas estão se aproximando novamente, a corda se reabastece de volta com uma força ligeiramente menor. Quando medimos o mesmo RNA na presença da proteína antiviral de dedo de zinco ZAP, observou-se um padrão semelhante de desdobramento.
Mas a estrutura secundária do RNA não se redobrava. Este é um bom exemplo para mostrar que grande influência a ligação proteica pode ter na cinética rna. Olhando para dados de força constante, a cinética desdobrante pode ser investigada.
A distância ao longo do tempo é traçada para diferentes forças e o histograma dos diferentes estados observados é adicionado à direita. Às 10 piconewton, o RNA está completamente no estado dobrado. Às 11:5 piconewton ele alterna entre estados, e aos 13 piconewton o RNA está permanentemente em um estado desdobrado.
No entanto, quando o elemento de mudança de quadro SARS-coronavirus-2 foi medido juntamente com zap, o RNA estava completamente em um estado desdobrado em 11 piconewton, e até mesmo mostrou muito pouca transição para um estado dobrado em 10 piconewton. Isso indica que o ZAP se liga ao elemento de mudança de quadro único e impede a formação de uma estrutura secundária. Finalmente, vamos olhar para alguns dados ópticos de pinças juntamente com microscopia confocal.
Neste experimento, utilizou-se um corante fluorescente que rotula ácidos nucleicos duplos encalhados, não especificamente com força crescente. O kymograph mostra que à medida que as contas são separadas umas das outras, a intensidade da fluorescência aumenta e desaparece completamente quando a corda é esticada demais e quebra. Na última figura, ribossomos fluorescentes foram adicionados através do canal quatro.
Neste experimento foi observada a ligação ribossa específica à corda de RNA. Esperamos que este vídeo tenha lhe dado uma visão sobre pinças ópticas e o que pode ser realizado nesta técnica incrível.
