Este protocolo propõe um método simples para a obtenção de progenitores hematopoiéticos humanos, e para induzir sua diferenciação em megacaiócitos. Pode servir de base para uma melhor compreensão da megacariopoiese Esta técnica utiliza uma fonte, mas oferece a vantagem de ser acessível e abundante para pesquisa laboratorial em hematopoiesis. Este método é usado para entender melhor a megacariopoiese para que a célula seja usada na terapia eles precisarão ser preparados nas condições de GMP, o que atualmente não é o caso.
Entender as etapas, incluindo a coleção PBMC, só pode ser totalmente completa com uma demonstração visual. Antes de iniciar um experimento, conecte um filtro de leucoredução a uma bolsa de transferência vazia de 600 mililitros e a um conjunto de tubos. Em um armário de bio segurança, injete 25 mililitros de tampão de eluição filtrada por filtro de leucoredução no saco vazio e use uma seringa de 30 mililitros para aspirar suavemente o conteúdo da bolsa através do filtro.
Transfira os glóbulos vermelhos coletados para um novo tubo de 50 mililitros e dilua a suspensão celular pela metade com 2% dextran. Misture bem para agregar as células sanguíneas e permitir que as células sedimentem por 30 minutos à temperatura ambiente. Quando os glóbulos vermelhos se instalarem, transfira o supernascimento para um tubo de 50 mililitros e encha o tubo com duas soluçãos milimólares de PBS EDTA.
Sobreponha suavemente metade do supernatante em 25 mililitros de gradiente de densidade em cada um dos dois tubos de 50 mililitros sem perturbar a superfície gradiente e separe as células por centrifugação gradiente de densidade. Use uma pipeta descartável para transferir as células de cada interface para um novo tubo de 50 mililitros. Lave as células duas vezes em 50 mililitros de dois milimões PBS EDTA por lavagem.
Após a segunda lavagem, resuspenja as pelotas em um único volume de 50 mililitros de PBS EDTA fresco para contar. Aqui é possível parar o procedimento mantendo as células coletadas sob agitação a quatro graus Celsius durante a noite. Para seleção de células CD34+, determine o número celular e colete as células por centrifugação e resuspenja a pelota celular em 300 microliters de dois milimões PBS EDTA por 10 a oitava células.
Adicione o volume apropriado de reagente de bloqueio do receptor FC e 50 microlitres de micro-contas CD34 por 10 para as oitavas células. Depois de 30 minutos a quatro graus Celsius, lave as células com dois milimões PBS EDTA, e resuspense a pelota em 500 microliters de dois mililitros frescos PBS EDTA, por 10 a oito células. Umidificar e dimensionar adequadamente a coluna magnética com PBS EDTA e, em seguida, adicione a amostra à coluna.
Lave a coluna duas vezes com três mililitros de dois mililitros PBS EDTA por lavagem. Antes de iludir as células CD34+, com dois volumes de cinco mililitros de dois MILililares PBS EDTA por eluição. Para avaliar a pureza das células selecionadas do contas magnéticas, adicione dois microliters de um anticorpo anti CD34 humano apropriado a uma alíquota de 100 microliteres das células isoladas e misture bem antes de incubar por 15 minutos a quatro graus celsius.
Após a incubação, lave as células em PBS e resuspenja a pelota em 200 microlitres de PBS para análise da pureza da amostra celular por citometria de fluxo. Após a contagem, colete as células CD34+por centrifugação e resuspense imediatamente a pelota em solução fria uma a uma densidade de 10 a seis células por mililitro antes de adicionar rapidamente a suspensão celular à solução fria dois. Em seguida, coloque imediatamente o tubo criogênico em um congelador de menos 80 graus Celsius por 24 horas antes de transferir o tubo criogênico para armazenamento líquido de nitrogênio.
Neste estudo representativo, as células foram recuperadas por filtragem de leucoredução, como demonstrado com uma viabilidade aproximada de 95%. Após a seleção de contas magnéticas, obteve-se uma população de células CD34+cd34+mais de 90%pura. A proliferação celular normalmente diminui após uma semana de cultura, mas sem mudanças significativas na viabilidade celular.
Até o sétimo dia, as células CD34+devem começar a expressar CD41, um marcador específico e precoce ou para desenvolvimento de megacaióte e plaquetas. No dia 10, a maioria das células da cultura normalmente se desenvolvem em CD41 maduro expressando megacaiócitos. Até o dia 13, a extensão de plaqueta pro megacaito e a liberação de plaquetas podem ser observadas por microscopia leve.
O número total de CD41, CD42, 8 plaquetas positivas lançadas na cultura pode então ser quantificado usando um número calibrado de contas fluorescentes. Este método abre caminho para melhorar os mecanismos subjacentes da megacaripoiese e para o aumento dos rendimentos das plaquetas no visual. Mesmo que este método pareça tedioso, é muito simples você só precisa ser paciente e preparar todas as regiões com antecedência.
Embora nossas preocupações críticas megacaripoiesis obtenham células CD42 podem ser usadas em vias hematopoiéticas.
