このプロトコルは、ヒト造血原生を得るための簡単な方法を提案し、その分化を巨核球に誘導する。これは、巨核代の理解の基礎として役立つことができます この技術は、ソースを使用します, しかし、造陽症の実験室の研究のための手頃な価格と豊富であることの利点を提供しています.この方法は、GMP条件で調製する必要がある治療に使用される細胞の巨核生物の理解を深めるために使用されます。
PBMC コレクションを含む手順を理解することは、視覚的なデモンストレーションでのみ完全に完了できます。実験を開始する前に、白金除去フィルターを空の600ミリリットルの転写バッグとチューブセットに接続します。バイオセーフティキャビネットでは、白眼剤フィルターごとに25ミリリットルのろ過溶出バッファーを空の袋に注入し、30ミリリットルのシリンジを使用してフィルターを通して袋の内容物を穏やかに吸引します。
採取した赤血球を新しい50ミリリットルチューブに移し、細胞懸濁液を2%デキストランで半分に希釈する。血液細胞を凝集し、細胞が室温で30分間沈み込むことを可能にするためによく混ぜる。赤血球が落ち着いたら、上清を50ミリリットルチューブに移し、2ミリモルPBS EDTA溶液でチューブを充填します。
上清の半分を2本の50ミリリットルチューブのそれぞれで25ミリリットルの密度勾配媒体に優しく重ね、密度勾配遠心分離によって細胞を分離します。使い捨てのピペットを使用して、各界面から新しい50ミリリットルのチューブに細胞を移します。1回の洗浄につき2ミリモルPBS EDTAの50ミリリットルで細胞を2回洗浄します。
2回目の洗浄後、ペレットを新鮮なPBS EDTAの1つの50ミリリットル量で再懸濁してカウントする。ここでは、夜間に摂氏4度で集めた細胞を撹拌下に維持することによって、手順を停止することができる。CD34+細胞選択の場合、細胞数を決定し、遠心分離によって細胞を収集し、8番目の細胞に10個あたり2ミリモルPBS EDTAの300マイクロリットルで細胞ペレットを再懸濁します。
8番目の細胞にFC受容体遮断試薬の適切な量とCD34マイクロビーズの50マイクロリットルを追加します。摂氏4度で30分後、2ミリモルPBS EDTAで細胞を洗浄し、ペレットを新鮮な2ミリモルPBS EDTAの500マイクロリットルで再懸濁し、10個あたり8細胞にします。PBS EDTAで磁性柱を適切にサイズ調整し、そのサンプルをカラムに加えます。
1回の洗浄につき2ミリモルPBS EDTAの3ミリリットルでカラムを2回洗浄します。CD34+細胞を排除する前に、溶出あたり2ミリモルPBS EDTAの2つの5ミリリットルの体積を有する。選択した磁気ビーズの純度を評価するには、適切なヒト抗CD34抗体の2マイクロリットルを単離した細胞の100マイクロリットルのアリコートに加え、摂氏4度で15分間インキュベートする前によく混ぜ合わせます。
インキュベーション後、細胞をPBSで洗浄し、200マイクロリットルのPBSでペレットを再懸濁し、フローサイトメトリーによる細胞試料の純度を分析します。カウント後、遠心分離によってCD34+細胞を収集し、すぐに冷たい溶液1のペレットを1ミリリットル当たり6個の細胞に10の密度に再懸濁してから、細胞懸濁液を冷溶液2に素早く加えます。その後、すぐに液体窒素貯蔵にクライオチューブを転送する前に、マイナス80°Cの冷凍庫に24時間凍結管を置きます。
本代表的な研究では、およそ95%の生存率を示した白血病の濾過により細胞を回収した。磁気ビーズ選択後、90%以上の純CD34+細胞集団が得られた。細胞増殖は典型的には1週間培養した後に減少するが、細胞の生存率に有意な変化はない。
7日目までに、CD34+細胞はCD41、特定の早期マーカー、または巨核球および血小板の発達のために発現し始めるはずです。10日目までに、培養中の大部分の細胞は、典型的には、巨核球を発現する成熟したCD41に発展する。13日目までに、巨核球プロ血小板延長および血小板放出は、光顕微鏡で観察することができる。
培養液中に放出されるCD41、CD42、8陽性血小板の総数は、その後、較正された数の蛍光ビーズを用いて定量することができる。この方法は、巨核代行の基礎となるメカニズムを強化し、視覚における血小板の収率を増加させるための道を開きます。この方法は退屈に思える場合でも、あなたは忍耐強く、事前にすべての領域を準備する必要がある非常に簡単です。
我々の重要な懸念は巨核球症であるが、我々はCD42細胞を得る造血経路上で使用することができる。
