이 프로토콜은 인간 조혈 선조를 얻고, 메가 카요세포로 그들의 분화를 유도하기위한 간단한 방법을 제안한다. 그것은 메가 karyopoiesis의 더 나은 이해를 위한 기초역할을 할 수 있습니다이 기술은 소스를 사용 하지만 조혈에 실험실 연구에 대 한 저렴 하 고 풍부한의 장점을 제공 합니다. 이 방법은 현재 그렇지 않은 GMP 조건에서 준비되어야 할 치료법에 사용되는 세포에 대한 메가 카요포에이스(megakaryopoiesis)를 더 잘 이해하는 데 사용됩니다.
PBMC 컬렉션을 포함한 단계를 이해하는 것은 시각적 데모를 통해서만 완전히 완료될 수 있습니다. 실험을 시작하기 전에, 빈 600 밀리리터 전송 가방에 백과 튜브 세트에 백류 감소 필터를 연결합니다. 바이오 안전 캐비닛에서 루코환원 필터당 25밀리리터의 여과된 용출 버퍼를 빈 백에 주입하고, 30 밀리리터 주사기를 사용하여 필터를 통해 가방 내용을 부드럽게 흡인시합니다.
수집된 적혈구를 새로운 50 밀리리터 튜브로 옮기고, 세포 현탁액을 2%dextran으로 반으로 희석시. 잘 섞어서 혈액 세포를 집계하고 실온에서 30 분 동안 세포가 퇴적할 수 있도록합니다. 적혈구가 50 밀리리터 튜브로 상체를 이송하고 2개의 밀리머 PBS EDTA 용액으로 튜브를 채웁니다.
상피체의 절반을 25밀리리터의 밀도 그라데이션 배지에 부드럽게 오버레이하여 그라데이션 표면을 방해하지 않고 밀도 그라데이션 원심분리에 의해 세포를 분리합니다. 일회용 파이펫을 사용하여 각 인터페이스에서 새로운 50 밀리리터 튜브로 셀을 전송합니다. 세척당 2밀리머 PBS EDTA의 50 밀리리터에서 세포를 두 번 세척하십시오.
두 번째 세척 후, 계산에 대한 신선한 PBS EDTA의 단일 50 밀리리터 볼륨에 펠릿을 다시 중단. 여기서는 야간 동안 섭씨 4도에서 교반하에서 수집된 세포를 유지함으로써 절차를 중지할 수 있다. CD34+셀 선택을 위해, 세포 수를 결정하고 10개 세포에서 8세포에 10당 2밀리머 PBS EDTA의 300마이크로리터에서 세포 펠릿을 회수한다.
FC 수용체 차단 시약의 적절한 부피와 CD34 마이크로비드 50마이크로리터를 10개당 8번째 세포에 첨가한다. 섭씨 4도에서 30분 후, 2개의 밀리머 PBS EDTA로 세포를 씻고, 10개 세포에서 10개세포당 신선한 2밀리머 PBS EDTA의 500마이크로리터에서 펠릿을 재보습한다. PBS EDTA를 사용하여 자기 컬럼의 가습및 크기를 적절히 조정한 다음 컬럼에 샘플을 추가합니다.
세탁당 2밀리미터 PBS EDTA의 3밀리리터로 컬럼을 두 번 세척합니다. CD34+셀을 제외하기 전에 용출당 2밀리미터 PBS EDTA의 5밀리리터 볼륨이 있습니다. 마그네틱 비드 선택 된 세포의 순도를 평가하기 위해, 적절한 인간 항체의 2 개의 마이크로 리터를 분리 된 세포의 100 마이크로 리터 알리쿼트에 추가하고 섭씨 4도에서 15 분 동안 배양하기 전에 잘 섞는다.
인큐베이션에 이어, PBS에서 세포를 세척하고 혈동 세포측정에 의한 세포 시료의 순도 분석을 위해 PBS의 200 마이크로리터에서 펠릿을 재중단한다. 계산 후, 원심분리에 의해 CD34+세포를 수집하고 즉시 차가운 용액에서 펠릿을 10의 밀도로 재차리밀리리터당 6개의 세포로 재차 후 2개의 콜드 액스탈에 세포 현탁액을 신속하게 추가한다. 그런 다음 냉동고 튜브를 영하 80도 냉동고에 24시간 동안 즉시 놓은 후 냉동고 튜브를 액체 질소 저장장치로 옮춥시다.
이 대표적인 연구에서, 세포는 대략 95%의 생존력으로 입증된 바와 같이 백혈구 감소 여과에 의해 회복되었다. 자기 비드 선택 후, 90% 이상의 순수 CD34+세포 집단이 얻어졌다. 세포 증식은 전형적으로 배양의 1 주일 후에 감소합니다, 그러나 세포 생존성에 있는 중요한 변경없이.
7일째까지 CD34+세포는 CD41, 특이적이고 초기 마커 또는 메가카요시테 및 혈소판 개발을 발현하기 시작해야 한다. 10일째에, 배양에 있는 세포의 대다수는 일반적으로 메가karyocytes를 표현하는 성숙한 CD41로 발전합니다. 13일까지, 메가카요세포 프로 혈소판 연장 및 혈소판 방출은 빛 현미경검사법에 의해 관찰될 수 있다.
배양에 방출된 CD41, CD42, 8개의 양성 혈소판의 총 수는 형광구의 보정된 수를 사용하여 정량화될 수 있다. 이 방법은 메가카요포에이스의 기본 메커니즘을 강화하고 시각적으로 혈소판 수율을 증가하기위한 길을 열어줍니다. 이 방법이 지루한 것처럼 보이지만 인내심을 가지고 모든 지역을 미리 준비해야합니다.
우리의 중요한 관심사 메가 karyopoiesis 비록 우리는 CD42 세포를 얻는 것은 조혈 통로 를 통해 이용될 수 있습니다.
