Ce protocole propose une méthode simple pour obtenir des progéniteurs hématopoïétiques humains, et pour induire leur différenciation en mégacaryocytes. Elle peut servir de base à une meilleure compréhension de la mégacarylopoïèse Cette technique utilise une source, mais offre l’avantage d’être abordable et abondante pour la recherche en laboratoire sur l’hématopoïèse. Cette méthode est utilisée pour mieux comprendre la mégacaryopoïèse pour la cellule à utiliser dans la thérapie, ils devront être préparés dans les conditions GMP, ce qui n’est pas le cas actuellement.
Comprendre les étapes, y compris la collection PBMC, ne peut être complet qu’avec une démonstration visuelle. Avant de commencer une expérience, connectez un filtre de leucoréduction à un sac de transfert vide de 600 millilitres et à un ensemble de tubes. Dans une armoire de biosécurité, injectez 25 millilitres de tampon d’élution filtré par filtre de leucoréduction dans le sac vide et utilisez une seringue de 30 millilitres pour aspirer doucement le contenu du sac à travers le filtre.
Transférer les globules rouges prélevés dans un nouveau tube de 50 millilitres et diluer la suspension cellulaire de moitié avec 2% de dextran. Bien mélanger pour agréger les cellules sanguines et laisser les cellules sédimenter pendant 30 minutes à température ambiante. Lorsque les globules rouges se sont déposés, transférez le surnageant dans un tube de 50 millilitres et remplissez le tube avec une solution d’EDTA PBS de deux millimolaires.
Superposer doucement la moitié du surnageant sur 25 millilitres de milieu de gradient de densité dans chacun des deux tubes de 50 millilitres sans perturber la surface du gradient et séparer les cellules par centrifugation de gradient de densité. Utilisez une pipette jetable pour transférer les cellules de chaque interface vers un nouveau tube de 50 millilitres. Lavez les cellules deux fois dans 50 millilitres de deux millimolaires PBS EDTA par lavage.
Après le deuxième lavage, ressuspendez les granulés dans un seul volume de 50 millilitres de PBS EDTA frais pour le comptage. Ici, il est possible d’arrêter la procédure en maintenant les cellules collectées sous agitation à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Pour la sélection des cellules CD34+, déterminez le nombre de cellules et collectez les cellules par centrifugation et ressuspendez la pastille cellulaire dans 300 microlitres de deux millimolaires PBS EDTA par 10 à la huitième cellule.
Ajouter le volume approprié de réactif bloquant les récepteurs FC et 50 microlitres de microbilles CD34 par 10 aux huitièmes cellules. Après 30 minutes à quatre degrés Celsius, lavez les cellules avec deux millimolaires PBS EDTA, et resuspendez la pastille dans 500 microlitres de PBS EDTA frais de deux millimolaires, pour 10 aux huit cellules. Humidifiez et dimensionnez correctement la colonne magnétique avec PBS EDTA, puis ajoutez l’échantillon à la colonne.
Lavez la colonne deux fois avec trois millilitres de deux millimolaires PBS EDTA par lavage. Avant d’échapper aux cellules CD34+, avec deux volumes de cinq millilitres de deux millimolaires PBS EDTA par élution. Pour évaluer la pureté des cellules sélectionnées par la perle magnétique, ajouter deux microlitres d’un anticorps anti CD34 humain approprié à une aliquote de 100 microlitres des cellules isolées et bien mélanger avant l’incubation pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius.
Après l’incubation, laver les cellules dans du PBS et ressuspend la pastille dans 200 microlitres de PBS pour l’analyse de la pureté de l’échantillon cellulaire par cytométrie en flux. Après le comptage, prélever les cellules CD34+ par centrifugation et ressuspender immédiatement la pastille dans une solution froide une à une densité de 10 à six cellules par millilitre avant d’ajouter rapidement la suspension cellulaire à la solution froide deux. Ensuite, placez immédiatement le tube cryogénique dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius pendant 24 heures avant de transférer le tube cryogénique dans un stockage d’azote liquide.
Dans cette étude représentative, les cellules ont été récupérées par filtration de leucoréduction, comme démontré avec une viabilité d’environ 95%. Après sélection des billes magnétiques, une population de cellules CD34+ pure supérieure à 90 % a été obtenue. La prolifération cellulaire diminue généralement après une semaine de culture, mais sans changements significatifs dans la viabilité cellulaire.
Au septième jour, les cellules CD34+ devraient commencer à exprimer CD41, un marqueur spécifique et précoce ou pour le développement des mégacaryocytes et des plaquettes. Au jour 10, la majorité des cellules de la culture se développent généralement en mégacaryocytes matures exprimant CD41. Au jour 13, l’extension et la libération plaquettaires pro mégacaryocytaires peuvent être observées par microscopie optique.
Le nombre total de plaquettes CD41, CD42, 8 positives libérées dans la culture peut ensuite être quantifié à l’aide d’un nombre étalonné de billes fluorescentes. Cette méthode ouvre la voie à l’amélioration des mécanismes sous-jacents de la mégacaryopoïèse et à l’augmentation des rendements en plaquettes visuelles. Même si cette méthode semble fastidieuse, il est très simple qu’il vous suffit d’être patient et de préparer toutes les régions à l’avance.
Bien que nos préoccupations critiques mégacaryopoïèse, nous obtenons des cellules CD42 peuvent être utilisées dans les voies surmatopoïétiques.
