Este protocolo é aplicável ao estudo da esteatose hepática, bem como às vias hepáticas, metabólicas, sintéticas e toxificação no contexto da esteatose. As principais vantagens desse método são sua reprodutibilidade e o pouco tempo necessário para obter resultados. Adicione o fato de que oferece dois níveis de esteatose, leve e grave.
A esteatose in vitro induzida pode fornecer evidências para a identificação de potenciais marcadores para o diagnóstico da doença, bem como alvos terapêuticos. Este método deve ser aplicado no resultado da esteatose. No entanto, pode ser ajustado para uma ampla gama de células diferentes afetadas por superexposição lipídica, como durante a obesidade e lipidemia.
Prepare o RPMI padrão 1640. Suplemento RPMI 1640 cultura média com 10% de FBS ativado por calor, e 1% de solução de estreptomicina de penicilina. Esterilizá-lo usando filtros de 0,22 micrômetros e armazene o suplemento a quatro graus Celsius.
Para preparar uma solução de estoque palmitato prepare uma solução de 50 mililitros de palmitato no RPMI padrão 1640 suplementado com 1% de BSA livre de lipídios. Esterilize cerca de cinco a dez mililitros da solução de estoque usando filtros de 0,22 micrômetros e armazene a quatro graus Celsius protegidos da luz por até um mês. Para preparar a solução de estoque oleate prepare uma solução de 50 milimilitos de oleato no RPMI 1640 suplementado.
E esterilizar a solução de estoque usando filtros de 0,22 micrômetros. Armazene-o a menos 20 graus Celsius, protegido da luz por até um mês. Para preparar o meio esteatogênico dos estoques previamente preparados, prepare 100 milímetros de uma mistura de 50 micromolar de uma parte palmitate e duas partes oleato.
Para níveis leves, despeje uma mistura de 500 micromolar de uma parte palmitato e duas partes oleate para níveis severos no RPMI padrão 1640. E esterilizar usando filtros de 0,22 micrômetros. Guarde a 4 graus Celsius por até uma semana.
Alternativamente, para preparar soluções de estoque com os respectivos ácidos graxos usando albumina lipídica livre, dissolver palmitato ou oleato em dois mililitros de etanol absoluto e, em seguida, misturar no volume final do RPMI padrão 1640. Dissolva oleate diretamente armazenando no meio de cultura RPMI padrão 1640. Permita a evaporação do etanol incubando em um banho de água a 70 graus Celsius e misture bem.
Esterilize ambas as soluções de estoque usando filtros de 0,22 micrômetros e armazene a solução de estoque palmitato a quatro graus Celsius. E solução de estoque oleate a menos 20 graus Celsius. Assento 0,1 milhões de células Hep G2 por poço em uma placa de 24 poços.
Adicione um mililitro do RPMI padrão 1640. Pré-incubar a 37 graus Celsius e 5% dióxido de carbono por 24 horas, permitindo a fixação celular. Após a pré cultura, descarte o meio RPMI padrão 1640.
E adicione o meio esteatogênico. Descarte o supernasal e adicione um meio esteatogênico fresco a cada 24 horas. Para realizar a avaliação de viabilidade e morfologia, descarte as células supernascidas e desacadas do poço adicionando 500 microliters de 0,05% de trippsina EDTA.
Incubar por cinco minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Colete as células resuspended em um micro tubo. E centrífuga a 300 vezes G.Então descarte o supernante, adicione 200 microliters de RPMI padrão 1640, e resuspense as células.
Adicione 15 microliters de 0,4% da solução azul trypan em um micro tubo fresco. Adicione e misture 15 microliters da suspensão celular anterior. Conte as células manchadas e não manchadas em um hemótmetro e calcule as taxas de viabilidade e mortalidade.
Coloque um deslizamento de cobertura de cultura celular em cada poço em uma placa de 24 poços e células hep g2 como descrito no manuscrito do texto. Após a incubação apropriada, lave as células com um mililitro de PBS e descarte o sobrenante. Misture-os com um mililitro de 4% de paraformaldeído na PBS e incubar por uma hora à temperatura ambiente.
Descarte o excesso de paraformaldeído e enxágue as células com um mililitro de água destilada. Em seguida, adicione um mililitro de isopropanol de 70% e incubar por cinco minutos. Descarte o excesso de isopropanol e adicione um mililitro da solução Oil-Red O e incubar por 30 minutos.
Descarte o excesso de solução Oil-Red O e enxágue com um mililitro de água destilada. Observe as células sob o microscópio a uma ampliação de 400x. Selecione e capture aleatoriamente fotografias de 10 campos ópticos da área completa do poço.
Repita a imagem para cada poço. Para avaliar a porcentagem de área manchada de vermelho, abra o software ImageJ e importe arquivos necessários, clique em ajustar e use a ferramenta limiar de cor", defina o parâmetro de matiz para detecção de cores vermelhas. Em seguida, ajuste a saturação e o brilho para a imagem.
Compare a área manchada com a área completa do campo óptico, utilizando a ferramenta de partículas de análise e calcule a porcentagem média de cada poço. Acomodar 0,1 milhão de hepatócitos por poço em placas de 24 poços proporciona uma confluência ideal. A viabilidade diminuiu progressivamente à medida que o tempo da cultura aumentava, atingindo o menor de 60% em quatro dias em esteatose grave.
Assim, a taxa de mortalidade foi maior em hepatócitos cultivados nas condições esteatogênicas. E aumentou progressivamente com o tempo de exposição a lipídios. O número de células aumentou progressivamente como resultado da proliferação.
No entanto, a taxa de proliferação foi menor em esteatose leve em três e quatro dias. Em contrapartida, a esteatose grave foi associada à menor proliferação em 24 horas. As células de coloração com O Vermelho-Óleo demonstraram pelo menos um aumento duplo de gotículas lipídicas em células cultivadas sob condições esteatogênicas.
A gordura intracelular aumentou de acordo com o tempo de exposição da cultura no meio esteatogênico. Em esteatose leve, o conteúdo lipídudo foi aumentado a partir do segundo dia, enquanto na esteatose grave foram significativamente elevados a partir das 24 horas. A cultura celular requer experiência prévia.
Culturing Hep G2 cells em uma condição padrão antes de usar este protocolo pode ser útil. A preparação do estoque de ácidos graxos também é um ponto crucial. O ácido palmítico é sólido à temperatura ambiente, e precisa ser aquecido antes de sua gestão.
Este método deve permitir a análise molecular de diferentes caminhos, incluindo, mas não se limitando à proliferação, apoptose, autofagia, estresse oxidativo e análise farmacológica e toxicológica.
