O protocolo aqui descrito é apropriado para avaliar o desempenho do mosquito transgênico e comparações com contrapartes do tipo selvagem em um pequeno ensaio de gaiola de laboratório. Os ensaios de gaiolas pequenas são importantes para fornecer valores empíricos que ajudarão a preencher a implementação de novas tecnologias para a eliminação da malária. Os ensaios da gaiola podem ser adaptados a outros projetos experimentais e são adequados para avaliar a dinâmica de uma ameaça de um transgênero desejo.
Após a introdução de indivíduos transgênicos. Inicie a fase inicial do experimento, estabelecendo três gaiolas de 0,216 metros cúbicos em triplicados. E adicionando 60 larvas do tipo selvagem de 60 segundos a cada gaiola ao longo de três semanas consecutivas.
Toda semana, forneça fêmeas adultas em cada gaiola com ratos anestesiados como fonte de farinha de sangue. E um recipiente de oviposição três dias após a refeição de sangue. Chocar ovos de cada gaiola semanalmente.
Da semana quatro ao oito, selecione 60 larvas L2 instar de segunda a ser aleatoriamente para retornar às suas respectivas gaiolas. Na semana nove, atribua aleatoriamente um conjunto de gaiolas triplicadas como controles e um conjunto para cada razão de liberação desejada. Adicione 60 pupas do tipo selvagem com 30 machos e 30 fêmeas às gaiolas de controle semanalmente.
Mantenha uma proporção de um a um em cada gaiola respectiva, adicionando semanalmente 30 pupas machos transgênicas, juntamente com 60 pupas do tipo selvagem. Para uma proporção de um a 0,1, adicione 300 pupas machos transgênicos semanalmente em cada gaiola respectiva, juntamente com 60 pupas do tipo selvagem. Repita adicionar pupas de mosquito na gaiola, fornecendo farinha de sangue e eclodindo ovos toda semana.
Selecione um total de 300 larvas de cada gaiola aleatoriamente para triagem. Trie as larvas sob um microscópio estéreo com filtros de fluorescência para a expressão do marcador dominante fluorescente em estágios larvais e pupais. Marque o sexo da pupae resultante.
No experimento de unidade genética, empregue uma estratégia de barreira mantendo os mosquitos em um inseto seguro e seguindo procedimentos operacionais padrão com monitoramento regular. Prepare uma gaiola montada com dois conjuntos de gaiolas triplicadas de 0,216 metros cúbicos para cada relação de liberação masculina transgênica e selvagem desejada. Para alcançar uma razão de liberação masculina de um para um, adicione 120 machos transgênicos, 120 machos e fêmeas do tipo selvagem na fase pupa para cada gaiola de replicação.
Forneça uma refeição de sangue usando camundongos anestesiados para fêmeas de quatro a sete dias de idade em cada gaiola. Depois de chocar ovos em uma bandeja larval, selecione aproximadamente 240 primeiras larvas instar L1 aleatoriamente de cada gaiola e criá-los para pupas antes de retornar às suas respectivas gaiolas. Selecione e tela larvas para marcador ocular e fenótipo sexual como descrito anteriormente.
Monte uma gaiola de gaiolas de 0,005 metros cúbicos com um número igual de machos e fêmeas para cada razão específica de liberação de transgênicos para machos do tipo selvagem. Usando um aparelho de alimentação artificial, forneça refeições sanguíneas para as fêmeas de quatro a sete dias de idade em cada gaiola em dois dias consecutivos. Três dias após a segunda refeição sanguínea, adicione um recipiente de oviposição e remova os recipientes após três dias.
Depois de marcar todos os mortos e os adultos vivos que permanecem na gaiola por sexo, armazene-os a menos 80 graus Celsius para análise molecular. Chocar ovos e executar selecionar 200 larvas L1 e deixar as larvas de lado para povoar novas gaiolas para a próxima geração. Em seguida, selecione aleatoriamente outras 500 larvas de cada gaiola reservada para triagem.
Crie as 200 larvas selecionadas para pupa e 500 larvas para l4 estágio instar. Devolva pupa de 200 bandejas para povoar nova gaiola. Tela selecionada aleatoriamente larvas para marcador ocular e fenótipo sexual Como antes.
Na análise representativa, a dinâmica esperada do fenótipo das réplicas de melhor desempenho é mostrada para os diferentes protocolos de ensaios de reposição populacional. Os resultados mostraram a proporção linear crescente de larvas com fenótipo de marcador DsRed ao longo de sete gerações. O lançamento de um a um sem drive atingiu pouco mais de 80% de introdução transgênica dentro de sete gerações.
Os protocolos de unidade genética conseguiram isso dentro de três a quatro gerações. Assim, validando que uma única liberação de um sistema de acionamento genético pode ser mais eficiente para a introdução transgênica. No final da observação, a disseminação do transgene tinha atingido a introdução quase completa em sistemas de acionamento genético.
Parâmetros importantes, como relação de liberação da estrutura etária, tamanho da gaiola e outros variam dependendo da finalidade do experimento e objetivos específicos. Experimentos para avaliar parâmetros de aptidão, como fertilidade e fecundidade, podem ser feitos. Além disso, mais dados empíricos dos ensaios da gaiola podem ser usados para parametrizar modelos matemáticos da dinâmica populacional.
