Parasitas da malária, como os de mosquitos que desempenham um papel importante na disseminação da doença. Até agora, tem sido impossível criar mosquitos da malária sem sangue. E para superar essa limitação, nosso protocolo descreve uma dieta substituta de sangue que é capaz de suportar a criação de mosquitos na insenseção.
O uso de dieta sem sangue é altamente vantajoso sobre o sangue. Uma dieta sem sangue não tem as restrições éticas como o uso de sangue humano, ou animais experimentais. Substituir animais em experimentação faz parte da nossa política de três R.
Substitua, reduza, refine. Não usar sangue reduz custos, e a logística associada à coleta, armazenamento e manutenção de sangue vermelho. O uso de dietas artificiais pode facilitar o teste de moléculas anti plasmodium.
Até agora, testamos nossas dietas usando diferentes espécies de anopheles. Em todas elas, a dieta foi bem engorgada pelas fêmeas e permitiu a produção e colocação de ovos. Acreditamos que esta dieta tem potencial de uso para a criação de outras espécies de mosquitos.
Na verdade, estamos agora testando para aedes, um vetor de muitas doenças como dengue, zika vírus ou febre amarela. Mantenha os mosquitos de cepa anopheles coluzzii yaonde em uma sala a 26 graus Celsius, 75% de umidade e sob um ciclo escuro claro de 12 horas a 12 horas. Mosquitos domésticos usando condições de insetídula padrão em uma única gaiola para garantir o acasalamento.
Use uma pipeta de plástico para coletar pupas de mosquito em um pequeno recipiente de água. Coloque o recipiente dentro de uma gaiola de mosquitos para deixar os mosquitos adultos emergirem e acasalarem. Fornecer solução de alimentação de 10% glicose na gaiola.
Três dias após o surgimento, use um aspirador para coletar o número necessário de fêmeas da gaiola de estoque em um copo de papel. Para distinguir, as fêmeas são maiores e os machos têm um proboscis mais largo e emplumado. Um dia antes de alimentar trilhas, remova a solução de alimentação de 10% glicose.
No dia seguinte, prepare dietas líquidas artificiais em condições estéreis no armário de fluxo laminar de acordo com o manuscrito. Adicione todos os ingredientes a um tubo de plástico. Misture bem todos os ingredientes e filtre usando um microfiltro de 0,45 mícrons.
Encha uma seringa estéril de 1 mililitro equipada com uma agulha de meia polegada de calibre 27 com 100 microliters de um miligrama por mililitro de heparina. Em seguida, anestesiar cd de seis a oito semanas de idade um camundongos fêmeas com cetamina e xilazina usando a rota intra peritoneal. Avalie se o mouse exibe alguma reação muscular e resposta a diferentes estímulos físicos.
Faça a punção cardíaca. Em seguida, coletar sangue do rato em um micro tubo e manter o sangue a 37 graus Celsius em um banho de água. Em seguida, recolhe aproximadamente 30 mosquitos fêmeas da gaiola usando um aspirador.
Transfira os mosquitos fêmeas para copos de papel de 500 mililitros e cubra com uma malha fina de rede de mosquitos para que eles não possam escapar. Estique a membrana do parafilme através da boca do alimentador de vidro para conter a refeição. Aplique um aparelho de alimentação artificial de sino de vidro conectado a tubos plásticos na parte superior de cada xícara.
Forneça um fluxo de água constante para o tubo cilíndrico e alimentador para que a temperatura dentro seja mantida em aproximadamente 37,5 graus Celsius. Aplique um mililitro de dieta líquida pré-armada a 37 graus Celsius ou sangue de rato fresco em um alimentador de vidro. Alimente os mosquitos por 60 minutos no escuro em 26 graus Celsius.
Após a alimentação artificial, o frio anestesia os mosquitos a 20 graus Celsius por 30 segundos. Em seguida, coloque os mosquitos em uma placa de Petri refrigerada. Regisso número de mosquitos fêmeas totalmente engorgados.
Separe 30 fêmeas totalmente engorgadas e coloque-as em uma nova gaiola. Agora, coloque um papel filtro umidificado na parte inferior de cada gaiola. Mantenha os mosquitos a 26 graus Celsius, 75% de umidade, e sob um ciclo escuro claro de 12 horas a 12 horas com 10% de glicose ad libitum.
Às 96 horas e 120 horas após a alimentação, conte os ovos com a ajuda de uma lupa portátil. Inunde o papel filtro com água destilada para coletar os ovos em bandejas cheias de água destilada. Alimente as larvas diariamente com aproximadamente 13 miligramas de alimentos moídos por bandeja.
Remova pupas mortas e larvas com uma pipeta de plástico diariamente. Quando todas as pupas se desenvolveram em adultos, conte o número de machos e fêmeas adultos, registre as datas de eclosão e morte e calcule as taxas de mortalidade. Para testar a longevidade, colete 15 homens adultos e 15 fêmeas adultas da geração F1 de cada grupo dietético em um copo de papel.
Alimente adultos com solução de glicose de 10% ad libitum. Use pinças ou um pincel para remover os adultos mortos diariamente. Mantenha os mosquitos na mesma temperatura, umidade, condições de ciclo leve e regime de alimentação de açúcar.
Registre as datas de óbito e calcule a longevidade. Para medir o comprimento da asa, anesthetize cinco dias de idade F1 mosquitos adultos machos e fêmeas de cada grupo dietético a 20 graus Celsius por 90 segundos. Sob um estereóscópio, segure suavemente o tórax de cada mosquito com fórceps, e coloque-os de lado ventral para cima.
Colete ambas as asas usando um bisturi, e coloque-as em um slide de microscópio limpo contendo uma gota seca de meio de montagem para medição posterior usando uma ocular graduada. Meça o comprimento da asa com um estereoscópio usando um micrômetro. Neste estudo, foi comparado o desempenho de mosquitos anofelinos fêmeas alimentados com a rica refeição artificial formulada e mosquitos alimentados com a dieta líquida inicial, ou uma refeição de sangue fresco.
O número de mosquitos fêmeas engorgadas alimentadas com rica refeição artificial em 89% foi significativamente maior do que o número de fêmeas engorgadas alimentadas com sangue em 56%A geração de mosquitos F1 alimentados com o sangue ou a rica refeição artificial tinha taxas de mortalidade e sobrevivência comparáveis. A variabilidade foi maior nos mosquitos alimentados com sangue em relação aos mosquitos alimentados com a rica refeição artificial. Em termos de tamanho corporal adulto, os mosquitos anopheles F1 alimentados com rica refeição artificial estavam dentro da faixa esperada, e era semelhante aos mosquitos insetos alimentados pelo sangue.
Na minha opinião, é muito importante montar os alimentadores corretamente com o parafilme para evitar sua ruptura. Se a membrana não estiver bem ligada ao alimentador de vidro, você pode perder a refeição e provavelmente perder alguns dos mosquitos, pois eles podem ser cobertos pela refeição e morrer. Gostaríamos de realizar um ensaio de atração de dupla escolha, por exemplo, usando um olfactômetro para que pudéssemos realmente avaliar se nossas fêmeas são mais atraídas pela dieta artificial ou pelo sangue.
Além disso, estamos agora liofilizando a dieta artificial e estudando sua estabilidade entre diferentes temperaturas há muito tempo. Além das melhorias óbvias na estabilidade e no armazenamento em que estamos trabalhando, o uso a longo prazo da dieta sobre o condicionamento físico e fisiologia do mosquito deve ser investigado. Acredito que a produção de anofelinos sem sangue facilitará imensamente a pesquisa vetorial e a implementação de ferramentas de controle que dependem de um grande número de mosquitos.
