Reconhecemos Heng Lin Yeap, Chris Paton, Petrina Johnson e Clare Doig por suas contribuições para o desenvolvimento dos nossos métodos de manutenção de colônia e três revisores anônimos pelas suas sugestões que ajudaram a melhorar o manuscrito. Nossa pesquisa é suportada por um programa grant e comunhão para AAH do saúde nacional e Conselho de pesquisa médica e uma tradução concedem partir Wellcome Trust. PAR é um destinatário de um bolsa de programa de treinamento de investigação australiano governo.

Sangue se alimentando de mosquitos em seres humanos foi aprovado pela Universidade de Melbourne Comitê de ética humana (aprovação #: 0723847). Todos os voluntários prestados informaram consentimento por escrito.
1. larval de criação
Nota: Os mosquitos são realizados em 26 ± 0,5 ° C e 50-70% umidade relativa, com um fotoperíodo de h (luz: escuro) 12:12 por este protocolo de manutenção de colônia. Estas condições são semelhantes às condições climáticas médias em Cairns, na Austrália e o intervalo térmico ideal para Ae. aegypti sobrevivência e desenvolvimento44,,45,46. Temperaturas elevadas podem resultar na perda de Wolbachia infecções das colônias de mosquito e devem ser evitada,47. Nós mantemos pelo menos 500 indivíduos por população para minimizar a consanguinidade; manutenção de colônias de tamanho menor pode ter consequências de aptidão [Ross et al não publicado]. Sob essas condições e assumindo uma nutrição adequada, o tempo de geração média é de 28 dias (ver tabela 1).
<ol><li>Mergulhe os ovos no substrato em bandejas (figura 1A), que contém 3 L de água (água de osmose reversa ou água da torneira envelhecido, gerada, deixando a água da torneira em bandejas para 24 h antes da sua utilização), ~ 300 mg de comida de peixe (um esmagado da tabuleta, consulte Tabela de materiais) e um alguns grãos de fermento seco ativo para induzir a incubação de48.</li>
	<li>Um dia após a eclosão, use uma pipeta de vidro para transferir aproximadamente 500 larvas para bandejas contendo 4 L de água (figura 1B), conta usando um contador de controle remoto. Adicione dois comprimidos de comida de peixe moído para cada bandeja. Se necessário, use recipientes de tamanhos diferentes para a criação de larvas (figura 1A), mas manter a densidade larval abaixo de 0,5 larvas/mL para evitar superlotação.</li>
	<li>Verifique as bandejas diariamente para garantir que as larvas têm comida suficiente; Adicione aproximadamente dois comprimidos de comida para as bandejas em dois dias. Fornecer alimentação ad libitum , mas certifique-se que 0,5 mg/larva/dia está disponível durante este período para garantir o desenvolvimento é síncrono e tamanho de corpo é consistente, caso contrário os resultados dos experimentos podem ser confundidos (ver resultados de representante).</li>
	<li>Tome cuidado para evitar a superalimentação de larvas, particularmente em recipientes menores criação com menos água, volume e área de superfície. Se a água parece nublada ou se houver significativa mortalidade larval, substituí-lo com água fresca; mortalidade deve ser insignificante se larvas são alimentadas de forma otimizada.</li>
</ol>2. adulto surgimento
Nota: As larvas começará a empupar de cinco dias após a eclosão, se bem alimentados e a maioria deve pupate por sete dias após a eclosão. Adultos começará emergentes aproximadamente dois dias após a pupação se otimamente a 26 ° C (ver Resultados de representante). Desenvolvimento larval é normalmente afetado pela Wolbachia infecções quando amplo alimento é fornecido23,39,49.
<ol><li>Sete dias após a eclosão despeje todo o conteúdo da bandeja através de uma malha fina (tamanho de poro 0,4 mm). Manter a água filtrada larval para uso posterior em ovicups (consulte a seção "Sangue alimentação e oviposição"). Inverter a malha e mergulhá-lo em um recipiente plástico com 200 mL de água para transferir as pupas. Fornece alimento adicional se qualquer larvas permanecem.</li>
	<li>Prepare as gaiolas de emergência de adultos (Figura 1) fornecendo dois copos de solução de sacarose 10% (Figura 1F) e duas xícaras de algodão úmido para evitar a dessecação (Figura 1E).</li>
	<li>Se as pupas não precisa ser classificados por sexo, coloque os recipientes extraível de pupas na gaiola e deixe a tampa entreaberta para permitir que os adultos a emergir dentro da jaula. Como alternativa, coloque um funil invertido sobre o recipiente para minimizar a afogar-se. Certifique-se de todos os adultos têm surgido antes de retirar o recipiente da gaiola para evitar selecionando contra desenvolvedores lentos.</li>
</ol>3. pupa sexagem para cruzamento
<ol><li>Se as pupas precisam ser classificados por sexo (por exemplo, para o cruzamento), pipetar as pupas de bandejas larvas e separar os sexos (Figura 2) em recipientes de plástico (figura 1A) com 200 mL de água cada 24h até o número desejado de cada sexo. foi alcançado. Coloque as tampas nos recipientes e deixá-los fechados.</li>
	<li>Adultos vão surgir nas gavetas; Confirme o seu sexo antes de liberar em gaiolas (Figura 2). Remova qualquer adultos sexados incorretamente com um aspirador dentro de 24 h de emergência antes de atingirem a maturidade sexual. Uma vez confirmados os sexos, solte os adultos em gaiolas cada 24 h.</li>
	<li>
Para obter a Wolbachia-colônias infectadas de um fundo genético similar a uma população natural, outcross adicionando Wolbachia-infectados fêmeas de colônias de laboratório para gaiolas de machos não infectados derivados de ovos recolhidos por Leishmania em o campo39, mantendo a densidade prescrita de 500 indivíduos por população.
	<ol>
<li>Repeti o cruzamento há pelo menos três gerações consecutivas produzir colônias que estão pelo menos 87,5% geneticamente semelhante a população de campo39. Crítica: Certifique-se de que os sexos estão corretos nesta fase (ver passo 3.1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Feminino Ae. aegypti são geralmente refratários a inseminação mais horas de acasalamento50. Quando o cruzamento de colônias, permitir que as fêmeas e machos amadurecer em gaiolas separadas por dois dias e depois Aspire as fêmeas para a gaiola do macho fornecer uma oportunidade igual para todos os homens.</li>
</ol>4. sangue alimentação e oviposição
<ol><li>
Espere pelo menos três dias após a última fêmea surgiu antes sangue alimentando para permitir tempo suficiente amadurecer. As fêmeas de alimentação de sangue dentro de duas semanas de emergência para evitar a mortalidade excessiva, particularmente para os mosquitos com Wolbachia infecções que afectam negativamente a longevidade22,24,49. Remova as xícaras de açúcar o dia antes da alimentação para melhorar as taxas de alimentação.
	<ol>
<li>Pedir um voluntário para inserir a gaiola para permitir que os mosquitos fêmeas alimentar seu antebraço. A maioria das fêmeas devem alimentar para repletion dentro de 5 min, mas para reduzir a seleção contra alimentadores lentas, deixe o antebraço na gaiola por 15 min, ou até que todas as fêmeas são visivelmente ingurgitadas; uma luva de látex para proteger a mão de mordidas é opcional mas recomendado.</li>
		<li>Dois dias após a alimentação de sangue, coloque dois copos de plástico contendo água criação larval e revestidas com uma fita de lixa (Figura 1) (ou papel de filtro (Figura 1 H)) dentro da gaiola para as fêmeas que põem ovos. Parcialmente, mergulhe a tira de lixa na água para mantê-lo úmido. Remova outras fontes de água para evitar que as fêmeas botando seus ovos fora da Copa de oviposição. Nota: água da torneira pode ser usado nos copos, mas incentiva a criação de larvas de água oviposição51,52 e fêmeas colocarão seus ovos mais sincronicamente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. ovo coleção e condicionamento
<ol><li>As fêmeas colocarão ovos sobre a lixa apenas acima da linha de água; recolher e substituir as tiras de lixa diariamente até que não mais ovos. Observe que a oviposição pode continuar por mais uma semana.</li>
	<li>Tiras de lixa parcialmente seco borrando-los delicadamente sobre uma toalha de papel por 30 s, tomando cuidado para não deslocar os ovos. Em seguida, enrole as tiras em uma folha de toalha de papel seca e coloque-o em um saco plástico vedável (Figura 1I).</li>
	<li>Verifique o estado dos ovos sob um microscópio dissecação (Figura 3). Se a folha de lixa tiras são muito molhada, os ovos podem eclodir antes de ser submerso em água (Figura 3B), mas se secado muito duramente, ovos podem entrar em colapso (Figura 3).</li>
	<li>Os ovos podem ser incubados a qualquer momento, além da coleção pós três dias; pôr todos os ovos em cada colônia, coletados através de todos os dias, no mesmo recipiente de água para garantir que a próxima geração é amostrada de uma grande piscina aleatória de indivíduos.</li>
	<li>Para armazenamento a longo prazo, mantenha os ovos em um recipiente selado em uma umidade alta (> 80%) a cerca de 20 ° C. Nestas condições, os ovos sem Wolbachia podem ser armazenados por vários meses, mantendo a escotilha altas taxas53,54.</li>
	<li>Como algumas infecções Wolbachia reduzem a viabilidade dos ovos com idade49,55, chocar os ovos de Wolbachia-infectados linhas dentro de uma semana de coleta para evitar mortalidade excessiva para o relevante estirpes. Sangue alimenta as fêmeas novamente depois de uma semana, se são necessários mais ovos.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Dia</td>
			<td colspan="3">Passo</td>
		</tr>
<tr>
<td>0</td>
			<td colspan="3">Ovos de escotilha</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td colspan="3">Contagem de larvas em bandejas</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td colspan="3">Transferência de larvas e pupas para gaiolas de colônia</td>
		</tr>
<tr>
<td>17</td>
			<td colspan="3">Sangue alimenta adultos femininos</td>
		</tr>
<tr>
<td>21</td>
			<td colspan="3">Começar a coleta de ovos</td>
		</tr>
<tr>
<td>25</td>
			<td colspan="3">Terminar a coleta de ovos</td>
		</tr>
<tr>
<td>28</td>
			<td colspan="3">Ovos de escotilha</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Visão geral do programa de manutenção de colônia Ae. aegypti em 26 ° C. O momento da sangue feminina-alimentação e a eclosão dos ovos é flexível, mas longas durações nestas fases devem ser evitadas, particularmente para os mosquitos infectados com Wolbachia, a fim de minimizar a mortalidade. Seguindo esta agenda minimiza seleção contra mosquitos que são rápidos ou lentos para desenvolver ou amadurecem em todas as fases da vida, desde que as larvas são alimentadas de forma otimizada.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56124/56124fig1.jpg"> Figura 1: Equipamento utilizado para a criação de Ae. aegypti em laboratório. Recipientes de plástico (A) usados para ovos para incubação ou criação de larvas com volumes de 500, 750 e 5.000 mL (da esquerda para a direita). (B) bandejas utilizadas para a criação de larvas em uma densidade controlada, geralmente 500 larvas 4 litros de água. (C) 19,7 L e (D) L 3 gaiolas utilizadas para adultos de habitação. Uma densidade de 25 adultos ou menos por litro deve ser mantido para proporcionar espaço suficiente. (E) 35 mL do copo com lã de algodão úmido fornecido como uma fonte de água para adultos. (F) 35 mL do copo com solução de sacarose fornecida através de um cabo ou pavio dental como uma fonte de açúcar. (G–H) Copos cheios de água criação larval e forrado com um substrato de oviposição de lixa ou papel de filtro (G e H, respectivamente). (eu) Zip-lock saco usado para armazenamento de tiras de lixa ou papel de filtro. Manchas pretas na lixa são os ovos do mosquito. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56124/56124fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56124/56124fig2.jpg"> Figura 2: Lateral (A) e dorsal (B) vista de pupas e adultos Ae. aegypti (C) demonstrando seu dimorfismo sexual. Os machos estão posicionados à esquerda e as fêmeas à direita de cada painel. Quando otimamente alimentados, pupas masculinas e femininas distinguem-se pelo tamanho; as fêmeas são maiores que os machos (A) e tem um cefalotórax relativamente bulbosa, em comparação com os machos que têm partes planas (B). Adultos do sexo masculino são facilmente distinguidos das fêmeas sob todas as condições de criação, principalmente pelos seus plumose antenas e palpos longos. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56124/56124fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56124/56124fig3.jpg"> Figura 3. Quatro dias de idade Ae. aegypti ovos sob diferentes condições. (A) Intact ovos em tiras de lixa, mantidas em uma umidade alta (> 80%), mas sem qualquer umidade visível. Taxas de hachura devem ser acima de 90% para o selvagem-tipo Ae. aegypti se mantida corretamente. (B) ovos que eclodem antes de ser submerso em água (incubação precoce) distinguem-se por uma tampa isolada de ovo e larva visível. Isso indica que a tira de lixa foi mantida muito úmida. (C) ovos que são secas muito duramente podem entrar em colapso e são claramente visíveis pela aparência côncava. Se a folha de lixa torna-se duro também indica que os ovos podem ser muito secos. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56124/56124fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Seguindo o protocolo aqui apresentado para a manutenção de Wolbachia-infectados Ae. aegypti deverão assegurar que mosquitos saudáveis de uma qualidade consistente são produzidos para experimentos e abrir campo de lançamentos. Em contraste com outros protocolos que priorizem a produção de grandes quantidades de mosquitos (ver referência57), os métodos estão focados em maximizar sua aptidão, tanto dentro de gerações implementando relaxadas condições de criação e d...

Os mosquitos Aedes aegypti são responsáveis pela transmissão de algumas dos arbovírus mais importantes do mundo, incluindo a dengue, Zika e chikungunya1. Estes vírus estão se tornando uma ameaça crescente à saúde global, como a distribuição generalizada do Ae. aegypti nos trópicos continua a expandir a2,3,4. Feminino Ae. aegypti preferencialmente se alimentam de sangue humano5 e, portanto, tendem a viver em estreita proximidade com os seres humanos, particularmente em áreas urbanas, onde as populações são mais densas. Através desta associação estreita com os humanos eles também se adaptaram para procriar em habitats artificiais, incluindo pneus, vasos, calhas e tanques de água6,7. Ae. aegypti também facilmente adaptar-se a ambientes de laboratório, onde eles podem ser mantidos sem quaisquer requisitos especiais após ser coletado diretamente do campo, ao contrário de algumas outras espécies do género Aedes 8, 9,10. Sua facilidade de manutenção tem visto amplamente estudados no laboratório em uma ampla gama de campos, em última análise, com o objetivo de controlar os mosquitos de doenças pode transmitir.
Tradicionalmente, o controle arboviral confia pesadamente sobre o uso de inseticidas para reduzir populações do mosquito. No entanto, há um crescente interesse em abordagens onde os mosquitos modificados são criados em laboratório e em seguida lançados em populações naturais. Os mosquitos liberados podem ser modificados geneticamente11,12,13, biologicamente14,15, através de irradiação16, tratamento químico de17,18, ou para o conjunto de técnicas19 para suprimir as populações de mosquitos ou substituí-los por mosquitos que são refratários a transmissão arboviral20.
Wolbachia são bactérias que estão atualmente sendo usadas como um agente de controle biológico para arbovírus. Várias cepas de Wolbachia foram recentemente introduzidas Ae. aegypti experimentalmente utilizando microinjeção embrionárias21,22,23,24. Estas cepas reduzem a capacidade dos arbovírus para divulgar e replicar no mosquito, diminuindo sua transmissão potencial23,25,26,27,28 . Wolbachia infecções são transmitidas da mãe à prole, no entanto certas estirpes induzem esterilidade quando machos infectados acasalam com as fêmeas não infectadas22. Wolbachia-machos infectados, portanto, podem ser liberados em grandes quantidades para suprimir as populações naturais de mosquitos, como recentemente demonstradas em outras espécies de Aedes 15,29. No entanto, desde que a Wolbachia também inibir a transmissão arboviral em Ae. aegypti, mosquitos também podem ser liberados para substituir as populações nativas com vetores mais pobres. Ae. aegypti infectados experimentalmente com Wolbachia agora estão sendo liberados para o campo em vários países que utilizam esta última abordagem14,30,31.
Wolbachia-abordagens com base para controle arboviral dependem de uma sólida compreensão das interacções entre Wolbachia, o mosquito e o ambiente. Wolbachia ocorrem naturalmente em uma ampla variedade de insetos, e as cepas introduzidas os mosquitos são diversas em seus efeitos,32. Como novos tipos de infecção de Wolbachia sejam introduzidos Ae. aegypti24, é necessário caracterizar cada estirpe para seus efeitos sobre a aptidão do mosquito, a reprodução e a interferência arboviral sob uma variedade de condições. Rigorosa experimentação em laboratório, portanto, é necessário para avaliar o potencial de Wolbachia cepas suceder no campo.
Lançamentos de campo aberto do Ae. aegypti com Wolbachia infecções muitas vezes podem exigir milhares a dezenas de milhares de mosquitos por zona de lançamento a ser criados a cada semana14,30,31. O sucesso dos lançamentos iniciais pode ser melhorado através da libertação de mosquitos de um tamanho grande para maximizar sua fecundidade33 e acasalamento sucesso34,35. Os mosquitos também devem ser adaptados às condições que eles experimentarão no campo, criação de laboratório no entanto a longo prazo pode causar alterações no comportamento e fisiologia, o que poderia afetar o campo desempenho36,37,, 38.
Descreveremos um protocolo simples para a criação de Ae. aegypti em laboratório usando equipamento básico. Este protocolo é apropriado para ambos selvagem-tipo e Wolbachia-infectadas de mosquitos, o último dos quais pode exigir atenção especial como algumas cepas de Wolbachia têm efeitos significativos no mosquito-história de vida características39, 40. as condições de criação evitar superlotação e competição por comida produzir mosquitos de um tamanho consistente, que é fundamental para a competência de vetor e experimentos de aptidão e garante que os mosquitos são saudáveis para a liberação do campo41 . Também tomamos precauções para minimizar a adaptação de laboratório e endogamia, reduzindo as pressões selectivas e garantindo que a próxima geração é amostrado de uma grande piscina aleatória. No entanto, ambientes de laboratório são distintamente diferentes das condições de campo, e manutenção a longo prazo sob condições relaxadas poderia reduzir a aptidão dos mosquitos após a liberação para o campo37,42,43 . Portanto, atravessamos fêmeas das linhas de laboratório para coleta de campo machos periodicamente, resultando em colônias que são geneticamente semelhantes para comparações experimentais e que são adaptados para o campo de destino população39. Os métodos não exigem qualquer equipamento especializado e podem ser ampliados para trás dezenas de milhares de indivíduos por semana para lançamentos de campo. O protocolo também prioriza a adequação de mosquitos dentro e através das gerações, uma consideração importante para destinado a estabelecimento em populações naturais de insetos. O protocolo é apropriado para a maioria dos laboratórios que requerem manutenção de Ae. aegypti, particularmente para comparações experimentais onde uma qualidade consistente de mosquitos e relatability para o campo são importantes.

<table><tbody><tr><td>Wild type &lt;em&gt;Aedes aegypti&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>Collected from field locations in Queensland, Australia, see Yeap and others&lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;39&lt;/sup&gt; for details</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;w&lt;/em&gt; Mel-infected &lt;em&gt;Aedes aegypti&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>Provided by Monash University. Refer to Walker and others&lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;23&lt;/sup&gt; for information on the strain</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;w&lt;/em&gt; AlbB-infected &lt;em&gt;Aedes aegypti&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>Provided by Monash University. Refer to Xi and others&lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;21&lt;/sup&gt; for information on the strain</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;w&lt;/em&gt; MelPop-infected &lt;em&gt;Aedes aegypti&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>Provided by Monash University. Refer to McMeniman and others&lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;22&lt;/sup&gt; for information on the strain</td></tr><tr><td>Instant dried yeast</td><td>Lowan</td><td></td><td>Stimulates egg hatching. Found in general grocery stores. Other brands may be used</td></tr><tr><td>5 L plastic tub</td><td>Quadrant</td><td>Q110950</td><td>Used for hatching and rearing larvae. Other products may be used</td></tr><tr><td>Fish Food (Tetramin Tropical Tablets)</td><td>Tetra</td><td>16152</td><td>Provided to larvae as a source of food. Web address: https://www.amazon.com/Tetra-16152-TetraMin-Tropical-10-93-Ounce/dp/B00025Z6SE</td></tr><tr><td>Plastic containers</td><td></td><td></td><td>Used for rearing larvae. Any plastic container above 500 mL should be suitable</td></tr><tr><td>Glass pipette</td><td></td><td></td><td>Used for transferring larvae and pupae between containers. Web address: https://www.aliexpress.com/item/10Pcs-Durable-Long-Glass-Experiment-Medical-Pipette-Dropper-Transfer-Pipette-Lab-Supplies-With-Red-Rubber-Cap/32704471109.html?spm=2114.40010308.4.2.py4Kez</td></tr><tr><td>Clicker counter</td><td>RS Pro</td><td>710-5212</td><td>Used to assist in the counting of larvae, pupae and eggs. Web address: http://au.rs-online.com/web/p/products/7105212/?grossPrice=Y</td></tr><tr><td>Rearing trays</td><td>Gratnells</td><td></td><td>Used for rearing larvae. Web address: http://www.gratnells.com</td></tr><tr><td>Nylon mesh</td><td></td><td></td><td>Used to transfer larvae and pupae to containers of fresh water. Other brands may be used. Web address: https://www.spotlightstores.com/fabrics-yarn/specialty-apparel-fabrics/nettings-tulles/nylon-netting/p/BP80046941001-white</td></tr><tr><td>Cages</td><td>BugDorm</td><td>DP1000</td><td>Houses adult mosquitoes. Alternative products may be used. Web address: http://bugdorm.megaview.com.tw/bugdorm-1-insect-rearing-cage-30x30x30-cm-pack-of-one-p-29.html</td></tr><tr><td>35 mL plastic cup</td><td>Huhtamaki</td><td>AA272225</td><td>Used to provide water or sucrose to adult mosquitoes. Other brands may be used</td></tr><tr><td>35 mL plastic cup lid</td><td>Huhtamaki</td><td>GB030005</td><td>Used to provide sucrose to adult mosquitoes. Other brands may be used</td></tr><tr><td>Cotton wool</td><td>Cutisoft</td><td>71841-13</td><td>Moist cotton wool is provided as a source of water to adults. Other brands may be used</td></tr><tr><td>White Sugar</td><td></td><td></td><td>Provided as a source of sugar to adult mosquitoes. Found in general grocery stores</td></tr><tr><td>Rope</td><td>M Recht Accessories</td><td>C323C/W</td><td>Used to provide sucrose solution to adults. Other brands may be used. Web address: https://mrecht.com.au/haberdashery/braids-cords-and-tapes/cords/plaited-cord/cotton/</td></tr><tr><td>Plastic cup (large)</td><td></td><td></td><td>Used as an oviposition container. Any plastic cup that holds 100 mL of water should be suitable</td></tr><tr><td>Sandpaper</td><td>Norton Master Painters</td><td>CE015962</td><td>Provided as an oviposition substrate. Alternative products may be used, but we use this brand because it is relatively odorless. Lighter colors are used for contrast with eggs. Web address: https://www.bolt.com.au/115mm-36m-master-painters-bulk-roll-p80-medium-p-9396.html</td></tr><tr><td>Filter paper</td><td>Whatman</td><td>1001-150</td><td>Used as an alternative oviposition substrate. Other brands may be used</td></tr><tr><td>Latex gloves</td><td>SemperGuard</td><td>Z560979</td><td>Prevents mosquito bites on hands when blood feeding. Other brands may be used. Web address: http://www.sempermed.com/en/products/detail/semperguardR_latex_puderfrei_innercoated/</td></tr></tbody></table>

maintaining aedes aegypti mosquitoes infected with wolbachia

Os mosquitos Aedes aegypti infectados experimentalmente com Wolbachia estão sendo utilizados em programas para controlar a propagação de arbovírus como dengue, chikungunya e Zika. Wolbachia-mosquitos infectados podem ser lançados no campo também reduzir tamanhos de população através de acasalamentos incompatíveis ou transformar as populações com mosquitos que são refratários a transmissão do vírus. Para estas estratégias ter sucesso, os mosquitos liberados no campo do laboratório devem ser do competidor com mosquitos nativos. No entanto, manter os mosquitos no laboratório pode resultar em endogamia, deriva genética e adaptação de laboratório que pode reduzir sua aptidão no campo e pode confundir os resultados de experimentos. Para testar a adequação de diferentes infecções Wolbachia para implantação no campo, é necessário manter os mosquitos em um ambiente de laboratório controlado através de várias gerações. Descreveremos um protocolo simples para manter mosquitos Ae. aegypti em laboratório, que é apropriado para ambos Wolbachia-mosquitos infectados e selvagem-tipo. Os métodos de minimizar a adaptação de laboratório e implementam cruzamento para aumentar a relevância das experiências para mosquitos de campo. Além disso, colônias são mantidas em condições óptimas para maximizar a sua aptidão para lançamentos de campo aberto.

A Figura 4 demonstra os efeitos da nutrição de qualidade inferior no desenvolvimento de larvas de Ae. aegypti . Quando recipientes são fornecidos com 0,25 mg de alimento por larvas por dia ou menos, o tempo de desenvolvimento aumenta para machos e fêmeas, e é menos síncrona do que em recipientes munida de 0,5 mg de comida. Se não for fornecida para uma alimentação adequada durante toda a duração do desenvolvimento larval, isto poderia ter ...

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Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Manter o Aedes aegypti , mosquitos infectados com Wolbachia

Os mosquitos Aedes aegypti infectados com Wolbachia estão sendo liberados em populações naturais para suprimir a transmissão de arbovírus. Descrevemos métodos para traseira Ae. aegypti com Wolbachia infecções no laboratório para experiências e lançamento de campo, tomando as precauções para minimizar a seleção e adaptação de laboratório.

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

14.1K visualizações.  Bio21 Institute and University of Melbourne. Os mosquitos Aedes aegypti infectados com Wolbachia estão sendo liberados em populações naturais para suprimir a transmissão de arbovírus. Descrevemos métodos para traseira Ae. aegypti com Wolbachia infecções no laboratório para experiências e lançamento de campo, tomando as precauções para minimizar a seleção e adaptação de laboratório.

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Mass Production of Genetically Modified Aedes aegypti for Field Releases in Brazil

New techniques and methods are being sought to try to win the battle against mosquitoes. Recent advances in molecular techniques have led to the development of new and innovative methods of mosquito control based around the Sterile Insect Technique (SIT)1-3. A control method known as RIDL&#160;(Release of Insects carrying a Dominant Lethal)4, is based around SIT, but uses genetic methods to remove the need for radiation-sterilization5-8. A RIDL&#160;strain of Ae. aegypti was successfully tested in the field in Grand Cayman9,10; further field use is planned or in progress in other countries around the world.
Mass rearing of insects has been established in several insect species and to levels of billions a week. However, in mosquitoes, rearing has generally been performed on a much smaller scale, with most large scale rearing being performed in the 1970s and 80s. For a RIDL&#160;program it is desirable to release as few females as possible as they bite and transmit disease. In a mass rearing program&#160;there are several stages to produce the males to be released: egg production, rearing eggs until pupation, and then sorting males from females before release. These males are then used for a RIDL&#160;control program,&#160;released as either pupae or adults11,12.
To suppress a mosquito population using RIDL&#160;a large number of high quality male adults need to be reared13,14. The following describes the methods for the mass rearing of OX513A, a RIDL&#160;strain of Ae. aegypti 8, for release and covers the techniques required for the production of eggs and mass rearing RIDL&#160;males for a control program.

Mass Production of Genetically Modified Aedes aegypti for Field Releases in Brazil

To achieve population suppression of Aedes aegypti using the RIDL&#174; (Release of Insects carrying a Dominant Lethal) system, large numbers of male mosquitoes need to be released. This requires the use of mass rearing techniques and technology to provide reliable systems to obtain the maximum number of high quality male mosquitoes.

Produção em massa de Aedes aegypti geneticamente modificado para lançamentos de campo no Brasil

New techniques and methods are being sought to try to win the battle against mosquitoes. Recent advances in molecular techniques have led to the ...

Ambiente

Maintaining Wolbachia in Cell-free Medium

In this video protocol, procedures are demonstrated to (1) purify Wolbachia symbionts out of cultured mosquito cells, (2) use a fluorescent assay to ascertain the viability of the purified Wolbachia and (3) maintain the now extracellular Wolbachia in cell-free medium.  Purified Wolbachia remain alive in the extracellular phase but do not replicate until re-inoculated into eukaryotic cells.  Extracellular Wolbachia purified in this manner will remain viable for at least a week at room temperature, and possibly longer.  Purified Wolbachia are suitable for micro-injection, DNA extraction and other applications. 


This video describes a method for purifying Wolbachia pipientis from an Anopheles gambiae cell line and then culturing the endosymbiont in cell-free medium. An assay for viability of the bacterium is demonstrated.

Manutenção de Wolbachia em Cell-livre Médio

In this video protocol, procedures are demonstrated to (1) purify Wolbachia symbionts out of cultured mosquito cells, (2) use a fluorescent assay to ...

Biologia

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, Eastern equine encephalitis, lymphatic filariasis, and Saint Louis encephalitis. Notably, avian malaria has played a major role in the extinction of numerous endemic island bird species, while WNV has become an important vector-borne disease in the United States. To gain further insight into C. quinquefasciatus biology and expand their genetic control toolbox, we need to develop more efficient and affordable methods for genome engineering in this species. However, some biological traits unique to Culex mosquitoes, particularly their egg rafts, have made it difficult to perform microinjection procedures required for genome engineering. To address these challenges, we have developed an optimized embryo microinjection protocol that focuses on mitigating the technical obstacles associated with the unique characteristics of Culex mosquitoes. These procedures demonstrate optimized methods for egg collection, egg raft separation and other handling procedures essential for successful microinjection in C. quinquefasciatus. When coupled with the CRISPR/Cas9 genome editing technology, these procedures allow us to achieve site-specific, efficient and heritable germline mutations, which are required to perform advanced genome engineering and develop genetic control technologies in this important, but currently understudied, disease vector.

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

This protocol describes microinjection procedures for Culex quinquefasciatus embryos that are optimized to work with CRISPR/Cas9 gene editing tools. This technique can efficiently generate site-specific, heritable, germline mutations that can be used for building genetic technologies in this understudied disease vector.

Técnicas de microinjeção de embriões para mutagênese específica do local eficiente em Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, ...

Genética

Small-Cage Laboratory Trials of Genetically-Engineered Anopheline Mosquitoes

Control of mosquito-borne pathogens using genetically-modified vectors has been proposed as a promising tool to complement conventional control strategies. CRISPR-based homing gene drive systems have made transgenic technologies more accessible within the scientific community. Evaluation of transgenic mosquito performance and comparisons with wild-type counterparts in small laboratory cage trials provide valuable data for the design of subsequent field cage experiments and experimental assessments to refine the strategies for disease prevention. Here, we present three different protocols used in laboratory settings to evaluate transgene spread in anopheline mosquito vectors of malaria. These include inundative releases (no gene-drive system), and gene-drive overlapping and non-overlapping generation trials. The three trials vary in a number of parameters and can be adapted to desired experimental settings. Moreover, insectary studies in small cages are part of the progressive transition of engineered insects from the laboratory to open field releases. Therefore, the protocols described here represent invaluable tools to provide empirical values that will ultimately aid field implementation of new technologies for malaria elimination.

The protocols reported here illustrate three alternative ways to assess the performance of genetically-engineered mosquitoes destined for vector control in laboratory-contained small cage trials. Each protocol is tailored to the specific modification the mosquito strain bears (gene drive or non-gene drive) and the types of parameters measured.

Ensaios laboratoriais de pequenas gaiolas de mosquitos anofelina geneticamente modificados

Control of mosquito-borne pathogens using genetically-modified vectors has been proposed as a promising tool to complement conventional control ...

Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines

As a maternally harbored endosymbiont, Wolbachia infects large proportions of insect populations. Studies have recently reported the successful regulation of RNA virus transmission using Wolbachia-transfected mosquitoes. Key strategies to control viruses include the manipulation of host reproduction via cytoplasmic incompatibility and the inhibition of viral transcripts via immune priming and competition for host-derived resources. However, the underlying mechanisms of the responses of Wolbachia-transfected mosquitoes to viral infection are poorly understood. This paper presents a protocol for the in vitro identification of Wolbachia infection at the nucleic acid and protein levels in Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Aa23 cells to enhance the understanding of the interactions between Wolbachia and its insect vectors. Through the combined use of polymerase chain reaction (PCR), quantitative PCR, western blot, and immunological analytical methods, a standard morphologic protocol has been described for the detection of Wolbachia-infected cells that is more accurate than the use of a single method. This approach may also be applied to the detection of Wolbachia infection in other insect taxa.

Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines

Four methods were used to detect intracellular Wolbachia, which complemented each other and improved the detection accuracy of Wolbachia infection of Aedes albopictus-derived Aa23 and Aa23-T&#160;cured of native Wolbachia infection using antibiotics.

Detectando wolbachia strain wAlbb em linhas celulares Aedes albopictus

As a maternally harbored endosymbiont, Wolbachia infects large proportions of insect populations. Studies have recently reported the successful regulation ...

Imunologia e Infecção

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, most notably developmental arrest and reduced metabolism. Global gene expression profiling via RNA-Seq can provide important insights into the transcriptional mechanisms of photoperiodic diapause. The Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, is an outstanding organism for studying the transcriptional bases of diapause due to its ease of rearing, easily induced diapause, and the genomic resources available. This manuscript presents a general experimental workflow for identifying diapause-induced transcriptional differences in A. albopictus. Rearing techniques, conditions necessary to induce diapause and non-diapause development, methods to estimate percent diapause in a population, and RNA extraction and integrity assessment for mosquitoes are documented. A workflow to process RNA-Seq data from Illumina sequencers culminates in a list of differentially expressed genes. The representative results demonstrate that this protocol can be used to effectively identify genes differentially regulated at the transcriptional level in A. albopictus due to photoperiodic differences. With modest adjustments, this workflow can be readily adapted to study the transcriptional bases of diapause or other important life history traits in other mosquitoes.

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

RNA-Seq analyses are becoming increasingly important for identifying the molecular underpinnings of adaptive traits in non-model organisms. Here, a protocol to identify differentially expressed genes between diapause and non-diapause Aedes albopictus mosquitoes is described, from mosquito rearing, to RNA sequencing and bioinformatics analyses of RNA-Seq data.

Uma Experimental e Bioinformática Protocolo de Análises de RNA-seq de fotoperiódicas diapausa no Tigre Asiático Mosquito,<em&gt; Aedes albopictus</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

Improved Fecundity and Fertility Assay for Aedes aegypti using 24 Well Tissue Culture Plates (EAgaL Plates)

Mosquitoes represent a significant public health problem as vectors of various pathogens. For those studies that require an assessment of mosquito fitness parameters, in particular egg production and hatch rates at the individual level, conventional methods have put a substantial burden on investigators due to high labor intensity and laboratory space requirements. Described is a simple method using 24 well tissue culture plate with agarose in each well and digital imaging of each well to determine egg numbers and hatch rates at an individual level with substantially reduced time and space requirements.

Improved Fecundity and Fertility Assay for Aedes aegypti using 24 Well Tissue Culture Plates EAgaL Plates

Described is a time and space-saving method to count eggs and determine hatch rates of individual mosquitoes using 24 well tissue culture plates, which can substantially increase the scale and speed of fecundity and fertility assays.

Ensaio melhorado de fecundidade e fertilidade para a Aedes aegypti usando 24 placas de cultura de tecido poço (placas EAgaL)

Mosquitoes represent a significant public health problem as vectors of various pathogens. For those studies that require an assessment of mosquito fitness ...

Preparing Irradiated and Marked Male Aedes aegypti Mosquitoes for Release in an Operational Sterile Insect Technique Program

The control of such human diseases as dengue, Zika, and chikungunya relies on the control of their vector, the Aedes aegypti mosquito, because there is no prevention. Control of mosquito vectors can rely on chemicals applied to the immature and adult stages, which can contribute to the mortality of non-targets and more importantly, lead to insecticide resistance in the vector. The sterile insect technique (SIT) is a method of controlling populations of pests through the release of sterilized adult males that mate with wild females to produce non-viable offspring. This paper describes the process of producing sterile males for use in an operational SIT program for the control of Aedes aegypti mosquitoes. Outlined here are the steps used in the program including rearing and maintaining a colony, separating male and female pupae, irradiating and marking adult males, and shipping Aedes aegypti males to the release site. Also discussed are procedural caveats, program limitations, and future objectives.

Preparing Irradiated and Marked Male Aedes aegypti Mosquitoes for Release in an Operational Sterile Insect Technique Program

The sterile insect technique (SIT) is used to control specific, medically important mosquito populations that may be resistant to chemical controls. Here, we describe a method of mass rearing and preparation of sterile male mosquitoes for release in an operational SIT program targeting the Aedes aegypti mosquito.

Preparando mosquitos Aedes aegypti machos irradiados e marcados para liberação em um Programa Operacional de Técnica de Insetos Estéreis

The control of such human diseases as dengue, Zika, and chikungunya relies on the control of their vector, the Aedes aegypti mosquito, because there is no ...

Using the Fluorescent Dye, Rhodamine B, to Study Mating Competitiveness in Male Aedes aegypti Mosquitoes

The success of sterile or incompatible insect technique-based population suppression programs depends on the ability of released males to compete for wild-type females and induce sterility in the target population. Hence, laboratory assessment of male mating competitiveness is essential for evaluating the release strain&#8217;s fitness before field release. Conventionally, such an assay is performed by determining the proportion of viable eggs produced by the females after being simultaneously exposed to two sets of males (wild-type and release strains) for copulation. However, this process is time-consuming and laborious due to the need to first blood-feed the females for egg production and then hatch and enumerate the hatched eggs to determine egg viability.&#160;
Moreover, this method cannot discern the degree of competitiveness between two sterile or Wolbachia-infected mosquito lines as wild-type female mosquitoes will only produce non-viable eggs upon mating with both. To circumvent these limitations, this paper describes a more direct method of measuring male mosquito mating competitiveness in laboratory settings using the fluorescent dye, rhodamine B (RhB), which can be used to mark males by feeding them in sucrose solution containing RhB. After the mating assay, the presence of fluorescing sperms in the spermathecae of a female can be used to determine her mating partner. This method is cost-effective, reduces the experimental time by 90% and allows comparison of mating fitness between two sterile or Wolbachia-infected lines.&#160;

Using the Fluorescent Dye, Rhodamine B, to Study Mating Competitiveness in Male Aedes aegypti Mosquitoes

Here, we present a protocol for studying mating competitiveness of male Aedes aegypti using fluorescent dye as a marker. Female mosquitoes are exposed to both marked and unmarked males for copulation. Post mating, their spermathecae are examined under a fluorescence microscope to determine their mating partner.

Usando o Corante Fluorescente, Rhodamine B, para estudar competitividade do acasalamento em mosquitos Aedes aegypti masculinos

The success of sterile or incompatible insect technique-based population suppression programs depends on the ability of released males to compete for ...

Quantifying Fitness Costs in Transgenic Aedes aegypti Mosquitoes

Transgenic mosquitoes often display fitness costs compared to their wild-type counterparts. In this regard, fitness cost studies involve collecting life parameter data from genetically modified mosquitoes and comparing them to mosquitoes lacking transgenes from the same genetic background. This manuscript illustrates how to measure common life history traits in the mosquito Aedes aegypti, including fecundity, wing size and shape, fertility, sex ratio, viability, development times, male contribution, and adult longevity. These parameters were chosen because they reflect reproductive success, are simple to measure, and are commonly reported in the literature. The representative results quantify fitness costs associated with either a gene knock-out or a single insertion of a gene drive element. Standardizing how life parameter data are collected is important because such data may be used to compare the health of transgenic mosquitoes generated across studies or to model the transgene fixation rate in a simulated wild-type mosquito population. Although this protocol is specific for transgenic Aedes aegypti, the protocol may also be used for other mosquito species or other experimental treatment conditions, with the caveat that certain biological contexts may require special adaptations.

Quantifying Fitness Costs in Transgenic Aedes aegypti Mosquitoes

The present protocol describes how to measure common life parameter data in Aedes aegypti mosquitoes, including fecundity, wing size, fertility, sex ratio, viability, development times, male contribution, and adult longevity. These measurements can be used to assess the fitness of transgenic mosquitoes.

Quantificando os custos de aptidão em mosquitos Aedes aegypti transgênicos

Transgenic mosquitoes often display fitness costs compared to their wild-type counterparts. In this regard, fitness cost studies involve collecting life ...