KO e AC são suportados por uma bolsa e uma bolsa de estudos da Associação Americana do Coração. SIB e RB são suportados por concessões do NIH.

<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1435/SOHA_overview.pdf">Clique aqui para ver uma visão geral dos batimentos cardíacos semi automatizado de análise procedimento (SOHA).</a> Semi-automático de análise batimentos cardíacos óptico 1. Preprocess - Esta etapa fornece informações sobre os diâmetros cardíaca diastólica e sistólica. Bordas cardíacas são identificadas e marcadas durante a diástole e sístole máximas. Gravações ópticas podem ser avançados em velocidades lentas e até mesmo um fotograma de cada vez que permite a identificação precisa dos quadros onde contração máxima e relaxamento do coração ocorrer. Um par de marcas de identificação das bordas diastólica e um par identificar as bordas sistólica são feitas. Marcas também podem ser feitas em duplicado, em diferentes locais horizontal ao longo do coração. Os diâmetros cardíaca obtida nesta etapa também são usados ​​para calcular uma medida adicional que fornece uma estimativa da contratilidade do coração. Esta medida é a redução fracionária por cento (% FS) e representa a medida em que as bordas do coração se deslocando em direção ao outro durante uma contração. A fórmula utilizada para calcular FS% é: ((Diâmetro (diastólica - diâmetro sistólica) / diâmetro diastólico) x 100) Nota - Os pontos identificados neste conjunto são utilizados apenas para medições de diâmetro e encurtamento e não são utilizados para a detecção de movimento. Exemplo: (. Cammarato, et al 2008) Em Drosophila, mutações pontuais no domínio da miosina de cadeia pesada de transdutor, uma região conhecida para modular a atividade enzimática do motor, resultam em corações que estão dilatados ou restrito, dependendo se eles suprimir ou aumentar a atividade da miosina de ATPase . Estes tipos de medições não pode ser feita em moscas intacta, uma vez que geralmente não é possível identificar as bordas do coração em todo o comprimento do tubo cardíaco através da cutícula e da gordura, (compare tipo selvagem, D45 e Mhc5 M-modos em &quot;modo-M Figura &quot;abaixo) que normalmente cercam o coração. Medições feitas ao visualizar o coração em moscas intacta com outros métodos comumente empregados são geralmente restrito à porção mais anterior do coração, a região câmara cônica. Também não é possível obter esta medida dinâmica no tecido fixo. 2. Detecção de movimento Este passo é feito automaticamente pelo programa e utiliza dois algoritmos diferentes para analisar o movimento em cada filme. Resumidamente, o primeiro algoritmo, o &quot;Quadro Média Darkness&quot; algoritmo usa um quadro de abordagem frame. Este algoritmo de médias a intensidade escuridão para um quadro do filme inteiro, normaliza o valor para um intervalo entre 0 e 1, e parcelas a média normalizada para cada frame do filme ao longo do tempo. A segunda abordagem, o &quot;pixel a pixel&quot; algoritmo, analisa a mudança na escuridão de todos os pixels individuais de um quadro para o próximo. Pixels que apresentam alterações de intensidade acima de um limite pré-são somados para cada quadro e plotados para cada frame do filme ao longo do tempo. 3. Verifique Intervalos- A saída dos dois algoritmos de detecção de movimento é exibido neste módulo com o &quot;Average Darkness&quot; saída exibida em uma janela acima do &quot;Pixel por pixel&quot; janela de saída. , A fim de ter certeza de que os intervalos de detecção de movimento em concordar com o filme real exibimos uma vantagem traço ou M-mode feito a partir dos quadros de ser analisados ​​diretamente abaixo das janelas de saída do algoritmo. O modo-M é feita por corte fatias digitalmente um pixel de largura através do coração de cada quadro no filme e alinhando-as na horizontal para fornecer um instantâneo dos movimentos do coração borda ao longo do tempo. No &quot;Pixel por pixel&quot; janela os intervalos identificados diastólica são indicados por uma linha horizontal verde com o número de quadros que contribuem para esse intervalo imediatamente acima. Intervalos sistólicos são identificados como o intervalo entre duas diástoles sucessivas. O início de uma sístole é indicado no modo-M por uma linha vertical azul e no final é indicado por uma linha vertical vermelha. Com esta exposição é relativamente fácil de ver se a saída algoritmo concorda com os movimentos do coração real. Apesar de detecção de movimento é realizado automaticamente a saída deve ser verificado a exatidão. Existem várias razões para isso: uma é que muitas vezes há um subjacente, a flutuação de ondas lentas nos níveis de luz não relacionados com o movimento do coração. Isto normalmente pode ser eliminada por utilização de um construído em filtro passa alta. A segunda razão tem a ver com a sensibilidade do &quot;Pixel por pixel&quot; abordagem. A saída desse algoritmo é normalmente de dois traços movimento, um para o movimento de contração e um para o movimento de relaxamento. Em moscas mais velhas e, em alguns mutantes o período de tempo entre esses dois movimentos<html> torna-se relativamente longo eo programa tenta interpretar os dois movimentos como duas batidas separadas. Isso pode ser corrigido fazendo o programa para comparar a saída da Pixel por Pixel algoritmo com a do algoritmo Média Quadro Darkness, clicando em &quot;Use trevas&quot; caixa. Exemplo (veja vídeo): Em 5-7 semanas de idade voa a intervalos sistólicos são tipicamente muito mais do que em moscas jovens. Estes longos intervalos são inicialmente detectadas como duas contrações separadas por um curto diástole. Isso pode ser corrigido selecionando a opção &quot;Use trevas&quot; caixa de seleção. Neste caso, o programa irá comparar o intervalo diastólica identificada pela Pixel por Pixel algoritmo com a média de saída de quadros Darkness. Se a saída Trevas Média quadro tem um valor positivo, então qualquer intervalo diastólica identificada na Pixel por Pixel algoritmo será ignorado e os intervalos serão especificados corretamente. O filme inteiro podem ser digitalizados em 10 segmentos segundo e aceite (clique em &quot;OK Dados&quot;) ou rejeitada (clique em &quot;Discard Dados&quot;). O Hi Lo e sensibilidades passar filtro pode ser ajustado manualmente para ajudar a definir com mais precisão intervalos contração quando se emprega o algoritmo Darkness. 4. Estatísticas de saída Uma vez que a saída para um filme dado foi aceite o programa vai usar essa informação para calcular automaticamente uma série de parâmetros. Estes incluem intervalo diastólica e sistólica, período do coração e da freqüência cardíaca, direção e velocidade da onda de contração FS, diâmetros coração, e%. Além disso, o programa tem vários métodos para quantificar arrhythmicity refletindo contração não-uniforme e ciclos de relaxamento (ver Fink et al, 2009). Produção de estatísticas é fornecido para cada filme individualmente e para os dados de todo o conjunto na forma de um valor separado por vírgula (. Csv) que pode ser aberto em programas de planilhas como o Microsoft Excel. Tabela 1 - <img src="/files/ftp_upload/1435/1435table1.jpg" alt="table1" /> Um exemplo da saída gerada pelo programa de análise semi-automatizada Optical Coração. 5. Atualize-Histogramas Esta parte do programa apresenta todos os dados em intervalos de coração por um conjunto de dados em formato de histograma. Como as taxas são variáveis ​​coração que normalize os dados de saída do histograma. No entanto, porque a distribuição dos intervalos não é simétrica em torno de um significa que usar o valor do intervalo médio para o nosso normalização. Exemplo (veja vídeo): Moscas que são mutantes para o canal de potássio KCNQ mostram extremamente irregular intervalos diastólica e sistólica. Tipicamente, a intervalos sistólicos são muito mais longos e mais irregular do que na mesma faixa etária moscas do tipo selvagem. Isso pode ser claramente visto, exibindo os dados no formato de histograma (ver também Ocorr et al. 2007). 6. M-mode- Este módulo gera M-modos que podem ser feitas a partir de qualquer posição ao longo do coração no quadro do filme. O comprimento do modo-M também pode ser especificado. M-modos são úteis para mostrar qualitativamente o que o coração está fazendo em um filme. Exemplo (veja vídeo): Filme de um coração zebrafish três dias de idade larval mostrando o ventrículo anterior que é usado para gerar um modo-M. A fatia vertical de pixels que será extirpado por via electrónica a partir de cada quadro do filme é indicado por uma linha vermelha. M-mode Figura: Exemplos de M-modos de Drosophila e zebrafish. Uma das mutações miosina discutido nos resultados da etapa Preprocess em um motor molecular com cinética mais rápida da enzima, resultando em restrição de coração e, ocasionalmente, um bloco de condução. Ambos os parâmetros podem ser mostrados qualitativa utilizando M-modos. <img src="/files/ftp_upload/1435/1435fig1.jpg" alt="M-modos Exemplos" /> M-modos feitas na mesma porção do coração em ambos os tipo selvagem e moscas mutantes mostram claramente o fenótipo restrito no Mhc 5 mutantes e os diâmetros dilatada e os ciclos de contração arrítmicos do mutante D45 (que expressa miosina com cinética enzimática deprimido) (modificada de Cammarato et. al, 2008). M-mode feita a partir de um coração Zebrafish larval mostrando o ventrículo anterior (filme mesmo coração, como mostrado na demonstração, Fink et.al. 2009). 7. Red Dot-Movie Este módulo produz automaticamente um retardado (1:4), 20 segunda versão de um filme analisado, mostrando todos os pixels que são identificados como mudança na cor vermelha. Este recurso é usado principalmente para fins de ilustração. Filme 1 - Um &quot;filme red dot&quot;, mostrando os pixels que são identificados como tendo alterações de intensidade escuridão pelos algoritmos de programa em vermelho. A velocidade do filme é lento a partir do original por um fator de 4. w.jove.com/files/ftp_upload/1435/redmove.avi &quot;&gt; Clique aqui para baixar Filme 1. 8. Aplicações adicionais- Começamos a aplicar este sistema de análise de filmes de alta velocidade de outros modelos com corações pequenos que muitas vezes são difíceis de analisar utilizando a metodologia tradicional. Nós temos aplicado com sucesso essa análise para ambos os corações zebrafish larval e corações embrionárias de camundongos (Fink et al, 2009). Filme 2 - filme rato coração mais figura com intervalos de verificação com saída de dados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1435/Mouse%20heart%20clip%201.avi">Clique aqui para baixar Filme 2.</a> <img src="/files/ftp_upload/1435/1435fig2.jpg" alt="Verifique Intervalos Coração rato" />

<ol>
	<li>Cammarato, A., Dambacher, C. M., Reedy, M. C., Knowles, A. F., Kronert, W. A., Bodmer, R., Ocorr, K., Bernstein, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+Transducer+mutations+differentially+affect+motor+function,+myofibril+structure,+and+the+performance+of+skeletal+and+cardiac+muscles.">Myosin Transducer mutations differentially affect motor function, myofibril structure, and the performance of skeletal and cardiac muscles.</a> Mol Biol Cell. 19 (2), 553-562 (2008).</li><li>Ocorr, K., Reeves, N., Wessells, R. J., Fink, M., Chen, H. -. S. V., Akasaka, T., Yasuda, S., Metzger, J., Giles, W., Posakony, J. W., Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KCNQ+potassium+channel+mutations+cause+cardiac+arrhythmias+in+Drosophila+that+mimic+the+effects+of+aging.">KCNQ potassium channel mutations cause cardiac arrhythmias in Drosophila that mimic the effects of aging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 3943-3948 (2007).</li><li>Fink, M., Callol-Massot, C., Chu, A., Ruiz-Lozano, P., Izpisua Belmonte, J. C., Giles, W., Bodmer, R., Ocorr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+detection+and+quantification+of+heartbeat+parameters+in+Drosophila,+zebrafish+and+embryonic+mouse+hearts.">A new method for the detection and quantification of heartbeat parameters in Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts.</a> Biotechniques. 46, 101-113 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

O modelo de Drosophila provou ser uma poderosa ferramenta genética que tem sido utilizado para tratar uma variedade de questões científicas que vão desde desenvolvimento embrionário para a aprendizagem e memória. Recentemente, este organismo modelo versátil, tem sido usado para investigar a genética da função cardíaca. Uma série de tentativas para quantificar a fisiologia do coração em adultos Drosophila têm contado com observações feitas em moscas intacta através da cutícula abdominal. A maioria dess...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>MatLab software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Math Works, Inc</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Required environment for the analysis software.</td>
</tr>
<tr>
<td>EM-CCD digital camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamamatsu Corp.</td>
<td>9100 or 9300</td>
<td>Other high speed digital cameras will also work.</td>
</tr>
<tr>
<td>HC image data capture software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamamatsu Corp.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Other image capture software that produces movies in avi format will also work.</td>
</tr>
<tr>
<td>Light Microscope with 10x objective </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>A dipping lens that eliminates the air water interface greatly improves resolution</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

semi-automated optical heartbeat analysis of small hearts

Nós desenvolvemos um método para analisar gravações ópticas de alta velocidade a partir de<em&gt; Drosophila</em&gt;, Peixe-zebra e corações embrionárias de camundongos (Fink, et. Al., 2009). Nosso semi-automático de análise de pulsação óptica (SOHA) utiliza um algoritmo de detecção de movimento que novela é capaz de detectar movimentos cardíacos associados com contráteis individuais e eventos relaxamento. O programa oferece uma série de leituras fisiologicamente relevantes, incluindo pressão arterial sistólica e diastólica intervalos, a freqüência cardíaca, bem como medidas qualitativas e quantitativas de arrhythmicity batimento cardíaco. O programa também calcula medições de diâmetro do coração durante a diástole e sístole tanto a partir do qual fração de encurtamento e mudanças área fracional são calculados. Saída é fornecido como um arquivo digital compatível com a maioria dos programas de planilha. As medições são feitas para cada batimento cardíaco em um registro de aumentar o poder estatístico da produção. Demonstramos cada uma das etapas em que a entrada do usuário é necessário e mostrar a aplicação da nossa metodologia para a análise da função cardíaca em todos os três modelos de coração geneticamente tratável.

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Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

Nós desenvolvemos um método semi-automático de análise Optical Heartbeat (SOHA) para analisar as gravações ópticas de alta velocidade a partir de<em&gt; Drosophila</em&gt;, Peixe-zebra e corações embrionárias de camundongos. Nós demonstramos a aplicação de nossa metodologia para a análise da função cardíaca na mosca da fruta e corações embrionárias de camundongos.

Semi-automático de análise de pulsação óptica de pequenos corações

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

semi-automated-optical-heartbeat-analysis-of-small-hearts

Research

JoVE Journal

Biology

12.1K visualizações.  The Sanford Burnham Institute for Medical Research. Nós desenvolvemos um método semi-automático de análise Optical Heartbeat (SOHA) para analisar as gravações ópticas de alta velocidade a partir de Drosophila, Peixe-zebra e corações embrionárias de camundongos. Nós demonstramos a aplicação de nossa metodologia para a análise da função cardíaca na mosca da fruta e corações embrionárias de camundongos.

Vídeo: Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Cuidados e limpeza do microscópio

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Biologia

Major Components of the Light Microscope

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

Componentes principais do microscópio de luz

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by Zernike, in 1942, who received the Nobel prize for his achievement. DIC microscopy, introduced in the late 1960s, has been popular in biomedical research because it highlights edges of specimen structural detail, provides high-resolution optical sections of thick specimens including tissue cells, eggs, and embryos and does not suffer from the  phase halos  typical of phase-contrast images. This protocol highlights the principles and practical applications of these microscopy techniques.

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

This protocol highlights the principles and practical applications of Phase and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Contraste de fase e de interferência diferencial Contrast Microscopy (DIC)

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in experimental models that range in scale from cell cultures to whole-organs[1, 2]. Using state-of-the-art optical imaging systems, generation and propagation of action potentials during normal cardiac rhythm or throughout initiation and maintenance of arrhythmias can be visualized almost instantly[1]. The latest commercially-available systems can provide information at exceedingly high spatiotemporal resolutions and were based on custom-built equipment initially developed to overcome the obstacles imposed by more conventional electrophysiological methods[1]. Advancements in high-resolution and high-speed complementary metal-oxide-semiconductor (CMOS) cameras and intensely-bright, light-emitting diodes (LEDs) as well as voltage-sensitive dyes, optics, and filters have begun to make electrical signal acquisition practical for cardiovascular cell biologists who are more accustomed to working with microscopes. Although the newest generation of CMOS cameras can acquire 10,000 frames per second on a 16,384 pixel array, depending on the type of sample preparation, long-established fluorescence acquisition technologies such as photodiode arrays, laser scanning systems, and cooled charged-coupled device (CCD) cameras still have some distinct advantages with respect to dynamic range, signal-to-noise ratio, and quantum efficiency[1, 3]. In the present study, Lewis rat hearts were perfused ex vivo with a crystalloid perfusate (Krebs-Henseleit solution) at 37&deg;C on a modified Langendorff apparatus. After a 20 minute stabilization period, the hearts were intermittently perfused with 11 mMol/L 2,3-butanedione monoxime to eliminate contraction-associated motion during image acquisition. For optical mapping, we loaded hearts with the fast-response potentiometric probe di-8-ANEPPS[4] (5 &mu;Mol/L) and briefly illuminated the preparation with 475&plusmn;15 nm excitation light. During a typical 2 second period of illumination, &gt;605 nm light emitted from the cardiac preparation was imaged with a high-speed CMOS camera connected to a horizontal macroscope. For this demonstration, hearts were paced at 300 beats per minute with a coaxial electrode connected to an isolated electrical stimulation unit. Simultaneous bipolar electrographic recordings were acquired and analyzed along with the voltage signals using readily-available software. In this manner, action potentials on the surface of Langendorff-perfused rat hearts can be visualized and registered with electrographic signals.

This article describes a high temporal and spatial resolution technique to optically image action potential movement on the surface of Langendorff-perfused rat hearts using a potentiometric dye (di-8-ANEPPS).

Mapeamento óptica de corações perfundidos Langendorff-Rat

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in ...

Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

The interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to evade viral attacks that include restriction modification, abortive infection and CRISPR/Cas systems. These adaptive immune systems found in many Bacteria and most Archaea consist of clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) sequences and a number of CRISPR associated (Cas) genes (Fig. 1) 1-3. Different sets of Cas proteins and repeats define at least three major divergent types of CRISPR/Cas systems 4. The universal proteins Cas1 and Cas2 are proposed to be involved in the uptake of viral DNA that will generate a new spacer element between two repeats at the 5' terminus of an extending CRISPR cluster 5. The entire cluster is transcribed into a precursor-crRNA containing all spacer and repeat sequences and is subsequently processed by an enzyme of the diverse Cas6 family into smaller crRNAs 6-8. These crRNAs consist of the spacer sequence flanked by a 5' terminal (8 nucleotides) and a 3' terminal tag derived from the repeat sequence 9. A repeated infection of the virus can now be blocked as the new crRNA will be directed by a Cas protein complex (Cascade) to the viral DNA and identify it as such via base complementarity10. Finally, for CRISPR/Cas type 1 systems, the nuclease Cas3 will destroy the detected invader DNA 11,12 .
These processes define CRISPR/Cas as an adaptive immune system of prokaryotes and opened a fascinating research field for the study of the involved Cas proteins. The function of many Cas proteins is still elusive and the causes for the apparent diversity of the CRISPR/Cas systems remain to be illuminated. Potential activities of most Cas proteins were predicted via detailed computational analyses. A major fraction of Cas proteins are either shown or proposed to function as endonucleases 4.
Here, we present methods to generate crRNAs and precursor-cRNAs for the study of Cas endoribonucleases. Different endonuclease assays require either short repeat sequences that can directly be synthesized as RNA oligonucleotides or longer crRNA and pre-crRNA sequences that are generated via in vitro T7 RNA polymerase run-off transcription. This methodology allows the incorporation of radioactive nucleotides for the generation of internally labeled endonuclease substrates and the creation of synthetic or mutant crRNAs. Cas6 endonuclease activity is utilized to mature pre-crRNAs into crRNAs with 5'-hydroxyl and a 2',3'-cyclic phosphate termini.

CRISPR/Cas systems mediate adaptive immunity in Bacteria and Archaea. Many Cas proteins are proposed to act as endoribonucleases acting on crRNA precursors of varying length. Here we illustrate three different approaches to generate pre-crRNA substrates for the biochemical analysis of Cas endonuclease activity.

Geração de substrato para Endonucleases de CRISPR / Cas Sistemas

The  interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of  bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to ...

LeafJ: An ImageJ Plugin for Semi-automated Leaf Shape Measurement

High throughput phenotyping (phenomics) is a powerful tool for linking genes to their functions (see review1 and recent examples2-4). Leaves are the primary photosynthetic organ, and their size and shape vary developmentally and environmentally within a plant. For these reasons studies on leaf morphology require measurement of multiple parameters from numerous leaves, which is best done by semi-automated phenomics tools5,6. Canopy shade is an important environmental cue that affects plant architecture and life history; the suite of responses is collectively called the shade avoidance syndrome (SAS)7. Among SAS responses, shade induced leaf petiole elongation and changes in blade area are particularly useful as indices8. To date, leaf shape programs (e.g. SHAPE9, LAMINA10, LeafAnalyzer11, LEAFPROCESSOR12) can measure leaf outlines and categorize leaf shapes, but can not output petiole length. Lack of large-scale measurement systems of leaf petioles has inhibited phenomics approaches to SAS research. In this paper, we describe a newly developed ImageJ plugin, called LeafJ, which can rapidly measure petiole length and leaf blade parameters of the model plant Arabidopsis thaliana. For the occasional leaf that required manual correction of the petiole/leaf blade boundary we used a touch-screen tablet. Further, leaf cell shape and leaf cell numbers are important determinants of leaf size13. Separate from LeafJ we also present a protocol for using a touch-screen tablet for measuring cell shape, area, and size. Our leaf trait measurement system is not limited to shade-avoidance research and will accelerate leaf phenotyping of many mutants and screening plants by leaf phenotyping.

Demonstration of key methods for high throughput leaf measurements. These methods can be used to accelerate leaf phenotyping when studying many plant mutants or otherwise screening plants by leaf phenotype.

LeafJ: um plugin ImageJ para semi-automatizado de medição forma de folha

High throughput phenotyping (phenomics) is a powerful tool for linking genes to their functions (see review1 and recent examples2-4). Leaves are the ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are frequently used to identify chemicals that modulate gene expression. Chemical screens that assay fluorescence in live zebrafish often rely on expensive, specialized equipment for high content screening. We describe a procedure using a standard epifluorescence microscope with a motorized stage to automatically image zebrafish embryos and detect tissue-specific fluorescence. Using transgenic zebrafish that report estrogen receptor activity via expression of GFP, we developed a semi-automated procedure to screen for estrogen receptor ligands that activate the reporter in a tissue-specific manner. In this video we describe procedures for arraying zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in a 96-well plate and adding small molecules that bind estrogen receptors. At 72-96 hpf, images of each well from the entire plate are automatically collected and manually inspected for tissue-specific fluorescence. This protocol demonstrates the ability to detect estrogens that activate receptors in heart valves but not in liver.

Described here is a protocol for semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos.

Imagem semi-automatizada de Fluorescência de tecidos específicos em embriões Zebrafish

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

Isolation of Cardiomyocytes from Fixed Hearts for Immunocytochemistry and Ploidy Analysis

The adult mammalian heart is composed of various cell types including cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts. Since it is difficult to reliably identify nuclei of cardiomyocytes on histological sections, many groups rely on isolating viable cardiomyocytes prior to fixation to perform immunostaining. However, these live cardiomyocyte isolation techniques require optimization to maximize the yield, viability and quality of the samples, with inherent fluctuations from sample to sample despite maximum optimization. Here, we report a reproducible protocol, involving fixation prior to enzymatic digestion of the heart, which leads to maximum yield while preserving the in vivo morphology of individual cardiomyocytes. We further developed an automated analysis platform to determine the number of nuclei and DNA content per nucleus for individual cardiomyocytes. After exposing the chest cavity, the heart was arrested in diastole by perfusion with 60 mM KCl in PBS. Next, the heart was fixed in 4% paraformaldehyde (PFA) solution, and then digested with 60 mg/mL collagenase solution. After digestions, cells were singularized by trituration, and the cardiomyocyte fraction was enriched via differential centrifugation. Isolated cardiomyocytes were stained for Troponin T and &#945;-actinin to assess purity of the obtained population. Furthermore, we developed an image analysis platform to determine cardiomyocyte nucleation and ploidy status following DAPI staining. Image based ploidy assessments led to consistent and reproducible results. Thus, with this protocol, it is possible to preserve native morphology of individual cardiomyocytes to allow immunocytochemistry and DNA content analysis while achieving maximum yield.

The goal of this work is to develop a method to reproducibly isolate cardiomyocytes from the adult heart and measure DNA content and nucleation.

Isolamento de Cardiomiócitos de Corações Fixos para Imunocitoquímica e Análise ploidy

The adult mammalian heart is composed of various cell types including cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts. Since it is difficult to reliably ...

Quantitative Analysis of Viscoelastic Properties of Red Blood Cells Using Optical Tweezers and Defocusing Microscopy

The viscoelastic properties of erythrocytes have been investigated by a range of techniques. However, the reported experimental data vary. This is not only attributed to the normal variability of cells, but also to the differences in methods and models of cell response. Here, an integrated protocol using optical tweezers and defocusing microscopy is employed to obtain the rheological features of red blood cells in the frequency range of 1 Hz to 35 Hz. While optical tweezers are utilized to measure the erythrocyte-complex elastic constant, defocusing microscopy is able to obtain the cell height profile, volume, and its form factor a parameter that allows conversion of complex elastic constant into complex shear modulus. Moreover, applying a soft glassy rheology model, the scaling exponent for both moduli can be obtained. The developed methodology allows to explore the mechanical behavior of red blood cells, characterizing their viscoelastic parameters, obtained under well-defined experimental conditions, for several physiological and pathological conditions.

Here, an integrated protocol based on optical tweezers and defocusing microscopy is described to measure the rheological properties of cells. This protocol has wide applicability in studying the viscoelastic properties of erythrocytes under variable physio-pathological conditions.

Análise quantitativa das propriedades viscoelásticas das hemácias utilizando pinças ópticas e microscopia desfocagem

The viscoelastic properties of erythrocytes have been investigated by a range of techniques. However, the reported experimental data vary. This is not ...

Isolamento Semi-Automatizado de Tecido Adiposo Branco Murino

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their mechanisms. Immortalized white preadipocyte cell lines are publicly available and widely used. However, the emergence of beige adipocytes in white adipose tissue in response to external cues is difficult to recapitulate to the full extent using publicly available white adipocyte cell lines. Isolation of the stromal vascular fraction (SVF) from murine adipose tissue is commonly executed to obtain primary preadipocytes and perform adipocyte differentiation. However, mincing and collagenase digestion of adipose tissue by hand can result in experimental variation and is prone to contamination. Here, we present a modified semi-automated protocol that utilizes a tissue dissociator for collagenase digestion to achieve easier isolation of the SVF, with the aim of reducing experimental variation, reducing contamination, and increasing reproducibility. The obtained preadipocytes and differentiated adipocytes can be used for functional and mechanistic analyses.

Autor em destaque: Isolamento semi-automatizado da fração vascular estromal do tecido adiposo branco murino usando um dissociador de tecido  

This protocol describes the semi-automated isolation of the stromal vascular fraction (SVF) from murine adipose tissue to obtain preadipocytes and achieve adipocyte differentiation in vitro. Using a tissue dissociator for collagenase digestion reduces experimental variation and increases reproducibility.

Isolamento Semi-Automatizado da Fração Vascular Estromal do Tecido Adiposo Branco Murino Usando um Dissociador de Tecido

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their ...