Meu nome é Dr. Shankari Nair, e sou pós-doutorando na Divisão de Biofísica de Radiação no Departamento de Medicina Nuclear da NRF, iThemba LABS. Neste vídeo, demonstraremos o uso de um ensaio automatizado de focos Gamma H2AX em linfócitos de sangue periféricos humanos para seu uso em aplicações de simetria em lote. Os riscos de radiação para o pessoal são estritamente controlados.
A radiação ionizante afeta diretamente a estrutura do DNA induzindo quebras de DNA. Particularmente quebras de dois fios. Um dos primeiros passos no processo de reconhecimento de quebra de dupla vertente de DNA é a fospohorilização da variante histona, H2AX, e o recrutamento de proteínas de reparo.
Este vídeo descreverá o uso de microscopia para marcar o número de focos Gamma-H2AX ren-nucleus usando um sistema automatizado de varredura de slides e plataforma de análise, integrando o microscópio fluorescente. Linfócitos estão isolados de sangue inteiro. Diluir o sangue inteiro com PBS em uma proporção de um para um, em seguida, suavemente colocar o sangue diluído em um volume de gradiente de densidade médio.
Gradualmente camada o sangue segurando o tubo inclinado a 45 graus. Transfira a suspensão para uma centrífuga e gire à temperatura ambiente por 20 minutos a 900 G.Após a centrificação quatro camadas se formarem. Transfira cuidadosamente a camada nublada contendo os linfócitos em um novo tubo cônico estéril.
Lave os linfócitos com PBS e conte usando um hemócito. Uma vez determinado o número total de linfócitos, diluir o linfócito e a suspensão a uma concentração de aproximadamente 800.000 linfócitos em um mililitro de RPMI completo. As amostras estão prontas para nossa radiação.
Os linfócitos são irradiados com raios gama de uma fonte de cobalto 60, e posteriormente incubados por uma hora a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono umidificada de 5%. Para cada condição de irradiação ou tubo, três lâminas são preparadas. Coloque deslize no suporte do clipe, seguido pela placa de filtro e, finalmente, no funil.
Fixar clipes de slides e colocar na cito-centrífuga. Adicione 250 microliters da suspensão da célula em cada funil e gire por 30 G por cinco minutos. O uso da cito-centrífuga é essencial para obter condições padronizadas na automação de slides.
Uma vez girado, remova os slides do clipe e, em seguida, usando a caneta hidrofóbica, desenhe um círculo ao redor do local onde as células estão. Agora que os slides foram feitos, as células precisam ser fixadas no slide para que a coloração imunofluorescente possa ocorrer. As células são fixadas usando um paraformaldeído de 3%, ou PFA, e uma solução PBS por 20 minutos.
Após a fixação, a lavagem desliza em um frasco de Coplin com PBS por cinco minutos. Em seguida, cubra as células com Triton X para permitir a permeabilização. A etapa de permeabilização remove mais lipídios de membrana celular para permitir que anticorpos entrem no núcleo celular.
A partir de agora, utilizamos uma solução de bloqueio feita de 1%BSA no PBS, para lavar slides a fim de reduzir potenciais vinculações não específicas. Após três etapas de lavagem de 10 minutos com 1%BSA e PBS, os slides são incubados à temperatura ambiente com um a 500 anticorpos anti-gama primário h2AX por uma hora na câmara umidificante, facilmente realizado adicionando papel de tecido molhado na base da caixa de armazenamento de slides retangular. Após a incubação com um anticorpo primário, desmaia o líquido e lave novamente em uma solução de 1%BSA.
Incubar slides com um anticorpo antitc de burro secundário diluído por uma hora na câmara umidificante. Remova o anticorpo antes de realizar três lavagens de 10 minutos em PBS. Cubra o frasco de Coplin em papel alumínio para evitar a exposição à luz durante a duração das etapas de lavagem.
Remova as lâminas e limpe o excesso de PBS fora do círculo hidrofóbico com papel de tecido livre de poeira. Finalmente, adicionar uma a duas gotas de DAPI resultou em meio de montagem aquiesce e cobrir suavemente os slides com o deslizamento de tampa. Certifique-se de que não há bolhas de ar presas e, em seguida, armazene amostras em um lugar escuro a quatro graus centígrados durante a noite.
Limpe suavemente slides com um etanol de 70% e coloque slides na plataforma de varredura automatizada, ou slide stage, anexado ao microscópio zite axial ZED-2. Selecione a configuração de classificação na guia MetaCyte para editar o classificador. O classificador selecionado será usado pelo sistema para digitalizar e marcar os slides, e é baseado em um conjunto de parâmetros pré-definidos, que determinará como o sistema seleciona células e escores de focos.
O classificador pode ser otimizado e treinado com base em uma série de campos de imagem pré-classificados. Dependendo da ampliação do microscópio, do tipo de anticorpos que são usados para a coloração, um classificador diferente pode ser otimizado. Portanto, os classificadores geralmente variam de laboratório para laboratório, mas daremos uma visão geral das etapas mais básicas tomadas em consideração quando uma configuração de classificador tem que ser ajustada.
Na guia Capture', pode-se encontrar o filtro que será usado, aqui DAPI e TRITC, com um tempo máximo de integração de 1,04 segundos. Este último é baseado no classificador original fornecido pela empresa e posteriormente ajustado para a intensidade do anticorpo e fundo gama H2AX, ou sinal TRITC, neste tipo de célula específica, ou seja, linfócitos. Na guia Exposição, o tempo mínimo de integração é definido.
O classificador permanecerá sempre dentro do tempo mínimo e máximo de integração, o que impede a exposição excessiva ou inferior do slide. Na guia Seleção celular, as áreas mínimas e máximas do objeto foram definidas com base no tamanho e forma das células que são analisadas. Por exemplo, o valor de concavidade pré-determinado e a proporção são específicos para linfócitos, que geralmente têm formas redondas.
Na guia Recursos, você pode alterar a visualização da galeria e do histograma, bem como determinar o que o microscópio precisa para marcar. O sistema pode marcar inúmeros itens, dependendo dos recursos selecionados pelo usuário. Um exemplo é o limiar de como o software pontua objetos individuais.
Uma vez identificado um classificador adequado, selecione a configuração na barra lateral e dê a cada slide um nome único, seguido pela seleção do classificador apropriado. Selecione contagem máxima de células e adicione o número máximo de células necessárias para serem digitalizadas. A pesquisa é encerrada mesmo que a janela de pesquisa selecionada ainda não tenha sido digitalizada completamente, assim que a contagem de células máximas for atingida.
Para aplicações de biossimetria, a pontuação automatizada de 1000 células por slide é suficiente, considerando que três slides por amostra de sangue são preparados. Clique em OK'para confirmar as configurações. Para digitalizar slides, selecione Pesquisar na barra lateral.
Se a configuração Janela de pesquisa manual for selecionada na configuração de slides, uma caixa de diálogo abrirá uma linha para determinar a área de digitalização. Ao usar o objetivo de 10 vezes, a área de pesquisa retangular no slide é selecionada interativamente fixando dois cantos do campo de pesquisa pelo clique esquerdo do mouse. Isso pode ser confirmado com o botão OK'.
Ajuste uma posição de partida de foco. O software solicitará um foco e centralizará um núcleo de referência usando o objetivo de 40 vezes para cada slide e confirmará as configurações com OK. O sistema se moverá automaticamente para todos os lados sequencialmente. Se necessário, ajuste o tempo de configuração de imagem ao vivo e o tempo de integração para esta etapa.
Verifique todas as configurações do microscópio. Certifique-se de que a alavanca do tubo de microscópio está em uma posição que desvia toda a luz para a câmera e confirme o prompt do sistema com OK. O sistema inicia o foco automático da grade na posição da grade mais próxima do campo de referência. Ele continua a se concentrar na grade regular, movendo-se em uma mesmã em direção à frente e na parte de trás da janela de busca.
A varredura começa quando o foco automático da rede é concluído. O estágio é movido em um campo de padrão de meandro após campo para capturar dados. Quando uma célula é detectada, ela é posicionada e a imagem da galeria é armazenada e exibida na tela e a contagem de células é atualizada.
A pesquisa é encerrada se toda a pesquisa tiver sido digitalizada, se a contagem máxima de células foi atingida ou se a pesquisa foi cancelada. Quando a varredura estiver concluída, clique com o botão direito do mouse na barra na parte inferior e abra uma amostra. Revise a galeria, que consiste em pequenas imagens de células detectadas.
Nesta janela você pode especificar as células armazenadas na galeria por critério a ser escolhido no menu suspenso. As células são geralmente exibidas na ordem das quais foram detectadas. Clique em Quality Histogram'or Feature Value Diagram'para dar a distribuição das células detectadas, bem como os meios, e o desvio padrão de focos pontuados.
Aqui comparamos o cinza zero versus 1,5 amostras cinza. Este é tipicamente um slide de controle, com um valor médio de 0,124 focos por célula, onde a célula não foi irradiada. Em um contexto de biossimetria, isso indicaria que uma pessoa não foi exposta a uma radiação de alta dose.
No gráfico, podemos ver que a maioria das células tem quase zero de focos por célula, e não há lado da distribuição normal. Quando comparamos isso com uma dose de 1,5 cinza, pode-se ver claramente que esta é uma amostra irradiada. Em um contexto de bio-dissimetria, essa distribuição normal é um sinal claro de que a amostra foi exposta à radiação.
A varredura automatizada é sensível o suficiente para detectar focos induzidos em doses baixas. Os resultados mostram um claro aumento linear do número de focos por célula com dose. O método automatizado de detecção de quebra dupla de fios de DNA é útil para aplicações de dissimetria biológica de rendimento rápido e alto.
Obrigado por assistir.
