Esses protocolos fornecem uma maneira eficaz de estudar a atividade antitumoral dos ataques imunomoduladores. Além disso, a análise das chances associadas nas citocinas circulantes e populações de células imunes pode ser feita usando esses métodos propostos. A principal vantagem deste protocolo é que é fácil e uma maneira direta de implantar um tumor e monitorar seu crescimento. A implicação direta desta técnica é avaliar a eficácia de certas terapias ou desafios na pesquisa anti-câncer. Além disso, alguns aspectos dessas técnicas são adequados para estudos de toxicidade. Para começar, descongele um frasco congelado de células EERL murinas em um banho-maria pré-aquecido a 37 graus Celsius e transfira-os para um tubo cônico de 15 mililitros contendo meios de cultura quentes. Centrifugar o tubo cônico a 277 vezes G por cinco minutos a 25 graus Celsius para remover o meio. Em seguida, ressuspender o palato celular em meio fresco de três a cinco mililitros e transferi-lo para um frasco de cultura de células T25. Deixe as células crescerem em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, expanda para frascos maiores e passe a cada três dias. Quando houver células suficientes para a implantação desejada em todos os camundongos, remova os frascos, descarte o meio e enxágue suavemente as células PBS. Em seguida, adicione quatro mililitros de EDTA de tripsina a 0,25% e incube a 37 graus Celsius por dois minutos. Adicione meios frescos para parar a reação de tripsina e colete a suspensão celular em tubos cônicos de 50 mililitros. Ressuspenda as células em meios frescos e conte as células. Centrifugar mais uma vez, em seguida, adicionar PBS frio às células para fazer uma concentração final de 10 milhões de células por mililitro. Mantenha a suspensão celular no gelo antes da injeção. Desinfete a área do flanco com uma almofada de etanol. Para injetar suspensão de células em camundongos, aspirar 100 microlitros de suspensão de células na seringa e remover todas as bolhas e espaço morto do topo. Em seguida, injete a suspensão celular por via subcutânea de forma lenta e constante em camundongos anestesiados. Colocar os animais em suas respectivas gaiolas e monitorá-los até que se recuperem da anestesia. Para coletar sangue, segure a pele solta sobre o ombro com a mão não dominante e puncione a veia submandibular com uma agulha ou lanceta de calibre 18. Coletar de 200 a 300 microlitros de sangue em um tubo de microcentrífuga de polipropileno de 1,5 mililitro ou tubo separador de soro. Após a coleta de sangue, aplique pressão suave no local da punção até que o sangramento tenha cessado. Devolva os camundongos para suas respectivas gaiolas e observe até que eles se recuperem da anestesia. Deixe o sangue coletado coagular em temperatura ambiente por 20 a 30 minutos. Em seguida, coloque os tubos no gelo até que estejam prontos para serem centrifugados. Centrifugar o sangue coagulado a 1, 540 vezes G por 15 minutos a quatro graus Celsius, e coletar cuidadosamente a camada de soro do topo. Descongelar as amostras de soro ou plasma, mantendo-as no gelo. Em seguida, centrifugar as amostras a 1.540 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius, para sedimentar quaisquer detritos celulares e coletar cuidadosamente a camada de soro do topo. Coloque o kit multiplex em temperatura ambiente e realize o ensaio de acordo com o protocolo do fabricante. Coloque cada rato de costas e borrife etanol a 70% na pele da área abdominal. Use pinça e tesoura para cortar o linfonodo do lado direito dos camundongos e o tumor do lado esquerdo. Se o tumor for grande, corte-o em pedaços pequenos e tire cerca de 500 a 600 miligramas do tecido. Colocar os tecidos nos respectivos tubos dissociadores contendo três a cinco mililitros de meio RPMI. Homogeneizar o tecido utilizando um dissociador automático. Após a homogeneização, filtrar a suspensão celular através de um filtro de 70 micrômetros em um tubo cônico de 50 mililitros. Centrifugar a 277 vezes G por cinco minutos a 25 graus Celsius para remover a mídia. Lave e ressuspenda as células em um a dois mililitros de PBS frio. Use a coloração azul de tripsina a 0,4% para contar as células viáveis em um hemocitômetro.Calcule o volume necessário para obter de dois a três milhões de células e transfira-as para o respectivo tubo de fax. A centrífuga contou células a 277 vezes G por cinco minutos a 25 graus Celsius.Decantar o sobrenadante e ressuspender as células em 300 microlitros de PBS. Adicione 0,5 a um microlitro de corante zumbi por tubo e incube em temperatura ambiente por 20 minutos no escuro. Centrifugar as células Lave-as com um a dois mililitros de tampão de fax e volte a suspendê-las em 200 microlitros de tampão de fax. Adicionar bloqueador do receptor FC de acordo com o protocolo do fabricante e incubar as células por 10 minutos. Centrifugar novamente nas configurações descritas anteriormente e lavar as células com um a dois mililitros de tampão de fax. Adicione o coquetel de anticorpos e incube por 30 minutos a quatro graus Celsius no escuro. Após a incubação, centrifugar e lavar as células com um a dois mililitros de tampão de fax. Adicionar 300 a 400 microlitros de solução de paraformaldeído a 2% e voltar a suspender para fixação. Armazenar as células por alguns dias a quatro graus Celsius ou analisar imediatamente por citômetro de fluxo multicolorido. Neste estudo, a atividade antitumoral do polianidrido IL-1
