Questi protocolli forniscono un modo efficace per studiare l'attività antitumorale degli attacchi dei modulatori immunitari. Inoltre, l'analisi delle probabilità associate nelle citochine circolanti e nelle popolazioni di cellule immunitarie può essere effettuata utilizzando questi metodi proposti. Il vantaggio principale di questo protocollo è che è un modo semplice e diretto per impiantare un tumore e monitorarne la crescita. L'implicazione diretta di questa tecnica è quella di valutare l'efficacia di determinate terapie o sfide nella ricerca anti-cancro. Inoltre, alcuni aspetti di queste tecniche sono adatti per studi di tossicità. Per iniziare, scongelare una fiala congelata di cellule EERL murine in un bagno d'acqua preriscaldato a 37 gradi Celsius e trasferirle in una provetta conica da 15 millilitri contenente terreni di coltura caldi. Centrifugare la provetta conica a 277 volte G per cinque minuti a 25 gradi Celsius per rimuovere il terreno. Quindi risospendere il palato cellulare in un terreno fresco da tre a cinque millilitri e trasferirlo in un pallone di coltura cellulare T25. Lasciare che le cellule crescano in un'incubatrice umidificata a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica, espandere in palloni più grandi e passare ogni tre giorni. Quando ci sono abbastanza cellule per l'impianto desiderato in tutti i topi, rimuovere i palloni, scartare il terreno e sciacquare delicatamente le cellule PBS. Quindi aggiungere quattro millilitri di tripsina EDTA allo 0,25% e incubare a 37 gradi Celsius per due minuti. Aggiungere terreno fresco per fermare la reazione della tripsina e raccogliere la sospensione cellulare in provette coniche da 50 millilitri. Risospendere le cellule in terreni freschi e contare le cellule. Centrifugare ancora una volta, quindi aggiungere PBS freddo alle celle per ottenere una concentrazione finale di 10 milioni di cellule per millilitro. Tenere la sospensione cellulare sul ghiaccio prima dell'iniezione. Disinfettare l'area del fianco con un tampone di etanolo. Per iniettare la sospensione cellulare nei topi, aspirare 100 microlitri di sospensione cellulare nella siringa e rimuovere tutte le bolle e lo spazio morto dalla parte superiore. Quindi iniettare la sospensione cellulare per via sottocutanea in modo lento e costante nei topi anestetizzati . Metti gli animali nelle rispettive gabbie e monitorali fino a quando non si riprendono dall'anestesia. Per raccogliere il sangue, afferrare la pelle flaccida sopra la spalla usando la mano non dominante e perforare la vena sottomandibolare con un ago o una lancetta calibro 18. Raccogliere da 200 a 300 microlitri di sangue in una provetta da microcentrifuga in polipropilene da 1,5 millilitri o in una provetta separatore di siero. Dopo il prelievo di sangue, applicare una leggera pressione sul sito della puntura fino a quando l'emorragia non si è fermata. Rimetti i topi nelle rispettive gabbie e osserva fino a quando non si riprendono dall'anestesia. Lascia coagulare il sangue raccolto a temperatura ambiente per 20-30 minuti. Quindi posizionare le provette sul ghiaccio fino a quando non sono pronte per essere centrifugate. Centrifugare il sangue coagulato a 1.540 volte G per 15 minuti a quattro gradi Celsius e raccogliere con cura lo strato di siero dall'alto. Scongelare i campioni di siero o plasma tenendoli in ghiaccio. Quindi, centrifugare i campioni a 1.540 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius, per sedimentare eventuali detriti cellulari e raccogliere con cura lo strato di siero dall'alto. Posizionare il kit multiplex a temperatura ambiente ed eseguire il test secondo il protocollo del produttore. Sdraiare ogni topo sulla schiena e spruzzare etanolo al 70% sulla pelle della zona addominale. Usa pinze e forbici per tagliare il linfonodo dal lato destro dei topi e il tumore dal lato sinistro. Se il tumore è grande, taglialo in piccoli pezzi e preleva circa 500-600 milligrammi dal tessuto. Posizionare i fazzoletti sulle rispettive provette dissociatrici contenenti da tre a cinque millilitri di terreno RPMI. Omogeneizzare il tessuto utilizzando un dissociatore automatico. Dopo l'omogeneizzazione, filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro da 70 micrometri in un tubo conico da 50 millilitri. Centrifugare a 277 volte G per cinque minuti a 25 gradi Celsius per rimuovere il terreno. Lavare e risospendere le cellule in uno o due millilitri di PBS freddo. Utilizzare la colorazione con blu di tripsina allo 0,4% per contare le cellule vitali in un emocitometro.Calcola il volume necessario per ottenere da due a tre milioni di celle e trasferirle nel rispettivo tubo fax. Centrifuga cellule contate a 277 volte G per cinque minuti a 25 gradi Celsius.Decantare il surnatante e risospendere le cellule in 300 microlitri di PBS. Aggiungere da 0,5 a un microlitro di colorante zombie per tubetto e incubare a temperatura ambiente per 20 minuti al buio. Centrifugare le cellule Lavarle con uno o due millilitri di tampone fax e risospenderle in 200 microlitri di tampone fax. Aggiungere il bloccante del recettore FC secondo il protocollo del produttore e incubare le cellule per 10 minuti. Centrifugare di nuovo con le impostazioni descritte in precedenza e lavare le celle con uno o due millilitri di tampone fax. Aggiungere il cocktail di anticorpi e incubare per 30 minuti a quattro gradi Celsius al buio. Dopo l'incubazione, centrifugare e lavare le cellule con uno o due millilitri di tampone fax. Aggiungere da 300 a 400 microlitri di soluzione di paraformaldeide al 2% e risospendere per la fissazione. Conservare le cellule per un paio di giorni a quattro gradi Celsius o analizzarle immediatamente con un citometro a flusso multicolore. In questo studio, l'attività antitumorale della poliannidride IL-1
