Diese Protokolle bieten eine effektive Möglichkeit, die Antitumoraktivität von Immunmodulatorangriffen zu untersuchen. Darüber hinaus kann die Analyse der damit verbundenen Chancen in den zirkulierenden Zytokinen und Immunzellpopulationen mit diesen vorgeschlagenen Methoden durchgeführt werden. Der Hauptvorteil dieses Protokolls besteht darin, dass es einfach und unkompliziert ist, einen Tumor zu implantieren und sein Wachstum zu überwachen. Die direkte Implikation dieser Technik besteht darin, die Wirksamkeit bestimmter Therapien oder Herausforderungen in der Krebsforschung zu bewerten. Darüber hinaus eignen sich einige Aspekte dieser Techniken für Toxizitätsstudien. Zu Beginn wird ein gefrorenes Fläschchen mit murinen EERL-Zellen in einem vorgeheizten Wasserbad bei 37 Grad Celsius aufgetaut und in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen mit warmen Nährmedien überführt. Zentrifugieren Sie das konische Röhrchen bei 277 mal G fünf Minuten lang bei 25 Grad Celsius, um das Medium zu entfernen. Anschließend wird der Zellgaumen in drei bis fünf Milliliter frischem Medium resuspendiert und in einen T25-Zellkulturkolben überführt. Lassen Sie die Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid wachsen, expandieren Sie in größere Kolben und passieren Sie alle drei Tage. Wenn genügend Zellen für die gewünschte Implantation in alle Mäuse vorhanden sind, entfernen Sie die Kolben, verwerfen Sie das Medium und spülen Sie die Zellen vorsichtig mit PBS ab. Dann fügen Sie vier Milliliter 0,25%iges Trypsin EDTA hinzu und inkubieren Sie zwei Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Fügen Sie frisches Medium hinzu, um die Trypsinreaktion zu stoppen, und sammeln Sie die Zellsuspension in konischen 50-Milliliter-Röhrchen. Suspendieren Sie die Zellen erneut in frischem Medium und zählen Sie die Zellen. Erneut zentrifugieren und dann kaltes PBS in die Zellen geben, um eine Endkonzentration von 10 Millionen Zellen pro Milliliter zu erreichen. Bewahren Sie die Zellsuspension vor der Injektion auf Eis auf. Desinfizieren Sie den Flankenbereich mit einem Ethanol-Pad. Um Mäusen eine Zellsuspension zu injizieren, saugen Sie 100 Mikroliter Zellsuspension in die Spritze ein und entfernen Sie alle Blasen und den Totraum von der Oberseite. Dann wird die Zellsuspension langsam und gleichmäßig subkutan in anästhesierte Mäuse injiziert. Setzen Sie die Tiere in ihre jeweiligen Käfige und überwachen Sie sie, bis sie sich von der Narkose erholt haben. Um Blut zu entnehmen, greifen Sie die lose Haut mit der nicht dominanten Hand über die Schulter und stechen Sie mit einer 18-Gauge-Nadel oder Lanzette in die Unterkiefervene. Sammeln Sie 200 bis 300 Mikroliter Blut in einem 1,5-Milliliter-Polypropylen-Mikrozentrifugenröhrchen oder Serumseparatorröhrchen. Üben Sie nach der Blutentnahme sanften Druck auf die Einstichstelle aus, bis die Blutung gestoppt ist. Bringen Sie die Mäuse in ihre jeweiligen Käfige zurück und beobachten Sie, bis sie sich von der Narkose erholt haben. Lassen Sie das gesammelte Blut 20 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur gerinnen. Dann legen Sie die Röhrchen auf Eis, bis sie zentrifugiert werden können. Zentrifugieren Sie das geronnene Blut bei 1,540 mal G für 15 Minuten bei vier Grad Celsius und sammeln Sie die Serumschicht vorsichtig von oben. Tauen Sie die Serum- oder Plasmaproben auf, während Sie sie auf Eis lassen. Dann zentrifugieren Sie die Proben fünf Minuten lang bei 1.540 mal G bei vier Grad Celsius, um Zelltrümmer zu sedimentieren und die Serumschicht vorsichtig von oben zu sammeln. Platzieren Sie das Multiplex-Kit bei Raumtemperatur und führen Sie den Assay gemäß dem Protokoll des Herstellers durch. Legen Sie jede Maus auf den Rücken und sprühen Sie 70%iges Ethanol auf die Haut im Bauchbereich. Schneiden Sie mit einer Pinzette und einer Schere den Lymphknoten von der rechten Seite der Mäuse und den Tumor von der linken Seite heraus. Wenn der Tumor groß ist, schneiden Sie ihn in kleine Stücke und nehmen Sie etwa 500 bis 600 Milligramm vom Gewebe ab. Legen Sie die Taschentücher auf die jeweiligen Dissoziatorröhrchen, die drei bis fünf Milliliter RPMI-Medien enthalten. Homogenisieren Sie das Gewebe mit einem automatisierten Dissoziator. Nach der Homogenisierung filtrieren Sie die Zellsuspension durch einen 70-Mikrometer-Filter in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Bei 277 mal G fünf Minuten lang bei 25 Grad Celsius zentrifugieren, um das Medium zu entfernen. Waschen und resuspendieren Sie die Zellen in ein bis zwei Millilitern kaltem PBS. Verwenden Sie die 0,4%ige Trypsinblau-Färbung, um die lebensfähigen Zellen in einem Hämozytometer zu zählen.Berechnen Sie das Volumen, das benötigt wird, um zwei bis drei Millionen Zellen zu erhalten, und übertragen Sie sie auf die jeweilige Faxröhre. Die Zentrifuge zählte die Zellen fünf Minuten lang bei 25 Grad Celsius bei 277 mal G.Dekantieren Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen erneut in 300 Mikroliter PBS. Geben Sie 0,5 bis einen Mikroliter Zombie-Farbstoff pro Röhrchen hinzu und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 20 Minuten im Dunkeln. Zentrifugieren Sie die Zellen, waschen Sie sie mit ein bis zwei Millilitern Faxpuffer und suspendieren Sie sie wieder in 200 Mikroliter Faxpuffer. Fügen Sie den FC-Rezeptorblocker gemäß dem Protokoll des Herstellers hinzu und inkubieren Sie die Zellen 10 Minuten lang. Zentrifugieren Sie erneut mit den zuvor beschriebenen Einstellungen und waschen Sie die Zellen mit ein bis zwei Millilitern Faxpuffer. Den Antikörpercocktail zugeben und 30 Minuten bei vier Grad Celsius im Dunkeln inkubieren. Nach der Inkubation zentrifugieren und waschen Sie die Zellen mit ein bis zwei Millilitern Faxpuffer. Fügen Sie 300 bis 400 Mikroliter 2%ige Paraformaldehydlösung hinzu und suspendieren Sie sie erneut. Lagern Sie die Zellen für ein paar Tage bei vier Grad Celsius oder analysieren Sie sie sofort mit einem mehrfarbigen Durchflusszytometer. In dieser Studie wurde die Antitumoraktivität von Polyannhydrid IL-1
