Эти протоколы обеспечивают эффективный способ изучения противоопухолевой активности атак иммуномодуляторов. Кроме того, с помощью предложенных методов может быть проведен анализ ассоциированных шансов в циркулирующих цитокинах и популяциях иммунных клеток. Основным преимуществом этого протокола является простой и понятный способ имплантации опухоли и мониторинга ее роста. Непосредственное значение этого метода заключается в оценке эффективности определенных методов лечения или проблем в исследованиях противораковых заболеваний. Кроме того, некоторые аспекты этих методов подходят для исследований токсичности. Для начала разморозьте замороженный флакон с мышиными клетками EERL на предварительно нагретой водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия и перенесите их в коническую пробирку объемом 15 миллилитров, содержащую теплую питательную среду. Центрифугируйте коническую пробирку при температуре 277 раз по G в течение пяти минут при температуре 25 градусов Цельсия, чтобы удалить среду. Затем повторно суспендируйте клеточное небо в трех-пяти миллилитрах свежей среды и перенесите его в колбу для клеточной культуры Т25. Дайте клеткам расти в увлажненном инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа, расширяйте в колбы большего размера и пропускайте каждые три дня. Когда наберется достаточное количество клеток для желаемой имплантации всем мышам, извлеките колбы, выбросьте среду и аккуратно промойте клетки PBS. Затем добавьте четыре миллилитра 0,25%-ного трипсина ЭДТА и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух минут. Добавьте свежую среду, чтобы остановить реакцию трипсина, и соберите клеточную суспензию в конические пробирки объемом 50 миллилитров. Повторно суспендируйте клетки в свежей среде и подсчитайте количество клеток. Центрифугируйте еще раз, затем добавьте холодный PBS в клетки, чтобы получить окончательную концентрацию 10 миллионов клеток на миллилитр. Перед инъекцией держите клеточную суспензию на льду. Продезинфицируйте область бока салфеткой с этанолом. Чтобы ввести клеточную суспензию мышам, аспирируйте 100 микролитров клеточной суспензии в шприц и удалите все пузырьки и мертвое пространство сверху. Затем медленно и неуклонно вводят клеточную суспензию подкожно мышам, находящимся под наркозом. Поместите животных в соответствующие клетки и наблюдайте за ними, пока они не оправятся от анестезии. Чтобы собрать кровь, возьмитесь за дряблую кожу через плечо недоминантной рукой и проколите подчелюстную вену иглой 18-го калибра или ланцетом. Соберите от 200 до 300 микролитров крови в полипропиленовую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра или пробирку-сепаратор сыворотки. После забора крови слегка надавите на место прокола до тех пор, пока кровотечение не остановится. Верните мышей в соответствующие клетки и наблюдайте, пока они не оправятся от анестезии. Дайте собранной крови свернуться при комнатной температуре в течение 20-30 минут. Затем поместите пробирки на лед до тех пор, пока они не будут готовы к центрифугированию. Центрифугируйте свернувшуюся кровь при 1,540 раза по G в течение 15 минут при температуре четыре градуса Цельсия и осторожно соберите слой сыворотки сверху. Разморозьте образцы сыворотки или плазмы, держа их на льду. Затем центрифугируйте образцы при температуре 1,540 G в течение пяти минут при температуре четыре градуса Цельсия, чтобы осаждать любой клеточный мусор и осторожно собрать слой сыворотки сверху. Поместите мультиплексный набор при комнатной температуре и выполните анализ в соответствии с протоколом производителя. Положите каждую мышь на спину и распылите 70% этанол на кожу живота. Используйте щипцы и ножницы, чтобы вырезать лимфатический узел с правой стороны мыши и опухоль с левой стороны. Если опухоль большая, разрежьте ее на мелкие кусочки и отнимите от ткани от 500 до 600 миллиграммов. Поместите ткани в соответствующие пробирки диссоциатора, содержащие от трех до пяти миллилитров среды RPMI. Гомогенизируйте ткань с помощью автоматизированного диссоциатора. После гомогенизации отфильтруйте клеточную суспензию через 70-микрометровый фильтр в коническую пробирку объемом 50 миллилитров. Центрифуга при температуре 277 раз G в течение пяти минут при температуре 25 градусов Цельсия для удаления среды. Промойте и повторно суспендируйте клетки в одном-двух миллилитрах холодного PBS. Используйте 0,4%-ное окрашивание трипсиновым синим, чтобы подсчитать жизнеспособные клетки в гемоцитометре.Рассчитайте объем, необходимый для получения двух-трех миллионов ячеек и перенесите их в соответствующую трубку факса. Центрифуга подсчитывала клетки при 277 раз по G в течение пяти минут при температуре 25 градусов по Цельсию.Декантировать надосадочную жидкость и повторно суспендировать клетки в 300 микролитров PBS. Добавьте от 0,5 до одного микролитра зомби-красителя на пробирку и инкубируйте при комнатной температуре 20 минут в темноте. Центрифугирование клеток Промойте их одним-двумя миллилитрами буфера для факса и повторно суспендируйте в 200 микролитров буфера для факса. Добавьте блокатор ФК-рецепторов согласно протоколу производителя и инкубируйте клетки в течение 10 минут. Снова центрифугируйте при ранее описанных настройках и промойте ячейки одним-двумя миллилитрами факсимильного буфера. Добавьте коктейль антител и инкубируйте в течение 30 минут при температуре четыре градуса Цельсия в темноте. После инкубации центрифугируют клетки и промывают их один-двумя миллилитрами факсимильного буфера. Добавьте от 300 до 400 микролитров 2%-ного раствора параформальдегида и повторно суспендируйте для фиксации. Храните клетки пару дней при температуре четыре градуса Цельсия или сразу анализируйте многоцветным проточным цитометром. В данном исследовании изучена противоопухолевая активность полианнгидрида IL-1
