A alimentação artificial e a coleta de saliva fornecem um método direto para detectar efeitos na saliva de insetos. No entanto, isso não foi descrito em detalhes antes. Este protocolo é eficaz para a coleta de saliva de insetos saprofíticos.
Além disso, é uma técnica simples, pois usamos meio contendo apenas sacarose como uma dieta artificial. A saliva de insetos saprofíticos pode afetar contra o sistema imunológico do hospedeiro para beneficiar o comportamento alimentar e transmitir patógenos. Este medicamento que pode ser usado para o comportamento de insetos e a pesquisa do caminho do osso dos insetos.
Este é um método simples de executar. No entanto, isso sugere a montagem de um ambiente experimental limpo à medida que a saliva está sendo coletada para mais pesquisas. Comece preparando uma solução de 5% de sacarose para a dieta artificial e filtre a solução através de um filtro de 0,22 mícrons para remover contaminação bacteriana e impurezas.
Passe a fome aproximadamente 200 pequenas larvas de funil vegetal marrom por três a cinco horas antes de introduzi-las em uma câmara de alimentação. Em seguida, para preparar os cilindros de vidro como câmaras de alimentação, cubra uma extremidade aberta da câmara com uma membrana de parafina antes de introduzir os insetos experimentais, em seguida, transfira os insetos para o cilindro de vidro e cubra a outra extremidade da câmara com membrana de parafina esticada. Adicione 200 microliters de dieta artificial na membrana e cubra o líquido com outra camada de membrana de parafina esticada.
Por fim, cubra a câmara com papel alumínio, deixando a extremidade com o dispositivo de dieta artificial exposto à luz. Após 24 horas, colete a saliva SBPH resfriando o cilindro a quatro graus Celsius para imobilizar os insetos, depois descubra o filme externo e colete a dieta artificial em tubos estéreis de 1,5 mililitro usando uma pipeta estéril. Mantenha a saliva coletada a menos 80 graus Celsius até a análise.
Em seguida, enxágue a membrana interna com 50 microliters de dieta artificial fresca três vezes por pipetação suavemente, e colete a dieta de lavagem artificial em tubos estéreis de 1,5 mililitro. Após as três enxágues, adicione uma dieta artificial fresca na membrana interna e coloque uma membrana de parafina recém-esticada por cima. Por fim, filtre as amostras coletadas através de uma unidade de filtro de 0,22 mícrons para remover micróbios e outros contaminantes.
Transfira as amostras de saliva coletiva em um filtro centrífugo de 500 mímicas e 10 kilodalton. Centrifugar a amostra. Colete o supernatante e traga o volume final para 100 microliters.
Para medir a concentração da saliva coletada, ligue o espectrofotômetro visível UV e lave os pedestais três vezes com água duplamente destilada. Selecione as opções na tela na seguinte ordem, proteínas, proteína A280. Selecione o tipo e uma unidade de absorção igual a um miligrama por mililitro.
Em seguida, verifique a caixa para correção da linha de base, 340 nanômetros. Em seguida, carregue dois microliters de solução aquosa de 5% de sacarose em branco e toque em Branco na parte inferior da tela. Finalmente, após a definição dos padrões, carregue dois microliters da saliva coletada e registe a concentração proteica.
Ao se alimentar de 5% de sacarose, mais de 80% da SBPH sobreviveu nos primeiros quatro dias. No entanto, a partir do quinto dia, a mortalidade aumentou rapidamente para 40% e no sétimo dia, menos da metade da SBPH sobreviveu. Uma análise de página da SDS mostrou que as amostras concentradas de saliva da saliva SBPH infectada pelo RSV continham muito mais proteínas do que o controle negativo de 5% da sacarose.
Em uma análise de manchas ocidentais para detecção da proteína capsida RSV, um inseto não infectado e viruliferous. A proteína capsíide RSV foi detectada com sucesso na amostra viruliferosa, um anticorpo projetado contra o produto genético LssgMP detectou uma proteína de 78 quilodalton em amostras não infectadas e viruliferosas, demonstrando que o LssgMP é uma proteína de saliva. Uma análise qrt pcr dos níveis de transcrição de LssgMP em diferentes tecidos mostrou que os níveis de transcrição de Lssg na glândula salivar eram 20 vezes maiores do que em todo o corpo e intestino, confirmando a expressão específica de LssgMP na glândula salivar.
Passar fome pelos insetos experimentais antes de introduzi-los na câmara é necessário para garantir a eficiência da nossa coleção de saliva. Além disso, deve ser coletado e trocado um meio artificial a cada 24 horas para reduzir a contaminação microbiana na amostra coletada. Esta técnica fornece um método direto para estudar a função da saliva na transmissão de patógenos.
Além disso, pode ajudar a estudar a interação do hospedeiro do patógeno inseto.
