A aneuploidia é a principal causa genética de aborto espontâneo precoce em humanos. A maioria dos erros na segregação cromossômica ocorre durante a meiose nos ovócitos. Portanto, avaliar o ponto de verificação de montagem do fuso em oócitos é fundamental para entender por que os oócitos são propensos a erros.
Aqui descrevemos três técnicas para avaliar de forma abrangente a integridade do SAC em oócitos de camundongos, examinando diferentes etapas críticas no ponto de verificação usando uma combinação de imagens vivas e imunofluorescência. Demonstrando o procedimento estará a Dra. Cecilia Blengini, pesquisadora associada do meu laboratório. Iniciar o preparo de um mililitro de meio de cultura contendo nocodazol e reversina com DMSO como controle, conforme descrito no manuscrito.
Para a maturação dos ovócitos e imagens vivas, use uma placa pré-aquecida de 96 poços em uma incubadora. E carregar o primeiro, segundo e terceiro poço com 150 microlitros do controle DMSO, nocodazol e nocodazol mais tratamento com reversina, respectivamente. Mantendo a placa na incubadora sob as condições descritas no manuscrito.
Para iniciar a maturação miótica, remova a milrinona transferindo sequencialmente os ovócitos através de 6 gotas de 100 microlitros de meio de cultura livre de milrinona contendo DMSO. E coloque-os no poço correspondente da placa de 96 poços. Usando uma pipeta operada à mão ou à boca ao visualizar os oócitos sob um microscópio estéreo.
Fotografe os ovócitos usando um microscópio de campo brilhante equipado com uma câmara de incubadora com um ambiente controlado a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono e 80% de umidade. Capturar imagens no plano médio dos ovócitos em intervalos de 20 minutos por 24 horas. Depois de quantificar o número de ovócitos que extrudem um corpo polar, identificando as células que passam por citocinas assimétricas com uma pequena célula ao lado do óvulo e dentro da zona pelúcida compartilhada.
Visualize as imagens usando o software de imagem. Microinjetar oócitos presos pró-fase um com 100 nanogramas por microlitros de cRNA securin-gfp previamente preparado. Após a microinjeção, permita que os oócitos recuperem e traduzam o RNA na incubadora de dióxido de carbono por pelo menos três horas.
Em seguida, carregue 150 microlitros de meios de cultura com ou sem cinco micromolares de nocodazol. E 150 microlitros de meios de cultura com 0,5 micromolar de reversina em três poços diferentes de uma placa de 96 poços. Lave os ovócitos microinjetados através de seis gotas de meios de cultura livres de milrinona E transfira um terço dos ovócitos para cada tratamento.
Mantenha a placa na incubadora a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e 80% de humidade até que os ovócitos retomem a meiose, cerca de três horas após a lavagem da milrinona. Registrar imagens de maturação de ovócitos usando um microscópio de fluorescência equipado com uma câmara de incubadora. Use um software de análise de imagem para quantificar a destruição do securin-gfp e abra as imagens do canal GFP, a partir do tempo 0.1.
No software de análise preferido, use a ferramenta de seleção ou forma para marcar cada ovócito e gerar uma região de interesse para cada célula. Use a mesma região de interesse para selecionar uma área de plano de fundo a ser subtraída posteriormente e medir a intensidade de pixels GFP em cada região de interesse em todos os pontos de tempo. Por fim, para cada valor de GFP, subtraia a medição da região de interesse em segundo plano.
Depois de dividir a meiose em três grupos, transfira cada grupo de meiose para 100 gotas de microlitros de meio de cultura livre de milrinona. Cubra as gotas com óleo mineral e coloque-as na incubadora por três, cinco e sete horas para atingir o estágio inicial da prometáfase um, a prometáfase tardia um e a metáfase um, respectivamente. Nos pontos de tempo designados, fixe os ovócitos transferindo-os para gotas de 500 microlitros de paraformaldeído a 2% em tampão PME por 20 minutos à temperatura ambiente usando um prato de vidro de nove poços.
Em seguida, transfira as células para um poço limpo contendo uma gota de 500 microlitros de solução de bloqueio. Para continuar a detecção de MAD2, transfira os oócitos para um poço limpo contendo uma gota de 500 microlitros de solução de permeabilização. Depois de incubar por 20 minutos à temperatura ambiente, transferir as células para um novo poço de solução de bloqueio e incubar por 10 minutos.
Transfira os ovócitos para uma gota de 30 microlitros de solução bloqueadora com anticorpo anti-MAD2 e anticorpo anticentrômero e incube por duas horas à temperatura ambiente. Para lavar o excesso de anticorpos primários após a transferência das células para 30 microlitros gota de tampão PME suplementado com 0,5%Triton, incubar por 10 minutos na câmara umidificada. Transfira as células para uma gota de 30 microlitros de solução bloqueadora contendo anticorpos secundários, como anti-humano 633 e anti-coelho 568.
E incubar por uma hora à temperatura ambiente. Para montar as células na lâmina do microscópio, transfira as células para uma gota de 10 microlitros de meio de montagem contendo DAPI. Adicione pequenos pontos de vaselina a cada canto da tampa.
Coloque-os cuidadosamente em cima da gota de mídia de montagem e pressione lentamente para distribuir. Sele a tampa deslize para a lâmina usando esmalte claro. Imagem cinetocoros usando um microscópio confocal equipado com uma objetiva 40 ou 63 X.
E usando o sinal de anticorpos anticentrômeros determinar a faixa Z que permite a imagem de toda a área cromossômica. Os ovócitos controle tratados com DMSO extruderam um corpo polar cerca de 14 horas após a liberação da milrinona. Após a ativação do SAC, os ovócitos tratados com nocodazol foram presos na metáfase um e não extruderam um corpo polar.
No entanto, na ausência de ativação do SAC, os ovócitos extruderam um corpo polar, apesar de não terem ligações de microtúbulos de cinetócoro. A taxa de degradação da securina-gfp durante a maturação miótica foi avaliada. Em que a intensidade de securina-gfp dos ovócitos tratados com DMSO de controle começa a diminuir aproximadamente 10 horas após o washout da milrinona.
Quando os ovócitos foram amadurecidos na presença do agente ativador do SAC, nocodazol, os níveis de securina-gfp permaneceram estáveis durante todo o período de maturação miótica. Em contraste, ao prevenir a ativação do SAC com tratamento de reversina, o padrão securina-gfp acelerou e a degradação começou aproximadamente quatro horas após o washout da milrinona consistente com a inibição do SAC. A imagem confocal foi empregada para detectar centrômeros e MAD2 de oócitos maturados para prometáfase inicial um, prometáfase tardia um e metáfase um.
Para avaliar a força do sinal SAC, quantificou-se a intensidade de pixel MAD2 localizada em cinetócoro. Níveis significativos de recrutamento de MAD2 para cinetocoros ocorrem no início da prometáfase um, quando a maioria dos cinetocoros não estava ligada aos microtúbulos. Os níveis de MAD2 reduziram na prometáfase posterior e estavam quase ausentes na metáfase um, quando todos os cinetocoros estavam estáveis ligados aos microtúbulos.
É importante destacar que cada uma dessas técnicas tem suas limitações e sua interpretação. E sugerimos a realização de uma combinação desses métodos para avaliar a integridade do SAC. Estes três ensaios permitem que os pesquisadores avaliem a rigidez do saco em ovócitos, dando uma visão sobre uma causa potencial de aneuploidia em ovos humanos.
