A preparação da fatia espinhal MEA 4-AP descrita para você fornece uma plataforma para estudar a conectividade dos circuitos de chifre dorsal e como essas redes interagem durante o processamento sensorial espinhal. A metodologia apresentada permite que a atividade do circuito de chifres dorsais seja investigada em nível regional macroscópico de resolução. Esta preparação pode ser usada como uma ferramenta de triagem rápida para avaliar a capacidade dos compostos de interromper a sinalização em circuitos sensoriais espinhais.
Este método ajuda a preencher a lacuna em nossa compreensão de como a atividade de tipos celulares específicos e pequenos micro circuitos influenciam grandes populações de neurônios para posteriormente moldar a saída das respostas de comportamento do chifre dorsal e, em última instância, a experiência de dor. Para começar, encha bem o MEA com soro de cavalo por 30 minutos. Depois de remover o soro, enxágue completamente o MEA cinco vezes com água destilada até que a água destilada se torne não espuma.
Em seguida, encha o poço com CSF artificial. Depois de decapitar o camundongo anestesiado, remova a pele sobre a região abdominal fazendo um pequeno corte na pele ao nível dos quadris. Em seguida, puxe a pele em ambos os lados do corte rostrally até que toda a pele seja removida do topo da caixa torácica até o topo da pelve, tanto ventricamente quanto dorsalmente.
Depois de colocar o corpo no gelo, use uma abordagem ventral para expor a coluna vertebral removendo as vísceras e cortando as costelas lateralmente para o esterno. Remova a caixa torácica ventral, tanto escápula, quanto os membros inferiores e pélvis. Transfira a coluna vertebral e a preparação da costela para um banho dissecando contendo csf artificial de sacarose gelada.
Fixar todos os quatro cantos da preparação colocando pinos através dos músculos inferiores das costas e das costelas superiores presas. Remova todo o músculo e tecido conjuntivo sobre a superfície ventral das vértebras com os rongeurs e identifique a região vertebral sobre o alargamento lumbo-sacral, que fica aproximadamente abaixo dos corpos vertebrais T12-L2. Remova um corpo vertebral caudal para a região de alargamento lumbo-sacral para acessar a medula espinhal sentada no canal vertebral.
Usando uma tesoura de mola curva, corte os pedículos vertebrais bilateralmente enquanto levanta e puxa o corpo vertebral rostrally para separar os aspectos ventral e dorsal das vértebras e expor a medula espinhal. Uma vez que os corpos vertebrais são removidos para revelar o alargamento lumbo-sacral, limpe cuidadosamente as raízes restantes que ancoram a medula espinhal com tesouras de mola até que a cordel flutue livremente. Isole a medula espinhal com cortes rostrais e caudais acima e abaixo do alargamento lumbo-sacral para tornar a região alvo do cordão livre.
Para fatias transversais, levante e coloque o segmento lumbo-sacral por uma rota anexada em um bloco de poliestireno pré-cortado com um canal raso cortado no centro. Em seguida, use o adesivo de cianoacrilato para anexar o bloco e o cabo à plataforma de seção e colocá-lo no banho de corte contendo sacarose gelada artificial CSF. Uma vez obtidas as fatias de 300 micrômetros de espessura, transfira as fatias para uma câmara de incubação de interface de ar contendo CSF artificial oxigenado e permita que as fatias se equilibrem por uma hora à temperatura ambiente.
Para começar a registrar a atividade do chifre dorsal, transfira a fatia da incubadora para o poço MEA usando uma pipeta pasteur de ponta grande recheada com CSF artificial e adicione CSF artificial adicional. Use uma escova de tinta de cabelo fina e curta para posicionar a fatia sobre a matriz de gravação de 60 eletrodos. Em seguida, coloque um pescoço ponderado sobre o tecido para mantê-lo no lugar e promover um bom contato com eletrodos MEA.
Coloque o MEA no estágio da cabeça de gravação. Verifique a posição do tecido sobre os eletrodos usando um microscópio invertido para confirmar que o maior número possível de eletrodos estão sob o DH superficial. Certifique-se de que pelo menos dois a seis eletrodos não entrem em contato com a fatia. Depois de conectar a câmera ao dispositivo, leve uma imagem de referência da fatia em relação ao MEA para uso durante a análise.
Em seguida, pressione iniciar o DAQ no software de gravação e confirme que todos os eletrodos recebem um sinal claro. Em seguida, conecte as linhas de entrada e saída de perfusão ao MEA bem preenchido com CSF artificial e ligue o sistema de perfusão. Verifique a vazão e certifique-se de que a vazão é suficiente para evitar o estouro do superfusato.
Depois de equilibrar o tecido por cinco minutos, registo os dados da linha de base bruta por cinco minutos. Mova a linha de entrada de perfusão de CSF artificial para uma solução de 4 aminopirridina e espere 12 minutos para que a atividade rítmica induzida por 4 aminopirdinase alcance um estado estável. Em seguida, grave cinco minutos de atividade induzida por 4 aminopirida e esteja preparado para as gravações subsequentes para testar as drogas ou verificar a estabilidade de 4-aminopirida.
Após cada sessão de gravação, enxágue as linhas com CSF artificial. Depois de remover o MEA da etapa da cabeça e remover bem a rede e o tecido do MEA, enxágue o MEA e a rede com CSF artificial e repita todo o processo com uma nova fatia. Abra o software de análise e carregue o layout de análise pré-feito.
Abra o arquivo de interesse e desmarque o eletrodo de referência e quaisquer eletrodos considerados excessivamente barulhentos. Defina a janela de tempo para análise. Em seguida, mova-se para a guia do filtro do canal cruzado.
Selecione os eletrodos de referência e referência complexos com base na imagem tirada e nas notas feitas durante o experimento e pressione Explorar antes de continuar. Mova-se para a guia do filtro EAP e aplique um filtro Butterworth de segunda ordem para remover a atividade LFP. Mova-se para a guia do filtro LFP e aplique um filtro butterworth de segunda ordem para remover a atividade EAP.
Na guia detector EAP, certifique-se de selecionar o limiar automático, marque as caixas de borda subindo e caindo e defina o tempo morto para três milissegundos. Para definir limiares positivos e negativos, inspecione os dados retornando à tela do analisador de dados bruto, movendo o marcador de tempo, retornando à guia do detector EAP e pressionando a exploração. Repita o processo até que o limiar de detecção definido capture EAPs sem capturar ruídos ou atividades não fisiológicas.
Na guia do detector LFP, certifique-se de selecionar o limiar manual, marque as caixas de borda subindo e caindo e ajuste o tempo morto para três milissegundos. Defina o limiar para um eletrodo e, uma vez satisfeito, selecione aplicar a todos e, em seguida, pressione a análise de início. A aplicação do banho da tetrodotoxina antagonista do canal de sódio fechada de tensão aboliu tanto a atividade EAP quanto a LFP, confirmando a dependência do pico desses sinais.
A estabilidade dos parâmetros de atividade induzidos por 4 aminopirdina foi caracterizada para EAP ou LFP. Todas as características de atividade mais a coincidência de atividade para LFPs foram estáveis com base na similaridade da atividade induzida por 4 aminopirida em 12 minutos após a aplicação de 4-aminopirida e 15 minutos depois. Os EAPs ou LFPs do recurso foram caracterizados por um aumento no número de eventos coincidentes detectados em vários eletrodos.
O número de eletrodos adjacentes ligados, e a força das ligações entre eletrodos adjacentes e LFPs após a estimulação de 4 aminopirida e, em seguida, relativa estabilidade. A orientação da fatia é uma consideração importante para os preparativos in vitro. A estimulação de 4-aminopirida induziu uma atividade rítmica semelhante no SDH, independentemente da orientação da fatia.
Finalmente, para esclarecer ainda mais a relevância da ativação de 4-aminopirridina das redes DH, uma solução de CSF artificial de potássio elevada foi aplicada e mostrou-se evocar uma resposta DH semelhante à estimulação de 4 aminopirida. Os principais passos do protocolo estão na preparação e colocação de tecidos das seções, garantindo que o tecido seja saudável através de dissecção cuidadosa, mas oportuna, bem como o posicionamento ideal delicado do tecido no MEA ajudará na obtenção de resultados de qualidade.
