Aqui, descrevemos um método instrutivo baseado em uma rápida inativação de calor de protease para preservar peptídeos intracelulares naturais, evitar a degradação em células e tecidos, seguido de uma quantitação relativa de peptídeos usando rotulagem isotópica. Este método de rotulagem tem muitas vantagens. Os reagentes estão comercialmente disponíveis, baratos, quimicamente estáveis, e permitem a análise de até cinco amostras em um único soro.
Comece cultivando células de neuroblastoma humano em um prato de 15 centímetros em DMEM contendo 15% FBS e estreptomicina de penicilina de 1%. Mantenha as células a 37 graus Celsius sob 5% de dióxido de carbono. Lave as células duas vezes com PBS, depois adicione 10 mililitros de PBS, raspe as células e colete-as em um tubo de 15 mililitros.
Centrifugar as células a 800 vezes G por cinco minutos e remover o supernante. Resuspend a pelota em um mililitro de água deionizada ultra purificada a 80 graus Celsius, em seguida, transfira o conteúdo do tubo para um tubo microfuçado de dois mililitros. Após a inativação de calor de zebrafish, colete todo o cérebro em um tubo de microfuge de dois mililitros e congele-o a menos 80 graus Celsius até a análise.
Resuspende a amostra de tecido em um mililitro de água deionizada ultra purificada a 80 graus Celsius e sonicato com uma sonda usando 30 pulsos de um segundo. Incubar o tecido de lise celular ou homogeneizar a 80 graus Celsius por 20 minutos e depois esfrie-o no gelo por 10 a 30 minutos. Adicione 10 microlitres de uma solução de caldo de ácido clorídrico molar para cada um mililitro de volume amostral.
Misture por vórtice por 20 segundos e incubar no gelo por 15 minutos. Centrifugar o lisecelular ou o tecido homogeneado a 12.000 vezes G em quatro graus Celsius por 15 minutos. Colete o supernante em tubos de microcentrifuuge de proteína de baixa ligação e armazene-o a menos 80 graus Celsius.
Limpe os dispositivos de ultrafiltração com água e centrífuga a 2.300 vezes G por três minutos e descarte a água do dispositivo de ultrafiltração. Pipeta o supernante em um filtro de corte pré-lavado de 10 kilodalton e gire em uma centrífuga refrigerada a quatro graus Celsius. Verifique o pH da amostra.
Equilibre a coluna com um mililitro de 100% acetonitrila, depois lave-a com um mililitro de acetonitrilo de 5%com ácido trifluoroacético de 0,1%. Carregue o volume completo da amostra na coluna e lave a coluna com um mililitro de acetonitrilo de 5%com ácido trifluoroacético de 0,1%. Elute os peptídeos da coluna com 1,8 mililitros de acetonitrilo de 1%com ácido trifluoroacético de 0,15% em tubos de microcentrifuge de baixa ligação.
Seque a amostra inteiramente em uma centrífuga de vácuo a 30 graus Celsius e monitore o tempo de concentração em exibição. Armazene a amostra a menos 80 graus Celsius. Resuspenja as amostras de peptídeos em 100 a 200 microliters de água ultra purificada e pipetas 2,5 microliters das concentrações de peptídeos padrão e amostras na placa branca de 96 poços.
Adicione 25 microlitres de 0,2 tampão de fosfato molar e 12,5 microliters de fluorescamina. Homogeneize suavemente por um minuto no rotador orbital. Em seguida, adicione 110 microliters de água para parar a reação.
Ajuste as configurações do espectrômetro e leia a placa. Adicione 1/10º volume de um brometo de trimetilaammonium molar a cada amostra de peptídeo com até 25 microgramas do peptídeo. Certifique-se de que o pH está entre cinco e oito, ajustando com ácido clorídrico ou hidróxido de sódio, se necessário.
Adicione quatro microliters de formaldeído deuterado não deuterado ou formaldeído deuterado de carbono 13. Misture por cinco segundos por vórtice. Adicione quatro microliters de cianoboroidride de sódio ou cianoboroidrido de sódio desuterado à amostra de peptídeo.
Em seguida, misture a amostra por cinco segundos por vórtice. Incubar a amostra de peptídeo em um capô de fumaça por duas horas em temperatura ambiente, vórtice a cada 30 minutos. Repita a adição de formaldeído deutado, deuterado ou carbono-13 deutado e cianoboroidride ou cianoboroidride de sódio deutado, vórtice após cada adição.
Incubar as amostras no capô da fumaça durante a noite à temperatura ambiente. Adicione 16 microliters de bicarbonato de amônio e misture por vórtice. Coloque a amostra no gelo.
Adicione oito microliters de ácido fórmico de 5% e vórtice por mais cinco segundos. Combine as amostras de peptídeos, ajuste o pH entre dois e quatro e, em seguida, desalte as amostras combinadas em colunas de limpeza de fase invertida usando acetonitrilo e ácido trifluoroacético como descrito anteriormente. Seque a amostra inteiramente em uma centrífuga de vácuo a 30 graus Celsius, depois armazene-a a menos 20 graus Celsius.
Os peptídeos rotulados são observados usando espectros de massa. As setas vermelhas indicam a presença de pares de picos de peptídeos diferentes rotulados com duas formas isotópicas, L1 e L5, para comparação entre duas amostras diferentes S1 e S2, respectivamente. O espectro de massa de um peptídeo presente em três amostras diferentes, S1, S2 e S3, rotulados com etiquetas L1, L3 e L5, respectivamente, é mostrado aqui.
Foi realizada uma rotulagem quádrupla. As amostras de controle S1 e S3 foram rotuladas com L1 e L3, respectivamente, e comparadas com duas amostras experimentais, S2 e S4 rotuladas com L2 e L4.No diferença significativa foi observada. A rotulagem isotópica foi usada para mostrar substratos em produtos in vitro para um determinado protease ou peptidase.
Um peptídeo que não muda na presença da enzima neurolise é mostrado aqui. Peptídeos que desaparecem ou reduzem na presença da enzima são substratos, enquanto aqueles que aumentam são considerados produtos. A figura é um exemplo de identificação de uma sequência de peptídeos realizada por um mecanismo de pesquisa de banco de dados rotulado com três formas diferentes de tags.
Antes de ser definido, certifique-se de que a amostra esteja completamente fria para evitar quebrar as ligações de peptídeos causadas pela acidificação dura. Além disso, a limpeza de dispositivos de ultrafiltração é essencial. espectrometria de massa é um excelente método para quantificar peptídeos entre diferentes condições experimentais e para estudos de análise, identificando substratos de peptidase.
