Name: ubiquitin chain analysis by parallel reaction monitoring
Uploaded: 2020-06-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
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Os autores agradecem a Céline Jeanty por sua ajuda na criação de pelotas celulares com tratamento da MG-132, conforme descrito nos resultados representativos e Elise Mommaerts por sua provisão de pelotas E. coli utilizadas no protocolo.

1. Preparação de um padrão de peptídeo pesado
<ol><li>Dependendo do fornecedor e da qualidade dos peptídeos pesados comprados, os peptídeos pesados precisarão ser diluídos. Este protocolo utilizou as sequências de peptídeos relatadas na Tabela 1, com o aminoácido terminal C modificado para lisina (13C615N2-lysine) ou Arginina (13C615N4-arginina).<ol>
<li>Misture os peptídeos pesados, diluindo a mistura com 50% de acetonitrila (ACN) para criar uma mistura de peptídeos com cada peptídeo a 10 μM.</li>
		<li>Crie alíquotas da mistura de peptídeos e armazene a -80 °C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparação da amostra
<ol><li>Lise amostral NOTA: A estabilidade das cadeias de ubiquitina deve ser considerada durante a preparação da amostra. Mantenha amostras biológicas e tampões refrigerados a 4 °C e adicione amostras ao tampão de estabilização da ubiquitina o mais rápido possível.<ol>
<li>Prepare uma solução de 1 M NH4HCO3 (bicarbonato de amônio) na água e ajuste o pH para 8 usando 1 M NaOH.</li>
		<li>Prepare uma solução de 200 mM N-ethylmaleimida (NEM) na água.</li>
		<li>Prepare o tampão de estabilização da ubiquitina usando 8 M de ureia em 50 mM NH4HCO3/10 mM NEM. O tampão de estabilização da ubiquitina deve ser preparado fresco a cada vez. NOTA: Uma solução de 5 mL de 8 M de ureia exigirá consideravelmente menos de 5 mL de água dada a expansão da água quando em uma solução saturada com ureia. ATENÇÃO: Não prepare o tampão acima de 50 °C devido à tendência da ureia de formar poliureia a altas temperaturas.</li>
		<li>Resuspenque a amostra biológica a ser investigada no tampão de estabilização da ubiquitina visando 0,5 μg/μL de proteína e lise as células com um método apropriado para a amostra. Um método de sonicação composto por três pulsos de 10 s com um sonifier SFX 150 Branson definido com 70% de intensidade com quebras de 10 s no gelo entre cada pulso, foi usado para as linhas celulares neste protocolo.</li>
		<li>Amostra de centrífuga a 18.000 x g por 10 min a 4 °C em uma centrífuga de mesa.</li>
		<li>Transfira supernante para um tubo de microcentrifuge de baixa proteína fresco. As amostras podem ser armazenadas a -20 °C neste ponto, se necessário.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação de amostras e controles
	<ol>
<li>Se as amostras estiverem congeladas, misture (por exemplo, com um termomixer) enquanto elas são descongeladas para dissolver rapidamente a ureia. ATENÇÃO: Não utilize temperaturas acima de 50 °C devido à tendência da ureia de formar poliureia a altas temperaturas.</li>
		<li>Amostra de centrífuga a 18.000 x g por 10 min a 4 °C em uma centrífuga de mesa.</li>
		<li>Transfira 20 μg de amostra para um tubo de microcentrifusidade de baixa ligação fresco e ajuste o volume para 50 μL com tampão de estabilização da ubiquitina.</li>
		<li>Crie um controle negativo usando um volume normalizado de tampão de estabilização da ubiquitina (50 μL). Nesta amostra, nenhuma versão leve de cada peptídeo deve estar presente, permitindo a observação de qualquer contaminação leve decorrente dos peptídeos pesados. Este controle negativo também foi utilizado para o agendamento do tempo de retenção do PRM descrito na seção 3.1.</li>
		<li>Também foi criado um controle positivo com o tampão de estabilização da ubiquitina e a adição de tipos de cadeia comercialmente disponíveis ao volume normalizado de tampão de estabilização da ubiquitina (50 μL). Comumente, K63, K48 e M1 estão disponíveis. Nos resultados representativos foram utilizados 20 ng de K48, K63 e M1.</li>
	</ol></li>
	<li>Redução, alquilação e digestão
	<ol>
<li>Prepare uma solução de 50 mM de bicarbonato de amônio (NH4HCO3) na água e ajuste a amostra para pH = 8 com 1 M NaOH.</li>
		<li>Uma cultura de E. coli cultivada em caldo LB foi centrifugada 5.000 x g por 5 min para formar uma pelota, que foi então lavada 2x com PBS antes da resuspensão no tampão de estabilização da ubiquitina a 5 μg/μL.</li>
		<li>Adicione 1 μg de E. coli lysate a cada amostra e controle. Este protocolo usa E. coli (DH10B), mas qualquer lise complexa sem ubiquitina pode ser usada. Note que a ubiquitina é comum a todos os eucariotes. NOTA: O uso de uma matriz de e. coli lysate reduz a perda de peptídeos devido à adesão inespecífica ao plasticware. Isso é particularmente perceptível no controle negativo ou amostras com um teor proteico limitado e tem um forte impacto na observação de K6312.</li>
		<li>Prepare uma solução de 500 mM tris (2-carboxyethyl)fosphine (TCEP) em água de grau MS (DTT pode ser usado como alternativa).</li>
		<li>Reduza as amostras e controles pela adição de TCEP a uma concentração final de 50 mM. Vórtice brevemente antes de incubar por 30 minutos à temperatura ambiente (RT). Se o DTT for usado, a temperatura deve ser elevada para 50 °C. ATENÇÃO: Não utilize temperaturas acima de 50 °C devido à tendência da ureia de formar poliureia a altas temperaturas.</li>
		<li>Prepare uma solução de 550 mM de cloroacetamida (CAA) em NH4HCO3. Guarde no escuro.</li>
		<li>Aquilosar as amostras e controles adicionando CAA a uma concentração final de 55 mM. Vórtice brevemente antes de incubar por 20 minutos no RT no escuro. NOTA: O CAA é usado em vez de iodoacetamida como agente de redução para diminuir a chance de uma modificação dupla carbamidometila (114.0429) em um resíduo de liseina sendo confundido com uma modificação de -GG (114.0429)13.</li>
		<li>Adicione endopeptidase LysC às amostras a 1:25 (w/w) razão ao teor de proteína. Incubar por 3h a 37 °C.</li>
		<li>Diluir as amostras e controles com 200 μL de 50 mM NH4HCO3 pH = 8 (1:5 v/v).</li>
		<li>Adicione trippsina às amostras na proporção de 1:25 w/w com o teor de proteína. Incubar por 12 h a 37 °C.</li>
		<li>Adicione 10% de solução de ácido fórmico (FA) na água de grau MS a uma razão de 1:10 v/v para cada amostra de amostra e controle. Verifique se o pH é <3) antes da limpeza C18 e adicione mais ácido fórmico, se necessário.</li>
		<li>A cada amostra e controle adicione 0,5 μL do padrão de peptídeo pesado criado na seção 1.</li>
	</ol></li>
	<li>Limpeza de peptídeos
	<ol>
<li>Vários fabricantes oferecem c18 dicas de limpeza ou placas. Siga as instruções do fabricante para o produto utilizado, e peptídeos elucidos secos em uma centrífuga a vácuo, pronta para análise em MS.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Análise por LC-MS/MS
<ol><li>Execute a análise inicial de PRM sobre o padrão de peptídeo pesado de forma não programada.<ol>
<li>Resuspenque as amostras secas em 10 μL de tampão de carga de MS 2% ACN/0,05% ácido trifluoroacético (TFA).</li>
		<li>Equipar um HPLC com uma coluna analítica de fase inversa C18 (75 μm x 15 cm, 2 μm 100 Å C18 contas) projetado para nanofluxo MS. Formar gradientes lineares trocando água de grau MS complementada com FA de 0,1% com ACN contendo 0,1% fa. Uma coluna de armadilha sacrificial (75 μm x 2 cm, 3 μm, 100 Å C18 contas) para preservar a vida da coluna analítica foi usada aqui, mas não é necessária.</li>
		<li>Junte a saída da coluna analítica a uma fonte nano-ESI em um espectrômetro de massa de alta resolução.</li>
		<li>Utilize um método de proteômica direcionado adequado para o espectrômetro de massa. Por exemplo, em um Q-Exactive mais um método de dois experimentos, ciclo entre um Full MS e um experimento PRM. Para o experimento Full MS, foi utilizada uma resolução de 120.000 com uma meta AGC de 1e6 e 240 ms como TI Máxima. Para o experimento PRM, o mesmo alvo AGC e TI máxima foi utilizado com uma resolução menor de 60.000 e uma janela de isolamento de 1,2 m/z.</li>
		<li>Injete 200 ng do controle negativo na coluna analítica usando o painel automático HPLC. Aplique um gradiente linear à amostra na coluna analítica aumentando a concentração de ACN de 2-25% durante um período de ~45 min. NOTA: A concentração de 25% de ACN é menor do que o habitual para proteômica devido à baixa natureza hidrofílica dos peptídeos típicos característicos da ubiqutina. Se outros peptídeos forem quantificados, uma maior concentração de ACN pode ser desejada para alcançar uma boa separação de alvos.</li>
		<li>Analise os resultados da execução de agendamento conforme descrito na seção 4.2 para criar uma lista de inclusão programada.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Análise das amostras<ol>
<li>Execute as amostras restantes conforme descrito para o agendamento em 3.1, além do uso da lista de inclusão programada criada na seção 4.2. NOTA: Um branco deve ser executado após o controle positivo para garantir que nenhuma transferência da execução anterior esteja sendo detectada em amostras subsequentes.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Análise de software
<ol><li>Crie uma lista de inclusão de formatação adequada para o MS utilizado. Este protocolo utilizou o software de código aberto Skyline (versão 19.1.0.193) (https://skyline.ms), que oferece suporte e ajuda bem documentados. Uma lista de inclusão pode ser criada para vários espectrômetros de massa usando a instalação da lista de isolamento de exportação.<ol>
<li>Abra um novo documento do Skyline.</li>
		<li>Selecione modificações de isótopos pesados conforme apropriado para peptídeos pesados característicos da topologia. Em Configurações| Configurações de peptídeos na guia Modificação, clique no campo de nome para ver a modificação potencial. A seleção é baseada no estado isotópico dos peptídeos pesados comprados. Neste exemplo, peptídeos sintéticos transportando uma Lysine pesada (13C615N2-lysine) ou uma Arginina pesada (13C615N4-arginina) no C-terminus foram usados. Os rótulos apropriados seriam: "Label:13C(6)15N(2) (C-term K)" e "Label:13C(6)15N(4) (C-term R)".</li>
		<li>Selecione Configurações| Transição. Na guia Filtro incluem Cargas precursoras 2, 3, 4.</li>
		<li>Insira peptídeos selecionando Editar| Insira| Peptídeos.</li>
		<li>Preencha os campos relevantes, incluindo a sequência de peptídeos características da topologia e um nome de proteína (por exemplo, "Chain–K63").</li>
		<li>Expanda cada peptídeo agora mostrado no painel Targets. Exclua estados de cobrança indesejados. O estado de carga preferencial e a energia de colisão, que podem diferir com base no espectrômetro de massa utilizado, para cada peptídeo característico da topologia é mostrado na Tabela 1.</li>
		<li>Para cada peptídeo característico da topologia (exceto para M1 onde o GG está incluído na sequência) clique com o botão direito do mouse na sequência e selecione Modificar. Adicione um GG como uma modificação estrutural clicando no campo de nome e selecionando <Mostre tudo... > antes de selecionar "GlyGly (K)".</li>
		<li>Exportar a lista de isolamento Arquivo| Exportação| Lista de isolamento,selecione o tipo de instrumento e defina o tipo de método como Padrão. A seleção ok abrirá um prompt para salvar um arquivo *.csv que pode ser usado para criar um método PRM.</li>
	</ol></li>
	<li>Crie uma lista de inclusão programada com base em uma execução de agendamento de peptídeos pesados explicada aqui usando o software Skyline de código aberto.<ol>
<li>Crie uma lista de destinos descrita na seção 4.1.</li>
		<li>Importe o agendamento executado em 3.1 selecionando Arquivo| Importação| Resultados.</li>
		<li>Revise as identificações. O sinal pesado para cada peptídeo é observável clicando na massa para cada entrada de peptídeo pesado. O reconhecimento correto do pico é frequentemente determinado automaticamente, mas o software pode exigir curadoria manual selecionando o pico usando clique e arraste sob o eixo x.</li>
		<li>Os tempos de retenção selecionados para as variantes pesadas também são aplicados às versões leves, criando assim um cronograma para o PRM. A janela de agendamento pode ser modificada em Configurações| Configurações de peptídeos usando a guia Previsão, alterando a janela de tempo.</li>
		<li>Uma lista de inclusão programada agora pode ser exportada usando File| Exportação| Lista de isolamento e seleção do tipo de instrumento e tipo de método de configuração apropriados para agendado.</li>
	</ol></li>
	<li>Analise os dados.<ol>
<li>Importe as amostras da mesma forma que para a análise de agendamento na seção 4.2.</li>
		<li>Após a importação completa de todas as amostras, recomenda-se a curadoria das transições. Este é o processo pelo qual as transições com a interferência ou as más relações sinal-ruído são removidas. Um exemplo de cromatograma antes e depois da curadoria é mostrado na Figura 4.</li>
		<li>Os dados agora podem ser exportados com o botão direito do mouse em gráficos relevantes e selecionando dados de cópia ou selecionando Arquivo| Exportação| Resultados.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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Os autores não declaram interesses concorrentes.

A análise do estado de oniquitina dentro de um proteome é de crescente importância para uma ampla variedade de questões biológicas. A descrição do estado de ubiquiinação de uma amostra deve focar não apenas no perfil das proteínas que estão sendoubiquitinadas, mas também na topologia de tal ubiquiinação. A avaliação dessa topologia por MS direcionada, como descrito aqui, tem um papel em uma ampla gama de investigações biológicas.
Deve-se entender que o protocolo aqui descri...

A regulação estreita da função proteica e da estabilidade é de suma importância, pois são os principais impulsionadores do controle fenotípico da biologia. A função de uma proteína é construída a partir de dois componentes: sua sequência intrínseca de polipeptídeos e quaisquer modificações pós-transicionais (PTMs). Vários PTMs químicos foram identificados, incluindo glicosilação, fosforilação, acetilação e metilação1. Em 1975, Goldstein et al.2 identificaram uma pequena proteína e a chamaram de ubiquitina devido à sua natureza onipresente. A ubiquitina foi considerada importante na degradação da proteína3. No entanto, desde então, foi estabelecido que a função da ubiquitina como molécula de sinalização vai muito além da regulação da estabilidade proteica. A sinalização da ubiquitina está envolvida em uma ampla gama de outras funções biológicas, como estabilização de proteínas, autofagia, controle de ciclo celular e tráfico de proteínas4.
Enquanto outros PTMs são geralmente binários (ou seja, a proteína é modificada ou deixada não modificada) para um determinado local, a ubiquitina pode modificar uma proteína tanto como monômero ou como uma cadeia polimérica, com a própria ubiquitina ligada. Além disso, esta cadeia de poliugenência pode desenvolver-se em várias topologias com a ubiquização da ubiquitina anterior anexando-se a um dos oito locais de ligação5,6. A ubiquitina é transferida por um processo enzimático multipreitado (Figura 1)onde o C-terminus da ubiquitina está ligado a um de seus sete resíduos de liseina (K06, K11, K27, K29, K33, K48 ou K63) ou o terminal N da ubiquitina anterior (referido como ubiquização M1 ou linear)5,6. Esta topologia de cadeia é a chave para o destino da proteína sob modificação. Por exemplo, a modificação com uma cadeia ligada a K48 ou K11 leva à degradação da proteína modificada no proteasome, enquanto uma cadeia linear é necessária para a ativação da sinalização NF-kB. Assim, a distribuição relativa dessas topologias em cadeia é relevante para uma ampla variedade de questões biológicas.
O uso da espectrometria de massa (MS) é de particular benefício para a análise topologia da cadeia de ubiquitina, pois não depende de interações baseadas em anticorpos ou à afinidade7,8, muitas das quais têm especificidade limitada e não diferenciam entre os vários tipos de cadeia. Uma possibilidade diferente de detecção é usar mutantes de ubiquitina geneticamente modificados. Aqui, uma lise específica é trocada por arginina, que não pode suportar a modificação por ubiquitina. A falta de formação da cadeia de ubiquitina na proteína do substrato é então interpretada como evidência para uma topologia específica9.
A identificação baseada em MS de proteínasubiquitinadas baseia-se no fato de que o C-terminus de ubiquitina contém um resíduo de arginina na posição 74 que é reconhecido pela trippsina durante a preparação proteolítica das amostras para análise de MS, separando a glicina dupla terminal C. Este GlyGly (-GG) permanece ligado ao grupo ε-amino do resíduo de liseina da proteína do substrato. Para a análise de topologia da ubiquitina, a modificação ocorre em um dos sete resíduos de ubiqutina. Isso cria um conjunto de sete peptídeos-chave que carregam um resíduo de liseina que é modificado por GG, específico para cada uma das topologias(Figura 2). Por exemplo, com a topologia K06, a lisina na posição 6 na sequência de aminoácidos será protegida da digestão tripptica com uma modificação de -GG de 114 Da adicionada a esta lisina.
A identificação de peptídeos pré-determinados específicos por MS é referida como proteômica direcionada, ou, mais especificamente, aquisição de peptídeos direcionados10. Dois métodos foram desenvolvidos dependendo do desempenho do espectrômetro de massa que está sendo utilizado. São selecionados monitoramento de reação (SRM), também chamado de monitoramento de reação múltipla (MRM) e monitoramento de reação paralela (PRM). O SRM envolve a seleção de transições constituída pelo precursor m/z e pelo produto íon m/z. Por outro lado, o PRM requer apenas o precursor m/z. Seleção de postes, é realizada uma pesquisa completa dos íons do produto. Isso tem a vantagem de que não é necessária seleção de íons de produtos apropriados para quantitação no espectrômetro de massa específico antes da medição11. Tanto o SRM quanto o PRM podem, dependendo do instrumento, ser agendados. O agendamento é a prática de atribuir uma janela de tempo durante a qual um determinado íon será incluído para análise, pois os peptídeos estão eluvando em tempos de retenção definidos do sistema cromatográfico. Reduzir o número de íons sendo interrogados a qualquer momento aumenta a frequência de interrogatório desses íons programados naquele momento, melhorando assim a precisão dos dados.
Em geral, a aplicação de proteômica direcionada para topologia de ubiquína é a mesma de qualquer outro experimento de proteômica direcionado. No entanto, duas diferenças fundamentais são importantes: primeiro, deve-se considerar a estabilidade das cadeias de ubiquitina. Existem múltiplas enzimas debiquitinadas potentes (DUBs) que rapidamente degradam cadeias sobre a lise celular. As proteases específicas da ubiquitina se enquadram em duas categorias, as tioesterases e metaloproteases. A maioria das hidrolases da ubiquiquitina são tiaesterases e carregam um resíduo de cisteína em seu centro ativo. Ao alquilar este resíduo de cisteína, eles podem ser inativados. Como tal, o uso de tampões de estabilização de ubiquitina contendo agentes alquilantes, como n-ethylmaleimida (NEM), e produtos químicos altamente desnaturados, e manter amostras refrigeradas é vital para uma análise bem sucedida. Em segundo lugar, ao contrário de outros experimentos direcionados, a escolha do peptídeo é fixa. Em um experimento típico direcionado, um peptídeo proteotipado pode ser selecionado para um bom desempenho cromatógrafo e ionização. Para alguns peptídeos característicos da topologia, como o K48, essas propriedades são boas, enquanto para outros, são menos desejáveis. Por exemplo, a cromatografia K33 em uma configuração típica de fase inversa é ruim devido à formação de um perfil de elução esticada, e as propriedades de ionização precárias do peptídeo K27 reduzem sua visibilidade pela MS12.
Neste protocolo, descrevemos como realizar a avaliação topologia da ubiquitina de uma amostra biológica por PRM. Exemplos de dados para o procedimento são apresentados utilizando uma perturbação do proteasome utilizando tratamento inibidor MG-132 em vários tipos de células diferentes.

<table><tbody><tr><td>Acetonitrile (ACN)</td><td>Merck</td><td>100029</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium bicarbonate (ABC)</td><td>Fluka</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Microfuge 16</td><td></td></tr><tr><td>Chloroacetamide (CAA)</td><td>Sigma</td><td>22790</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf LoBind</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>Formic acid (FA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>85178</td><td></td></tr><tr><td>Heavy Peptides</td><td>JPT Peptide Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Dionex</td><td>Ulitimate 3000</td><td></td></tr><tr><td>LC Column</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>160321</td><td></td></tr><tr><td>Lys C</td><td>Wako</td><td>125-05061</td><td></td></tr><tr><td>Mass Spectrometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q-Exactive Plus</td><td></td></tr><tr><td>N-ethylmaleimide (NEM)</td><td>ACROS Organics</td><td>156100050</td><td></td></tr><tr><td>Positive Control Chain K48</td><td>Boston Biochem</td><td>UC-240</td><td></td></tr><tr><td>Positive Control Chain K63</td><td>Boston Biochem</td><td>UC-340-100</td><td></td></tr><tr><td>Positive Control Chain M1</td><td>Boston Biochem</td><td>UC-710B-025</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Sonifier</td><td>Branson sonifier</td><td>SFX 150</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer Comfort</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td><td>Sigam</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>77720</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Promega</td><td>V1511A</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma</td><td>51456</td><td></td></tr><tr><td>Waters &amp;mu;Elution C&lt;sub&gt;18&lt;/sub&gt; plates</td><td>Waters</td><td>186002318</td><td></td></tr></tbody></table>

ubiquitin chain analysis by parallel reaction monitoring

A avaliação do perfil global das topologias da cadeia de ubiquidades dentro de um proteome é de interesse para responder a uma ampla gama de perguntas biológicas. O protocolo aqui delineado aproveita a modificação di-glicina (-GG) deixada após a digestão tripptic da ubiquitina incorporada em uma cadeia. Ao quantificar esses peptídeos característicos da topologia, a abundância relativa de cada topologia da cadeia de ubiquitina pode ser determinada. As etapas necessárias para quantificar esses peptídeos por um experimento paralelo de monitoramento de reação são relatadas levando em consideração a estabilização das cadeias de ubiquitina. A preparação de controles pesados, lise celular e digestão são descritas juntamente com a configuração adequada do espectrômetro de massa e o fluxo de trabalho de análise de dados. Um exemplo de dados com perturbações na topologia da ubiquitina é apresentado, acompanhado de exemplos de como a otimização do protocolo pode afetar os resultados. Seguindo as etapas traçadas, o usuário poderá realizar uma avaliação global do cenário de topologia da ubiquitina dentro de seu contexto biológico.

Para demonstrar o uso de uma análise da cadeia de ubiquitina pela PRM, foram selecionadas três linhas celulares: uma linha celular de melanoma de camundongos B16, e as duas linhas celulares humanas comuns A549 (células epitriliais basoeliares adenocarcinômicas) e HeLa (células cancerígenas cervicais). Essas culturas cresceram para a fase média em mídia adequada antes de serem tratadas com 0, 10 ou 100 mM MG-132 por 4h antes da colheita. MG-132 é um inibidor proteasome que previne a degradação de proteínas con...

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Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring

Este método descreve a avaliação das mudanças globais na topologia da cadeia de ubiquitina. A avaliação é realizada pela aplicação de uma abordagem de proteômica direcionada baseada em espectrometria de massa.

Análise da cadeia de Ubiquitin por monitoramento de reação paralela

Assessment of the global profile of ubiquitin chain topologies within a proteome is of interest to answer a wide range of biological questions. The ...

ubiquitin-chain-analysis-by-parallel-reaction-monitoring

Research

JoVE Journal

Biochemistry

3.5K visualizações.  Luxembourg Institute of Health. Este método descreve a avaliação das mudanças globais na topologia da cadeia de ubiquitina. A avaliação é realizada pela aplicação de uma abordagem de proteômica direcionada baseada em espectrometria de massa.

Vídeo: Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ubiquitinated proteins, peptides with a diglycine remnant conjugated to the epsilon amino group of lysine (&#39;K-&#949;-diglycine&#39; or simply &#39;diGly&#39;) can be used to track back the original modification site. Efficient immunopurification of diGly peptides combined with sensitive detection by mass spectrometry has resulted in a huge increase in the number of ubiquitination sites identified up to date. We have made several improvements to this workflow, including offline high pH reverse-phase fractionation of peptides prior to the enrichment procedure, and the inclusion of more advanced peptide fragmentation settings in the ion routing multipole. Also, more efficient cleanup of the sample using a filter-based plug in order to retain the antibody beads results in a greater specificity for diGly peptides. These improvements result in the routine detection of more than 23,000 diGly peptides from human cervical cancer cells (HeLa) cell lysates upon proteasome inhibition in the cell. We show the efficacy of this strategy for in-depth analysis of the ubiquitinome profiles of several different cell types and of in vivo samples, such as brain tissue. This study presents an original addition to the toolbox for protein ubiquitination analysis to uncover the deep cellular ubiquitinome.

We present a method for the purification, detection, and identification of diGly peptides that originate from ubiquitinated proteins from complex biological samples. The presented method is reproducible, robust, and outperforms published methods with respect to the level of depth of the ubiquitinome analysis.

Detecção de locais de ubiquitinação de proteínas por enriquecimento de peptídeos e espectrometria de massa

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Bioquímica

Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the cell by controlling protein stability, activity, interactions, and intracellular localization. They enable the cell to respond to signals and to adapt to changes in its environment. Alterations within these mechanisms can lead to severe pathological situations such as neurodegenerative diseases and cancers. The aim of the technique described here is to establish ub/ubls dependent PTMs profiles, rapidly and accurately, from cultured cell lines. The comparison of different profiles obtained from different conditions allows the identification of specific alterations, such as those induced by a treatment for example. Lentiviral mediated cell transduction is performed to create stable cell lines expressing a two-tags (6His and Flag) version of the modifier (ubiquitin or a ubl such as SUMO1 or Nedd8). These tags permit the purification of ubiquitin and therefore of ubiquitinated proteins from the cells. This is done through a two-step purification process: The first one is performed in denaturing conditions using the 6His tag, and the second one in native conditions using the Flag tag. This leads to a highly specific and pure isolation of modified proteins which are subsequently identified and semi-quantified by liquid chromatography followed by tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) technology. Easy informatics analysis of MS data using Excel software enables the establishment of PTM profiles by eliminating background signals. These profiles are compared between each condition in order to identify specific alterations which will then be studied more specifically, starting with their validation by standard biochemistry techniques.

This protocol aims at establishing ubiquitin (Ub) and ubiquitin-likes (Ubls) specific proteomes in order to identify alterations of these kind of post-translational modifications (PTMs), associated with a specific condition such as a treatment or a phenotype.

Perfil de Ubiquitin e Ubiquitin-like Modificações pós-translacionais dependentes e identificação de alterações significativas

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

Detection of Protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. They include ubiquitin-activating enzyme E1, ubiquitin-conjugating enzyme E2, and ubiquitin ligase E3. Unlike to E1 and E2, E3 ubiquitin ligases display substrate specificity. On the other hand, numerous deubiquitylating enzymes have roles in processing polyubiquitinated proteins. Ubiquitination can result in change of protein stability, cellular localization, and biological activity. Mutations of genes involved in the ubiquitination/deubiquitination pathway or altered ubiquitin system function are associated with many different human diseases such as various types of cancer, neurodegeneration, and metabolic disorders. The detection of altered or normal ubiquitination of target proteins may provide a better understanding on the pathogenesis of these diseases. &nbsp;Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro. These protocols are also useful to detect other ubiquitin-like small molecule modification such as sumolyation and neddylation.

Ubiquitination is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. Mutations of genes involved in this modification are associated with many different human diseases. Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro.

Detecção de Ubiquitinação Protein

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Biologia

Evaluation of Substrate Ubiquitylation by E3 Ubiquitin-ligase in Mammalian Cell Lysates

Ubiquitylation is a post-translational modification which occurs in eukaryotic cells that is critical for several biological pathways' regulation, including cell survival, proliferation, and differentiation. It is a reversible process that consists of a covalent attachment of ubiquitin to the substrate through a cascade reaction of at least three different enzymes, composed of E1 (Ubiquitin-activation enzyme), E2 (Ubiquitin-conjugating enzyme), and E3 (Ubiquitin-ligase enzyme). The E3 complex plays an important role in substrate recognition and ubiquitylation. Here, a protocol is described to evaluate substrate ubiquitylation in mammalian cells using transient co-transfection of a plasmid encoding the selected substrate, an E3 ubiquitin ligase, and a tagged ubiquitin. Before lysis, the transfected cells are treated with the proteasome inhibitor MG132 (carbobenzoxy-leu-leu-leucinal) to avoid substrate proteasomal degradation. Furthermore, the cell extract is submitted to small-scale immunoprecipitation (IP) to purify the polyubiquitylated substrate for subsequent detection by western blotting (WB) using specific antibodies for ubiquitin tag. Hence, a consistent and uncomplicated protocol for ubiquitylation assay in mammalian cells is described to assist scientists in addressing ubiquitylation of specific substrates and E3 ubiquitin ligases.

We provide a detailed protocol for a ubiquitylation assay of a specific substrate and an E3 ubiquitin-ligase in mammalian cells. HEK293T cell lines were used for protein overexpression, the polyubiquitylated substrate was purified from cell lysates by immunoprecipitation, and resolved in SDS-PAGE. Immunoblotting was used to visualize this post-translational modification.

Avaliação da Ubiquização substrato por E3 Ubiquitin-ligase em Lysates de Células Mamárias

Ubiquitylation is a post-translational modification which occurs in eukaryotic cells that is critical for several biological pathways' regulation, ...

Medição de ligações cruzadas de DNA-proteína ubiquitiladas, SUMOiladas e ribosiladas com ADP

Quantitative Detection of DNA-Protein Crosslinks and Their Post-Translational Modifications

DNA-protein crosslinks (DPCs) are frequent, ubiquitous, and deleterious DNA lesions, which arise from endogenous DNA damage, enzyme (topoisomerases, methyltransferases, etc.) malfunctioning, or exogenous agents such as chemotherapeutics and crosslinking agents. Once DPCs are induced, several types of post-translational modifications (PTMs) are promptly conjugated to them as early response mechanisms. It has been shown that DPCs can be modified by ubiquitin, small ubiquitin-like modifier (SUMO), and poly-ADP-ribose, which prime the substrates to signal their respective designated repair enzymes and, in some cases, coordinate the repair in sequential manners. As PTMs transpire quickly and are highly reversible, it has been challenging to isolate and detect PTM-conjugated DPCs that usually remain at low levels. Presented here is an immunoassay to purify and quantitatively detect ubiquitylated, SUMOylated, and ADP-ribosylated DPCs (drug-induced topoisomerase DPCs and aldehyde-induced non-specific DPCs) in vivo. This assay is derived from the RADAR (rapid approach to DNA adduct recovery) assay that is used for the isolation of genomic DNA containing DPCs by ethanol precipitation. Following normalization and nuclease digestion, PTMs of DPCs, including ubiquitylation, SUMOylation, and ADP-ribosylation, are detected by immunoblotting using their corresponding antibodies. This robust assay can be utilized to identify and characterize novel molecular mechanisms that repair enzymatic and non-enzymatic DPCs&#160;and has the potential to discover small molecule inhibitors targeting specific factors that regulate PTMs to repair DPCs.

Autor em destaque: Detecção quantitativa de ligações cruzadas de proteínas de DNA e suas modificações pós-traducionais  

The present protocol highlights a modified method to detect and quantify DNA-protein crosslinks (DPCs) and their post-translational modifications (PTMs), including ubiquitylation, SUMOylation, and ADP-ribosylation induced by topoisomerase inhibitors and by formaldehyde, thereby allowing the study of the formation and repair of DPCs and their PTMs.

Detecção quantitativa de ligações cruzadas DNA-proteína e suas modificações pós-traducionais

DNA-protein crosslinks (DPCs) are frequent, ubiquitous, and deleterious DNA lesions, which arise from endogenous DNA damage, enzyme (topoisomerases, ...

<meta charset="utf8"></head><body>Avaliação de variantes de DUB em distúrbios do neurodesenvolvimento usando um ensaio de clivagem

Measuring Enzymatic Activity of Neurodevelopmental Disorder-Associated Deubiquitylating Enzymes via an In Vitro Ubiquitin Chain Cleavage Assay

Neurodevelopmental disorders (NDDs) are associated with impairments in nervous system function but often remain poorly understood at the molecular level. Discrete disorders caused by single genes provide models to investigate mechanisms driving atypical neurodevelopment. Variants of genes encoding deubiquitylating enzyme (DUB) family proteins are associated with several NDDs, but there is a need to determine the pathogenic mechanisms of disorders driven by these gene variants. The impact of gene variants on DUB activity can be experimentally determined using a substrate-independent in vitro ubiquitin cleavage assay. This assay does not require knowledge of downstream substrates to directly measure catalytic activity. Here, the protocol for determining the impact of gene variants on enzymatic activity is modeled using the DUB Ubiquitin Specific Protease 27, X-linked (USP27X), which is mutated in X-linked intellectual disability 105 (XLID105). This experimental pipeline can be used to clarify the mechanisms underlying neurodevelopmental disorders driven by variants in DUB genes.

<meta charset="utf8"></head><body>Medindo a atividade enzimática de enzimas desubiquitilantes associadas a distúrbios do neurodesenvolvimento por meio de um ensaio de clivagem da cadeia de ubiquiti

This protocol explains how to measure the effect of genetic variation associated with neurodevelopmental disorders on deubiquitylating enzyme activity by combining recombinant protein purification with ubiquitin chain cleavage assays.

Medindo a atividade enzimática de enzimas desubiquitilantes associadas a distúrbios do neurodesenvolvimento por meio de um ensaio de clivagem da cadeia de ubiquitina in vitro

Neurodevelopmental disorders (NDDs) are associated with impairments in nervous system function but often remain poorly understood at the molecular level. ...

Análise da cadeia de Ubiquitin por monitoramento de reação paralela

Resumo

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Detecção de locais de ubiquitinação de proteínas por enriquecimento de peptídeos e espectrometria de massa

Perfil de Ubiquitin e Ubiquitin-like Modificações pós-translacionais dependentes e identificação de alterações significativas

Detecção de Ubiquitinação Protein

Avaliação da Ubiquização substrato por E3 Ubiquitin-ligase em Lysates de Células Mamárias

Detecção quantitativa de ligações cruzadas DNA-proteína e suas modificações pós-traducionais

Detecção quantitativa de ligações cruzadas DNA-proteína e suas modificações pós-traducionais

Detecção quantitativa de ligações cruzadas DNA-proteína e suas modificações pós-traducionais

Medindo a atividade enzimática de enzimas desubiquitilantes associadas a distúrbios do neurodesenvolvimento por meio de um ensaio de clivagem da cadeia de ubiquitina in vitro

Medindo a atividade enzimática de enzimas desubiquitilantes associadas a distúrbios do neurodesenvolvimento por meio de um ensaio de clivagem da cadeia de ubiquitina in vitro

Medindo a atividade enzimática de enzimas desubiquitilantes associadas a distúrbios do neurodesenvolvimento por meio de um ensaio de clivagem da cadeia de ubiquitina in vitro