Os autores agradecem a Céline Jeanty por sua ajuda na criação de pelotas celulares com tratamento da MG-132, conforme descrito nos resultados representativos e Elise Mommaerts por sua provisão de pelotas E. coli utilizadas no protocolo.

1. Preparação de um padrão de peptídeo pesado
<ol><li>Dependendo do fornecedor e da qualidade dos peptídeos pesados comprados, os peptídeos pesados precisarão ser diluídos. Este protocolo utilizou as sequências de peptídeos relatadas na Tabela 1, com o aminoácido terminal C modificado para lisina (13C615N2-lysine) ou Arginina (13C615N4-arginina).<ol>
<li>Misture os peptídeos pesados, diluindo a mistura com 50% de acetonitrila (ACN) para criar uma mistura de peptídeos com cada peptídeo a 10 μM.</li>
		<li>Crie alíquotas da mistura de peptídeos e armazene a -80 °C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparação da amostra
<ol><li>Lise amostral NOTA: A estabilidade das cadeias de ubiquitina deve ser considerada durante a preparação da amostra. Mantenha amostras biológicas e tampões refrigerados a 4 °C e adicione amostras ao tampão de estabilização da ubiquitina o mais rápido possível.<ol>
<li>Prepare uma solução de 1 M NH4HCO3 (bicarbonato de amônio) na água e ajuste o pH para 8 usando 1 M NaOH.</li>
		<li>Prepare uma solução de 200 mM N-ethylmaleimida (NEM) na água.</li>
		<li>Prepare o tampão de estabilização da ubiquitina usando 8 M de ureia em 50 mM NH4HCO3/10 mM NEM. O tampão de estabilização da ubiquitina deve ser preparado fresco a cada vez. NOTA: Uma solução de 5 mL de 8 M de ureia exigirá consideravelmente menos de 5 mL de água dada a expansão da água quando em uma solução saturada com ureia. ATENÇÃO: Não prepare o tampão acima de 50 °C devido à tendência da ureia de formar poliureia a altas temperaturas.</li>
		<li>Resuspenque a amostra biológica a ser investigada no tampão de estabilização da ubiquitina visando 0,5 μg/μL de proteína e lise as células com um método apropriado para a amostra. Um método de sonicação composto por três pulsos de 10 s com um sonifier SFX 150 Branson definido com 70% de intensidade com quebras de 10 s no gelo entre cada pulso, foi usado para as linhas celulares neste protocolo.</li>
		<li>Amostra de centrífuga a 18.000 x g por 10 min a 4 °C em uma centrífuga de mesa.</li>
		<li>Transfira supernante para um tubo de microcentrifuge de baixa proteína fresco. As amostras podem ser armazenadas a -20 °C neste ponto, se necessário.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação de amostras e controles
	<ol>
<li>Se as amostras estiverem congeladas, misture (por exemplo, com um termomixer) enquanto elas são descongeladas para dissolver rapidamente a ureia. ATENÇÃO: Não utilize temperaturas acima de 50 °C devido à tendência da ureia de formar poliureia a altas temperaturas.</li>
		<li>Amostra de centrífuga a 18.000 x g por 10 min a 4 °C em uma centrífuga de mesa.</li>
		<li>Transfira 20 μg de amostra para um tubo de microcentrifusidade de baixa ligação fresco e ajuste o volume para 50 μL com tampão de estabilização da ubiquitina.</li>
		<li>Crie um controle negativo usando um volume normalizado de tampão de estabilização da ubiquitina (50 μL). Nesta amostra, nenhuma versão leve de cada peptídeo deve estar presente, permitindo a observação de qualquer contaminação leve decorrente dos peptídeos pesados. Este controle negativo também foi utilizado para o agendamento do tempo de retenção do PRM descrito na seção 3.1.</li>
		<li>Também foi criado um controle positivo com o tampão de estabilização da ubiquitina e a adição de tipos de cadeia comercialmente disponíveis ao volume normalizado de tampão de estabilização da ubiquitina (50 μL). Comumente, K63, K48 e M1 estão disponíveis. Nos resultados representativos foram utilizados 20 ng de K48, K63 e M1.</li>
	</ol></li>
	<li>Redução, alquilação e digestão
	<ol>
<li>Prepare uma solução de 50 mM de bicarbonato de amônio (NH4HCO3) na água e ajuste a amostra para pH = 8 com 1 M NaOH.</li>
		<li>Uma cultura de E. coli cultivada em caldo LB foi centrifugada 5.000 x g por 5 min para formar uma pelota, que foi então lavada 2x com PBS antes da resuspensão no tampão de estabilização da ubiquitina a 5 μg/μL.</li>
		<li>Adicione 1 μg de E. coli lysate a cada amostra e controle. Este protocolo usa E. coli (DH10B), mas qualquer lise complexa sem ubiquitina pode ser usada. Note que a ubiquitina é comum a todos os eucariotes. NOTA: O uso de uma matriz de e. coli lysate reduz a perda de peptídeos devido à adesão inespecífica ao plasticware. Isso é particularmente perceptível no controle negativo ou amostras com um teor proteico limitado e tem um forte impacto na observação de K6312.</li>
		<li>Prepare uma solução de 500 mM tris (2-carboxyethyl)fosphine (TCEP) em água de grau MS (DTT pode ser usado como alternativa).</li>
		<li>Reduza as amostras e controles pela adição de TCEP a uma concentração final de 50 mM. Vórtice brevemente antes de incubar por 30 minutos à temperatura ambiente (RT). Se o DTT for usado, a temperatura deve ser elevada para 50 °C. ATENÇÃO: Não utilize temperaturas acima de 50 °C devido à tendência da ureia de formar poliureia a altas temperaturas.</li>
		<li>Prepare uma solução de 550 mM de cloroacetamida (CAA) em NH4HCO3. Guarde no escuro.</li>
		<li>Aquilosar as amostras e controles adicionando CAA a uma concentração final de 55 mM. Vórtice brevemente antes de incubar por 20 minutos no RT no escuro. NOTA: O CAA é usado em vez de iodoacetamida como agente de redução para diminuir a chance de uma modificação dupla carbamidometila (114.0429) em um resíduo de liseina sendo confundido com uma modificação de -GG (114.0429)13.</li>
		<li>Adicione endopeptidase LysC às amostras a 1:25 (w/w) razão ao teor de proteína. Incubar por 3h a 37 °C.</li>
		<li>Diluir as amostras e controles com 200 μL de 50 mM NH4HCO3 pH = 8 (1:5 v/v).</li>
		<li>Adicione trippsina às amostras na proporção de 1:25 w/w com o teor de proteína. Incubar por 12 h a 37 °C.</li>
		<li>Adicione 10% de solução de ácido fórmico (FA) na água de grau MS a uma razão de 1:10 v/v para cada amostra de amostra e controle. Verifique se o pH é <3) antes da limpeza C18 e adicione mais ácido fórmico, se necessário.</li>
		<li>A cada amostra e controle adicione 0,5 μL do padrão de peptídeo pesado criado na seção 1.</li>
	</ol></li>
	<li>Limpeza de peptídeos
	<ol>
<li>Vários fabricantes oferecem c18 dicas de limpeza ou placas. Siga as instruções do fabricante para o produto utilizado, e peptídeos elucidos secos em uma centrífuga a vácuo, pronta para análise em MS.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Análise por LC-MS/MS
<ol><li>Execute a análise inicial de PRM sobre o padrão de peptídeo pesado de forma não programada.<ol>
<li>Resuspenque as amostras secas em 10 μL de tampão de carga de MS 2% ACN/0,05% ácido trifluoroacético (TFA).</li>
		<li>Equipar um HPLC com uma coluna analítica de fase inversa C18 (75 μm x 15 cm, 2 μm 100 Å C18 contas) projetado para nanofluxo MS. Formar gradientes lineares trocando água de grau MS complementada com FA de 0,1% com ACN contendo 0,1% fa. Uma coluna de armadilha sacrificial (75 μm x 2 cm, 3 μm, 100 Å C18 contas) para preservar a vida da coluna analítica foi usada aqui, mas não é necessária.</li>
		<li>Junte a saída da coluna analítica a uma fonte nano-ESI em um espectrômetro de massa de alta resolução.</li>
		<li>Utilize um método de proteômica direcionado adequado para o espectrômetro de massa. Por exemplo, em um Q-Exactive mais um método de dois experimentos, ciclo entre um Full MS e um experimento PRM. Para o experimento Full MS, foi utilizada uma resolução de 120.000 com uma meta AGC de 1e6 e 240 ms como TI Máxima. Para o experimento PRM, o mesmo alvo AGC e TI máxima foi utilizado com uma resolução menor de 60.000 e uma janela de isolamento de 1,2 m/z.</li>
		<li>Injete 200 ng do controle negativo na coluna analítica usando o painel automático HPLC. Aplique um gradiente linear à amostra na coluna analítica aumentando a concentração de ACN de 2-25% durante um período de ~45 min. NOTA: A concentração de 25% de ACN é menor do que o habitual para proteômica devido à baixa natureza hidrofílica dos peptídeos típicos característicos da ubiqutina. Se outros peptídeos forem quantificados, uma maior concentração de ACN pode ser desejada para alcançar uma boa separação de alvos.</li>
		<li>Analise os resultados da execução de agendamento conforme descrito na seção 4.2 para criar uma lista de inclusão programada.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Análise das amostras<ol>
<li>Execute as amostras restantes conforme descrito para o agendamento em 3.1, além do uso da lista de inclusão programada criada na seção 4.2. NOTA: Um branco deve ser executado após o controle positivo para garantir que nenhuma transferência da execução anterior esteja sendo detectada em amostras subsequentes.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Análise de software
<ol><li>Crie uma lista de inclusão de formatação adequada para o MS utilizado. Este protocolo utilizou o software de código aberto Skyline (versão 19.1.0.193) (https://skyline.ms), que oferece suporte e ajuda bem documentados. Uma lista de inclusão pode ser criada para vários espectrômetros de massa usando a instalação da lista de isolamento de exportação.<ol>
<li>Abra um novo documento do Skyline.</li>
		<li>Selecione modificações de isótopos pesados conforme apropriado para peptídeos pesados característicos da topologia. Em Configurações| Configurações de peptídeos na guia Modificação, clique no campo de nome para ver a modificação potencial. A seleção é baseada no estado isotópico dos peptídeos pesados comprados. Neste exemplo, peptídeos sintéticos transportando uma Lysine pesada (13C615N2-lysine) ou uma Arginina pesada (13C615N4-arginina) no C-terminus foram usados. Os rótulos apropriados seriam: "Label:13C(6)15N(2) (C-term K)" e "Label:13C(6)15N(4) (C-term R)".</li>
		<li>Selecione Configurações| Transição. Na guia Filtro incluem Cargas precursoras 2, 3, 4.</li>
		<li>Insira peptídeos selecionando Editar| Insira| Peptídeos.</li>
		<li>Preencha os campos relevantes, incluindo a sequência de peptídeos características da topologia e um nome de proteína (por exemplo, "Chain–K63").</li>
		<li>Expanda cada peptídeo agora mostrado no painel Targets. Exclua estados de cobrança indesejados. O estado de carga preferencial e a energia de colisão, que podem diferir com base no espectrômetro de massa utilizado, para cada peptídeo característico da topologia é mostrado na Tabela 1.</li>
		<li>Para cada peptídeo característico da topologia (exceto para M1 onde o GG está incluído na sequência) clique com o botão direito do mouse na sequência e selecione Modificar. Adicione um GG como uma modificação estrutural clicando no campo de nome e selecionando <Mostre tudo... > antes de selecionar "GlyGly (K)".</li>
		<li>Exportar a lista de isolamento Arquivo| Exportação| Lista de isolamento,selecione o tipo de instrumento e defina o tipo de método como Padrão. A seleção ok abrirá um prompt para salvar um arquivo *.csv que pode ser usado para criar um método PRM.</li>
	</ol></li>
	<li>Crie uma lista de inclusão programada com base em uma execução de agendamento de peptídeos pesados explicada aqui usando o software Skyline de código aberto.<ol>
<li>Crie uma lista de destinos descrita na seção 4.1.</li>
		<li>Importe o agendamento executado em 3.1 selecionando Arquivo| Importação| Resultados.</li>
		<li>Revise as identificações. O sinal pesado para cada peptídeo é observável clicando na massa para cada entrada de peptídeo pesado. O reconhecimento correto do pico é frequentemente determinado automaticamente, mas o software pode exigir curadoria manual selecionando o pico usando clique e arraste sob o eixo x.</li>
		<li>Os tempos de retenção selecionados para as variantes pesadas também são aplicados às versões leves, criando assim um cronograma para o PRM. A janela de agendamento pode ser modificada em Configurações| Configurações de peptídeos usando a guia Previsão, alterando a janela de tempo.</li>
		<li>Uma lista de inclusão programada agora pode ser exportada usando File| Exportação| Lista de isolamento e seleção do tipo de instrumento e tipo de método de configuração apropriados para agendado.</li>
	</ol></li>
	<li>Analise os dados.<ol>
<li>Importe as amostras da mesma forma que para a análise de agendamento na seção 4.2.</li>
		<li>Após a importação completa de todas as amostras, recomenda-se a curadoria das transições. Este é o processo pelo qual as transições com a interferência ou as más relações sinal-ruído são removidas. Um exemplo de cromatograma antes e depois da curadoria é mostrado na Figura 4.</li>
		<li>Os dados agora podem ser exportados com o botão direito do mouse em gráficos relevantes e selecionando dados de cópia ou selecionando Arquivo| Exportação| Resultados.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. 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Os autores não declaram interesses concorrentes.

A análise do estado de oniquitina dentro de um proteome é de crescente importância para uma ampla variedade de questões biológicas. A descrição do estado de ubiquiinação de uma amostra deve focar não apenas no perfil das proteínas que estão sendoubiquitinadas, mas também na topologia de tal ubiquiinação. A avaliação dessa topologia por MS direcionada, como descrito aqui, tem um papel em uma ampla gama de investigações biológicas.
Deve-se entender que o protocolo aqui descri...

A regulação estreita da função proteica e da estabilidade é de suma importância, pois são os principais impulsionadores do controle fenotípico da biologia. A função de uma proteína é construída a partir de dois componentes: sua sequência intrínseca de polipeptídeos e quaisquer modificações pós-transicionais (PTMs). Vários PTMs químicos foram identificados, incluindo glicosilação, fosforilação, acetilação e metilação1. Em 1975, Goldstein et al.2 identificaram uma pequena proteína e a chamaram de ubiquitina devido à sua natureza onipresente. A ubiquitina foi considerada importante na degradação da proteína3. No entanto, desde então, foi estabelecido que a função da ubiquitina como molécula de sinalização vai muito além da regulação da estabilidade proteica. A sinalização da ubiquitina está envolvida em uma ampla gama de outras funções biológicas, como estabilização de proteínas, autofagia, controle de ciclo celular e tráfico de proteínas4.
Enquanto outros PTMs são geralmente binários (ou seja, a proteína é modificada ou deixada não modificada) para um determinado local, a ubiquitina pode modificar uma proteína tanto como monômero ou como uma cadeia polimérica, com a própria ubiquitina ligada. Além disso, esta cadeia de poliugenência pode desenvolver-se em várias topologias com a ubiquização da ubiquitina anterior anexando-se a um dos oito locais de ligação5,6. A ubiquitina é transferida por um processo enzimático multipreitado (Figura 1)onde o C-terminus da ubiquitina está ligado a um de seus sete resíduos de liseina (K06, K11, K27, K29, K33, K48 ou K63) ou o terminal N da ubiquitina anterior (referido como ubiquização M1 ou linear)5,6. Esta topologia de cadeia é a chave para o destino da proteína sob modificação. Por exemplo, a modificação com uma cadeia ligada a K48 ou K11 leva à degradação da proteína modificada no proteasome, enquanto uma cadeia linear é necessária para a ativação da sinalização NF-kB. Assim, a distribuição relativa dessas topologias em cadeia é relevante para uma ampla variedade de questões biológicas.
O uso da espectrometria de massa (MS) é de particular benefício para a análise topologia da cadeia de ubiquitina, pois não depende de interações baseadas em anticorpos ou à afinidade7,8, muitas das quais têm especificidade limitada e não diferenciam entre os vários tipos de cadeia. Uma possibilidade diferente de detecção é usar mutantes de ubiquitina geneticamente modificados. Aqui, uma lise específica é trocada por arginina, que não pode suportar a modificação por ubiquitina. A falta de formação da cadeia de ubiquitina na proteína do substrato é então interpretada como evidência para uma topologia específica9.
A identificação baseada em MS de proteínasubiquitinadas baseia-se no fato de que o C-terminus de ubiquitina contém um resíduo de arginina na posição 74 que é reconhecido pela trippsina durante a preparação proteolítica das amostras para análise de MS, separando a glicina dupla terminal C. Este GlyGly (-GG) permanece ligado ao grupo ε-amino do resíduo de liseina da proteína do substrato. Para a análise de topologia da ubiquitina, a modificação ocorre em um dos sete resíduos de ubiqutina. Isso cria um conjunto de sete peptídeos-chave que carregam um resíduo de liseina que é modificado por GG, específico para cada uma das topologias(Figura 2). Por exemplo, com a topologia K06, a lisina na posição 6 na sequência de aminoácidos será protegida da digestão tripptica com uma modificação de -GG de 114 Da adicionada a esta lisina.
A identificação de peptídeos pré-determinados específicos por MS é referida como proteômica direcionada, ou, mais especificamente, aquisição de peptídeos direcionados10. Dois métodos foram desenvolvidos dependendo do desempenho do espectrômetro de massa que está sendo utilizado. São selecionados monitoramento de reação (SRM), também chamado de monitoramento de reação múltipla (MRM) e monitoramento de reação paralela (PRM). O SRM envolve a seleção de transições constituída pelo precursor m/z e pelo produto íon m/z. Por outro lado, o PRM requer apenas o precursor m/z. Seleção de postes, é realizada uma pesquisa completa dos íons do produto. Isso tem a vantagem de que não é necessária seleção de íons de produtos apropriados para quantitação no espectrômetro de massa específico antes da medição11. Tanto o SRM quanto o PRM podem, dependendo do instrumento, ser agendados. O agendamento é a prática de atribuir uma janela de tempo durante a qual um determinado íon será incluído para análise, pois os peptídeos estão eluvando em tempos de retenção definidos do sistema cromatográfico. Reduzir o número de íons sendo interrogados a qualquer momento aumenta a frequência de interrogatório desses íons programados naquele momento, melhorando assim a precisão dos dados.
Em geral, a aplicação de proteômica direcionada para topologia de ubiquína é a mesma de qualquer outro experimento de proteômica direcionado. No entanto, duas diferenças fundamentais são importantes: primeiro, deve-se considerar a estabilidade das cadeias de ubiquitina. Existem múltiplas enzimas debiquitinadas potentes (DUBs) que rapidamente degradam cadeias sobre a lise celular. As proteases específicas da ubiquitina se enquadram em duas categorias, as tioesterases e metaloproteases. A maioria das hidrolases da ubiquiquitina são tiaesterases e carregam um resíduo de cisteína em seu centro ativo. Ao alquilar este resíduo de cisteína, eles podem ser inativados. Como tal, o uso de tampões de estabilização de ubiquitina contendo agentes alquilantes, como n-ethylmaleimida (NEM), e produtos químicos altamente desnaturados, e manter amostras refrigeradas é vital para uma análise bem sucedida. Em segundo lugar, ao contrário de outros experimentos direcionados, a escolha do peptídeo é fixa. Em um experimento típico direcionado, um peptídeo proteotipado pode ser selecionado para um bom desempenho cromatógrafo e ionização. Para alguns peptídeos característicos da topologia, como o K48, essas propriedades são boas, enquanto para outros, são menos desejáveis. Por exemplo, a cromatografia K33 em uma configuração típica de fase inversa é ruim devido à formação de um perfil de elução esticada, e as propriedades de ionização precárias do peptídeo K27 reduzem sua visibilidade pela MS12.
Neste protocolo, descrevemos como realizar a avaliação topologia da ubiquitina de uma amostra biológica por PRM. Exemplos de dados para o procedimento são apresentados utilizando uma perturbação do proteasome utilizando tratamento inibidor MG-132 em vários tipos de células diferentes.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (ACN)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate (ABC)</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Microfuge 16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroacetamide (CAA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>22790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf LoBind</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (FA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>85178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heavy Peptides</td>
			<td>JPT Peptide Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC</td>
			<td>Dionex</td>
			<td>Ulitimate 3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC Column</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>160321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lys C</td>
			<td>Wako</td>
			<td>125-05061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q-Exactive Plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmaleimide (NEM)</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>156100050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Control Chain K48</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>UC-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Control Chain K63</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>UC-340-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Control Chain M1</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>UC-710B-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonifier</td>
			<td>Branson sonifier</td>
			<td>SFX 150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Thermomixer Comfort</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Sigam</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>77720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V1511A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>51456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters &#956;Elution C18 plates</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186002318</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ubiquitin chain analysis by parallel reaction monitoring

A avaliação do perfil global das topologias da cadeia de ubiquidades dentro de um proteome é de interesse para responder a uma ampla gama de perguntas biológicas. O protocolo aqui delineado aproveita a modificação di-glicina (-GG) deixada após a digestão tripptic da ubiquitina incorporada em uma cadeia. Ao quantificar esses peptídeos característicos da topologia, a abundância relativa de cada topologia da cadeia de ubiquitina pode ser determinada. As etapas necessárias para quantificar esses peptídeos por um experimento paralelo de monitoramento de reação são relatadas levando em consideração a estabilização das cadeias de ubiquitina. A preparação de controles pesados, lise celular e digestão são descritas juntamente com a configuração adequada do espectrômetro de massa e o fluxo de trabalho de análise de dados. Um exemplo de dados com perturbações na topologia da ubiquitina é apresentado, acompanhado de exemplos de como a otimização do protocolo pode afetar os resultados. Seguindo as etapas traçadas, o usuário poderá realizar uma avaliação global do cenário de topologia da ubiquitina dentro de seu contexto biológico.

Para demonstrar o uso de uma análise da cadeia de ubiquitina pela PRM, foram selecionadas três linhas celulares: uma linha celular de melanoma de camundongos B16, e as duas linhas celulares humanas comuns A549 (células epitriliais basoeliares adenocarcinômicas) e HeLa (células cancerígenas cervicais). Essas culturas cresceram para a fase média em mídia adequada antes de serem tratadas com 0, 10 ou 100 mM MG-132 por 4h antes da colheita. MG-132 é um inibidor proteasome que previne a degradação de proteínas con...

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Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring

Este método descreve a avaliação das mudanças globais na topologia da cadeia de ubiquitina. A avaliação é realizada pela aplicação de uma abordagem de proteômica direcionada baseada em espectrometria de massa.

Análise da cadeia de Ubiquitin por monitoramento de reação paralela

Assessment of the global profile of ubiquitin chain topologies within a proteome is of interest to answer a wide range of biological questions. The ...

ubiquitin-chain-analysis-by-parallel-reaction-monitoring

Research

JoVE Journal

Biochemistry

3.5K visualizações.  Luxembourg Institute of Health. Este método descreve a avaliação das mudanças globais na topologia da cadeia de ubiquitina. A avaliação é realizada pela aplicação de uma abordagem de proteômica direcionada baseada em espectrometria de massa.

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2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of protein-protein interactions (PPI) is no novelty, experimental approaches aiming to characterize endogenous protein-metabolite interactions (PMI) constitute a rather recent development. Herein, we present a protocol that allows simultaneous characterization of the PPI and PMI of a protein of choice, referred to as bait. Our protocol was optimized for Arabidopsis cell cultures and combines affinity purification (AP) with mass spectrometry (MS)-based protein and metabolite detection. In short, transgenic Arabidopsis lines, expressing bait protein fused to an affinity tag, are first lysed to obtain a native cellular extract. Anti-tag antibodies are used to pull down protein and metabolite partners of the bait protein. The affinity-purified complexes are extracted using a one-step methyl tert-butyl ether (MTBE)/methanol/water method. Whilst metabolites separate into either the polar or the hydrophobic phase, proteins can be found in the pellet. Both metabolites and proteins are then analyzed by ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS or UPLC-MS/MS). Empty-vector (EV) control lines are used to exclude false positives. The major advantage of our protocol is that it enables identification of protein and metabolite partners of a target protein in parallel in near-physiological conditions (cellular lysate). The presented method is straightforward, fast, and can be easily adapted to biological systems other than plant cell cultures.

Protein-protein and protein-metabolite interactions are crucial for all cellular functions. Herein, we describe a protocol that allows parallel analysis of these interactions with a protein of choice. Our protocol was optimized for plant cell cultures and combines affinity purification with mass spectrometry-based protein and metabolite detection.

2 em 1: uma etapa de purificação da afinidade para a análise paralela de proteína-proteína e proteína-metabólito complexos

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Bioquímica

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded in the thylakoid membrane harvest solar energy to drive electrons from water to NADP+ via two photosystems, and use the created proton gradient for production of ATP. Photosystem PSII, PSI, cytochrome b6f (Cyt b6f) and ATPase are all multiprotein complexes with distinct orientation and dynamics in the thylakoid membrane. Valuable information about the composition and interactions of the protein complexes in the thylakoid membrane can be obtained by solubilizing the complexes from the membrane integrity by mild detergents followed by native gel electrophoretic separation of the complexes. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) is an analytical method used for the separation of protein complexes in their native and functional form. The method can be used for protein complex purification for more detailed structural analysis, but it also provides a tool to dissect the dynamic interactions between the protein complexes. The method was developed for the analysis of mitochondrial respiratory protein complexes, but has since been optimized and improved for the dissection of the thylakoid protein complexes. Here, we provide a detailed up-to-date protocol for analysis of labile photosynthetic protein complexes and their interactions in Arabidopsis thaliana.

A protocol for the elucidation of plant thylakoid protein complex organization and composition with blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) and 2D-SDS-PAGE is described. The protocol is optimized for Arabidopsis thaliana, but can be used for other plant species with minor modifications.

Análise de complexos de proteínas de membrana tilacoides por electroforese em Gel azul nativo

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and the degradation of target proteins in live cells. By using short (pulse) radiolabeling times (&lt;30 min) and tightly controlled chase times, it is possible to label only a small fraction of the total protein pool and follow its folding. When combined with nonreducing/reducing SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoprecipitation with (conformation-specific) antibodies, folding processes can be examined in great detail. This system has been used to analyze the folding of proteins with a huge variation in properties such as soluble proteins, single and multi-pass transmembrane proteins, heavily N- and O-glycosylated proteins, and proteins with and without extensive disulfide bonding. Pulse-chase methods are the basis of kinetic studies into a range of additional features, including co- and posttranslational modifications, oligomerization, and polymerization, essentially allowing the analysis of a protein from birth to death. Pulse-chase studies on protein folding are complementary with other biochemical and biophysical methods for studying proteins in vitro by providing increased temporal resolution and physiological information. The methods as described within this paper are adapted easily to study the folding of almost any protein that can be expressed in mammalian or insect-cell systems.

Here we describe a protocol for a general pulse-chase method that allows the kinetic analysis of folding, transport, and degradation of proteins to be followed in live cells.

Análise de proteínas, transporte e degradação em células vivas por pulso radioativo Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Real-time Observation of the DNA Strand Exchange Reaction Mediated by Rad51

The DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 is a critical step of homologous recombination. In this reaction, Rad51 forms a nucleoprotein filament on single-stranded DNA (ssDNA) and captures double-stranded DNA (dsDNA) non-specifically to interrogate it for a homologous sequence. After encountering homology, Rad51 catalyzes DNA strand exchange to mediate pairing of the ssDNA with the complementary strand of the dsDNA. This reaction is highly regulated by numerous accessary proteins in vivo. Although conventional biochemical assays have been successfully employed to examine the role of such accessory protein in vitro, kinetic analysis of intermediate formation and its progression into a final product has proven challenging due to the unstable and transient nature of the reaction intermediates. To observe these reaction steps directly in solution, fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based real-time observation systems of this reaction were established. Kinetic analysis of real-time observations shows that the DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 obeys a three-step reaction model involving the formation of a three-strand DNA intermediate, maturation of this intermediate, and the release of ssDNA from the mature intermediate. The Swi5-Sfr1 complex, an accessary protein conserved in eukaryotes, strongly enhances the second and third steps of this reaction. The FRET-based assays presented here enable us to uncover the molecular mechanisms through which recombination accessary proteins stimulate the DNA strand exchange activity of Rad51. The primary goal of this protocol is to enhance the repertoire of techniques available to researchers in the field of homologous recombination, particularly those working with proteins from species other than Schizosaccharomyces pombe, so that the evolutionary conservation of the findings presented herein can be determined.

Fluorescence resonance energy transfer-based real-time observation systems of the DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 were developed. Using the protocols presented here, we are able to detect the formation of reaction intermediates and their conversion into products, while also analyzing the enzymatic kinetics of the reaction.

Observação em tempo real da reação de troca de fita de DNA mediada por Rad51

The DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 is a critical step of homologous recombination. In this reaction, Rad51 forms a nucleoprotein filament ...

Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer structural and functional advantages to mitochondria. SCs have been identified in many species, from yeast to mammal, and an increasing number of studies report disruption of their organization in genetic and acquired human diseases. As a result, an increasing number of laboratories are interested in analyzing SCs, which can be methodologically challenging. This article presents an optimized protocol that combines the advantages of Blue- and Clear-Native PAGE methods to resolve and analyze SCs in a time-effective manner. With this hybrid CN/BN-PAGE method, mitochondrial SCs extracted with optimal amounts of the mild detergent digitonin are exposed briefly to the anionic dye Coomassie Blue (CB) at the beginning of the electrophoresis, without exposure to other detergents. This short exposure to CB allows to separate and resolve SCs as effectively as with traditional BN-PAGE methods, while avoiding the negative impact of high CB levels on in-gel activity assays, and labile protein-protein interactions within SCs. With this protocol it is thus possible to combine precise and rapid in gel activity measurements with analytical techniques involving 2D electrophoresis, immuno-detection, and/or proteomics for advanced analysis of SCs.

Here we present a protocol to extract, resolve and identify mitochondrial supercomplexes which minimizes exposure to detergents and Coomassie Blue. This protocol offers an optimal balance between resolution, and preservation of enzyme activities, while minimizing the risk of losing labile protein-protein interactions.

Eletroforese nativa clara/azul híbrida para a separação e análise de supercomplexos de cadeia respiratória mitocondrial

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed complexes. The latter can be elegantly resolved according to molecular size using native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Coupling of such separations to sensitive mass spectrometry (BN-MS) has been well-established and theoretically allows for exhaustive assessment of the extractable complexome in biological samples. However, this approach is rather laborious and provides limited complex size resolution and sensitivity. Also, its application has remained restricted to abundant mitochondrial and plastid proteins. Thus, for a majority of proteins, information regarding integration into stable protein complexes is still lacking. Presented here is an optimized approach for complexome profiling comprising preparative-scale BN-PAGE separation, sub-millimeter sampling of broad gel lanes by cryomicrotome slicing, and mass spectrometric analysis with label-free protein quantification. The procedures and tools for critical steps are described in detail. As an application, the report describes complexome analysis of a solubilized endosome-enriched membrane fraction from mouse kidneys, with 2,545 proteins profiled in total. The results demonstrate identification of uniform, low-abundance membrane proteins such as intracellular ion channels as well as high resolution, complex protein assembly patterns, including glycosylation isoforms. The results are in agreement with independent biochemical analyses. In summary, this methodology allows for comprehensive and unbiased identification of protein (super)complexes and their subunit composition, providing a basis for investigating stoichiometry, assembly, and interaction dynamics of protein complexes in any biological system.

A versatile cryoslicing BN-MS protocol using a microtome is presented for high-resolution complexome profiling.

Perfilamento Complexome de alta resolução por Cryoslicing BN-MS Analysis

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...

Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the cell by controlling protein stability, activity, interactions, and intracellular localization. They enable the cell to respond to signals and to adapt to changes in its environment. Alterations within these mechanisms can lead to severe pathological situations such as neurodegenerative diseases and cancers. The aim of the technique described here is to establish ub/ubls dependent PTMs profiles, rapidly and accurately, from cultured cell lines. The comparison of different profiles obtained from different conditions allows the identification of specific alterations, such as those induced by a treatment for example. Lentiviral mediated cell transduction is performed to create stable cell lines expressing a two-tags (6His and Flag) version of the modifier (ubiquitin or a ubl such as SUMO1 or Nedd8). These tags permit the purification of ubiquitin and therefore of ubiquitinated proteins from the cells. This is done through a two-step purification process: The first one is performed in denaturing conditions using the 6His tag, and the second one in native conditions using the Flag tag. This leads to a highly specific and pure isolation of modified proteins which are subsequently identified and semi-quantified by liquid chromatography followed by tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) technology. Easy informatics analysis of MS data using Excel software enables the establishment of PTM profiles by eliminating background signals. These profiles are compared between each condition in order to identify specific alterations which will then be studied more specifically, starting with their validation by standard biochemistry techniques.

This protocol aims at establishing ubiquitin (Ub) and ubiquitin-likes (Ubls) specific proteomes in order to identify alterations of these kind of post-translational modifications (PTMs), associated with a specific condition such as a treatment or a phenotype.

Perfil de Ubiquitin e Ubiquitin-like Modificações pós-translacionais dependentes e identificação de alterações significativas

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

Functional Characterization of RING-Type E3 Ubiquitin Ligases In Vitro and In Planta

Ubiquitination, as a posttranslational modification of proteins, plays an important regulatory role in homeostasis of eukaryotic cells. The covalent attachment of 76 amino acid ubiquitin modifiers to a target protein, depending on the length and topology of the polyubiquitin chain, can result in different outcomes ranging from protein degradation to changes in the localization and/or activity of modified protein. Three enzymes sequentially catalyze the ubiquitination process: E1 ubiquitin-activating enzyme, E2 ubiquitin-conjugating enzyme, and E3 ubiquitin ligase. E3 ubiquitin ligase determines substrate specificity and, therefore, represents a very interesting study subject. Here we present a comprehensive approach to study the relationship between the enzymatic activity and function of the RING-type E3 ubiquitin ligase. This four-step protocol describes 1) how to generate an E3 ligase deficient mutant through site-directed mutagenesis targeted at the conserved RING domain; 2&#8211;3) how to examine the ubiquitination activity both in vitro and in planta; 4) how to link those biochemical analysis to the biological significance of the tested protein. Generation of an E3 ligase-deficient mutant that still interacts with its substrate but no longer ubiquitinates it for degradation facilitates the testing of enzyme-substrate interactions in vivo. Furthermore, the mutation in the conserved RING domain often confers a dominant negative phenotype that can be utilized in functional knockout studies as an alternative approach to an RNA-interference approach. Our methods were optimized to investigate the biological role of the plant parasitic nematode effector RHA1B, which hijacks the host ubiquitination system in plant cells to promote parasitism. With slight modification of the in vivo expression system, this protocol can be applied to the analysis of any RING-type E3 ligase regardless of its origins.

The goal of this manuscript is to present an outline for the comprehensive biochemical and functional studies of the RING-type E3 ubiquitin ligases. This multistep pipeline, with detailed protocols, validates an enzymatic activity of the tested protein and demonstrates how to link the activity to function.

Caracterização funcional do RING-Tipo E3 Ubiquitin Ligases In Vitro e In Planta

Ubiquitination, as a posttranslational modification of proteins, plays an important regulatory role in homeostasis of eukaryotic cells. The covalent ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk population methods (Northern blot, PCR, and RNAseq) that measure mRNA levels lack the ability to provide information on cell-to-cell variation in responses. Precise single cell and allelic visualization and quantification is possible via single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH). RNA-FISH is performed by hybridizing target RNAs with labeled oligonucleotide probes. These can be imaged in medium/high throughput modalities, and, through image analysis pipelines, provide quantitative data on both mature and nascent RNAs, all at the single cell level. The fixation, permeabilization, hybridization and imaging steps have been optimized in the lab over many years using the model system described herein, which results in successful and robust single cell analysis of smFISH labeling. The main goal with sample preparation and processing is to produce high quality images characterized by a high signal-to-noise ratio to reduce false positives and provide data that are more accurate. Here, we present a protocol describing the pipeline from sample preparation to data analysis in conjunction with suggestions and optimization steps to tailor to specific samples.&#160;

Single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a method to accurately quantify levels and localization of specific RNAs at the single cell level. Here, we report our validated lab protocols for wet-bench processing, imaging and image analysis for single cell quantification of specific RNAs.

Análise celular única de alelos ativos transcricionralmente por peixe de molécula única

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Isolation and Analysis of Plasma Lipoproteins by Ultracentrifugation

Analysis of plasma lipoproteins and apolipoproteins is an essential part for the diagnosis of dyslipidemia and studies of lipid metabolism and atherosclerosis. Although there are several methods for analyzing plasma lipoproteins, ultracentrifugation is still one of the most popular and reliable methods. Because of its intact separation procedure, the lipoprotein fractions isolated by this method can be used for analysis of lipoproteins, apolipoproteins, proteomes, and functional study of lipoproteins with cultured cells in vitro. Here, we provide a detailed protocol to isolate seven lipoprotein fractions including VLDL (d&#60;1.006 g/mL), IDL (d=1.02 g/mL), LDLs (d=1.04 and 1.06 g/mL), HDLs (d=1.08, 1.10, and 1.21 g/mL) from rabbit plasma using sequential floating ultracentrifugation. In addition, we introduce the readers how to analyze apolipoproteins such as apoA-I, apoB, and apoE by SDS-PAGE and Western blotting and show representative results of lipoprotein and apolipoprotein profiles using hyperlipidemic rabbit models. This method can become a standard protocol for both clinicians and basic scientists to analyze lipoprotein functions.

Several methods have been used for analyzing plasma lipoproteins; however, ultracentrifugation is still one of the most popular and reliable methods. Here, we describe a method regarding how to isolate lipoproteins from plasma using sequential density ultracentrifugation and how to analyze the apolipoproteins for both diagnostic and research purposes.