WPS foi apoiado em parte por subvenções dos Institutos Nacionais de Saúde (CA129359), a Susan G. Komen para a Fundação Cure (BCTR0706967), o Departamento de Defesa (BC084561), eo Seidman Cancer Center, enquanto MKW foi apoiado por uma bolsa da American Cancer Society (PF-09-120-01). Suporte adicional para este trabalho foi fornecido pelo Centro de Caso para Imaging Research, o Caso Comprehensive Cancer Center (P30 CA43703), e do Centro de Fibrose Cística (P30 DK027651).

1. Expressão estável de CMV-Driven Luciferase Renilla <ol><li> Transfecção e selecção de uma população clonal estável é o método preferido para a expressão deste repórter luciferase Renilla. Esta abordagem proporciona um mais consistente e uniforme, a expressão da luciferase de Renilla, após a introdução subsequente de outras construções repórter secundário (por exemplo, luciferase de pirilampo ou proteínas fluorescentes). </li><li> Transfectar as células malignas de interesse com a expressão de luciferase de Renilla vector que codifica, como pcDNA3.1-Hygro ou outro plasmídeo marcador seleccionável um. </li><li> Após transfecção, coloque os transfectantes com uma concentração de antibiótico optimizado para vários dia-a-semana a fim de facilitar o isolamento de colónias individuais, as quais são subsequentemente isolados individualmente e subcultivadas. </li><li> Seleccione ≥ 10 individuais Renilla luciferase expressam colónias para monitorizar a extensão da expressão de Renilla. </li><li&gt; As colónias que expressam quantidades elevadas de luciferase Renilla são subsequentemente submetidas a análise funcional de garantir que as propriedades (i) fisiopatológicos de suas contrapartes parentais são retidos, e (ii) os valores de expressão Renilla não se desviem ou mudar com o tempo. Estes passos são absolutamente essenciais para evitar isolar e estudar variantes clonais / desviantes, e para validar a integração adequada do arquétipo Renilla no genoma. </li><li> Uma vez que um transfectante estável é isolado e verificado, pode-se remover a pressão selectiva e estar certo de que a expressão de luciferase de Renilla permanecerá constante durante longos períodos de tempo, tanto in vitro como in vivo. </li></ol> 2. Expressão, seleção e verificação funcional do Promotor induzível-Driven Firefly luciferase <ol><li> Subclonar o promotor de interesse para um repórter de luciferase pGL4 plasmídeo portador de um marcador seleccionável (por exemplo, puromycin) que é diferente do que é utilizado para seleccionar para a expressão estável de Renilla (por exemplo, a higromicina). </li><li> Transfectar células malignas tal como no Passo I, e, subsequentemente, para seleccionar uma população estável policlonal de luciferase do pirilampo células que expressam. Porque o local onde um gene relatório integra no genoma pode provocar efeitos erradas em sua expressão e regulação, recomenda-se fortemente para selecionar para as populações policlonais de Firefly luciferase células que expressam ao contrário de populações clonais para assegurar que (i) a expressão do gene repórter reflecte melhor que a do gene endógeno em células parentais, e (ii) efeitos na expressão do gene de integração são calculados e diminuída através da população celular heterogénea. </li><li> As células malignas projetados para expressar de forma estável tanto Renilla e luciferases vaga-lume são colectivamente referidos como dupla células repórter bioluminescentes, ou células DBR. </li><li> Usando &lt;tradicionalem&gt; in vitro de células com base em ensaios de gene repórter de luciferase, verificar que as células do DBR regulam a expressão de luciferase do pirilampo, positiva ou negativamente, de um modo concordante com o observado em células parentais transitoriamente transfectadas com estes vectores. Da mesma forma, verificar que o CMV-driven expressão de Renilla não é regulada por estímulos de células diferentes ou condições de tratamento. </li><li> Para isso, a cultura e as células parentais DBR em placas de 24 poços, e, subsequentemente, transientemente co-transfectar as células parentais com o original CMV-Renilla e promotor-firefly construções usadas para gerar células de DBR. </li><li> Depois disso, o tratamento DBR e transfectadas células parentais com factores ou agentes farmacológicos conhecidos para regular o promotor de interesse, e, subsequentemente quantificar pirilampo e da Renilla usando o Promega luminescência Kit de ensaio de luciferase duplo. </li></ol> 3. Estabelecer 4T1 primárias tumores mamários <ol><li> Metastático 4T1 células de carcinoma mamário quere encontrada para agentes patogénicos falta adventícias roedores foram projetadas para expressar de forma estável uma luciferase Renilla CMV-driven (pcDNA3.1-CMV-Renilla luciferase-hygro) e um SBE-driven luciferase de pirilampo (pGL4.2-SBE-luciferase do pirilampo-puro) como descrito acima. Enxerto ortotópico destas células de cancro da mama, resulta na formação de metástases espontâneas principalmente nos pulmões. </li><li> Células 4T1 não deve ser deixada atingir a confluência, durante a sua propagação em 2 dimensões tradicionais sistemas de cultura de tecidos, e que devem ser passadas no dia anterior a sua inoculação em vivo. </li><li> Células 4T1 deve ser dissociada por tripsinização, lavados em meio de crescimento, e diluído em PBS para uma concentração de 2x10 5 células / ml e imediatamente armazenados em gelo. </li><li> Fêmeas Balb / C fêmeas (4-6 semanas de idade) devem ser anestesiados com uma dose de indução de 3% de isoflurano e mantidos sob anestesia com uma dose de 1% de isoflurano. Prepare o local da injecção limpando com70% de álcool isopropílico. Usando uma pinça, gentilmente segure e levante a almofada inguinal 4 mamária. Com cuidado, coloque um medidor de 27,5 lado bisel da agulha e injetar-se na almofada mamária gordura diretamente sob o mamilo, tendo especial cuidado para não empurrar a agulha na cavidade abdominal. Libertar a glândula e injectar lentamente 50 ul da suspensão de células (1x10 4 células) na almofada de gordura mamaria. </li></ol> 4. Imagem dupla inicial Luminescent <ol><li> Imediatamente após enxerto de células 4T1 para a almofada de gordura mamaria e quando os ratos são ainda anestesiados, injectar 100 ul de celenterazina RediJect na veia lateral da cauda. Esta é a concentração de substrato óptimo recomendado pelo fornecedor e melhor tolerados pelo animal. </li><li> Imediatamente coloque o mouse no cone do nariz isoflurano dentro do sistema de imagem IVIS-200 e adquirir uma imagem 0,5-1 minutos luminescente. Eficiência entre a injecção ea aquisição de imagem é muito importante, como o sinal depara a luciferase Renilla cai precipitadamente ~ 30 segundos após a injecção. Posicione o mouse de volta para sua gaiola e permitir que ele se recuperar por ≥ 1 hora, o que garante que qualquer sinal luciferase residual Renilla se dissipou e que o mouse está totalmente recuperado da anestesia. </li><li> Administrar 150 mg / kg de D-luciferina sal de potássio através de injecção IP e esperar 5 minutos. Esta é a concentração ideal de D-luciferina, que fornece um sinal luminescente estável durante 5-15 minutos após a sua injecção em animais de teste. Anestesiar o rato usando isoflourane e substituir no IVIS-200, tendo o cuidado de colocar o animal em uma posição muito semelhante em relação à aquisição original Renilla. A intensidade deste sinal global firefly irá depender da actividade do promotor de interesse, e, como tal, a actividade de luciferase de pirilampo podem visualizar requerem tempos de aquisição prolongados. </li><li> Usando o software IVIS imagem viva definido como &quot;fótons&quot; modo, estabelecer values, tanto para a Renilla e aquisições firefly como um meio para estabelecer relações de linha de base em relação de luminescência (RLR). </li></ol> 5. Longitudinal Luminescent imagem <ol><li> Células 4T1 são altamente agressivo, tal que a inoculação de 1x10 4 células, tipicamente, leva à formação de tumores palpáveis ​​dentro de 1 semana, e com a letalidade do animal dentro de 4-5 semanas. Tumores 4T1 têm uma tendência inerente ulceram na semana 4. O crescimento e a manutenção de tumores ulcerados requerem aprovação IACUC separado. Os estudos de tumores 4T1 aqui apresentados foram aprovados pelo IACUC na Case Western Reserve University. </li><li> Como descrito acima, deve ser injectado ratinhos semanalmente com coelenterazina RediJect para monitorar o crescimento de tumores e metástases em geral, bem como com D-luciferina para monitorar via específica de sinalização durante várias fases de desenvolvimento do tumor. Tenha o cuidado de cada vez para assegurar o sinal de luciferase Renilla foi completamente dissipado antes da aquisiçãodo sinal de luciferase do pirilampo. </li><li> Como tumores 4T1 desenvolver e progresso, Renilla luciferase aquisições devem ser normalizados para os valores iniciais de Renilla medidos no momento da inoculação de células tumorais, como um meio para normalizar e controlar o crescimento do tumor primário. Mais importante ainda, o cálculo dos valores RLR ao longo do tempo irá estabelecer a regulação temporal de sistemas de sinalização individuais relativos ao crescimento do tumor e de progressão. </li><li> Metástase pulmonar manifesta torna-se aparente dentro de 3-4 semanas após o enxerto de células 4T1 para a almofada de gordura mamaria. Comparando os valores RLR pulmonares versus aqueles calculados para o tumor primário estabelece a regulação espacial de sistemas individuais de sinalização relativas ao crescimento de tumores e metástases. </li></ol> 6. Imagem Bioluminescent dupla de dois tipos de células únicas em um único animal <ol><li> Engineer uma linha celular de cancro da mama para estavelmente luciferase Renilla expressão CMV-driven como descrito acima. Repita esteprocesso de engenharia usando CMV-driven luciferase firefly em uma distinta linha de mama segunda célula cancerosa. </li><li> Aqui nós misturado Renilla luciferase-expressando células 4T1 com as suas metástases e isogénica luciferase do pirilampo que expressam homólogos 4T07 10, 11. Estas razões variáveis ​​de populações mistas de células de cancro da mama são posteriormente injectado na almofada de gordura mamaria, conforme descrito acima. </li><li> Imediatamente adquirir tanto vaga-lume e Renilla imagens luciferase para estabelecer representante RLRs inicial de uma mistura determinada célula inoculado. </li><li> Imagiologia bioluminescente dupla longitudinal irá visualizar e controlar as alterações na composição celular dentro do tumor primário, bem como o espaço temporal metástase de cada derivado do cancro da mama em relação ao crescimento e progressão tumoral. </li><li> Alternativamente, as populações de células individuais da mama cancro podem ser inoculadas em diferentes locais no rato (ou seja, os direitos e esquerdos mamárias almofadas de gordura abdominal)para avaliar a influência sistémica nestas duas populações apresentam uma sobre a outra durante as várias etapas de crescimento de tumores e metástases. </li></ol> 7. Resultados representativos: A maior força de imagiologia bioluminescente dupla encontra-se no facto de cada imagem é internamente consistente e controlada, de tal modo que os sinais contínuos derivados da função tumor primário como uma métrica importante para medir o sucesso ou a falha de cada Renilla e aquisição do pirilampo. Este aspecto do procedimento de imagem é particularmente importante durante a aquisição da actividade da luciferase de Renilla, cuja celenterazina substrato é altamente sensível à oxidação que resulta na sua capacidade de auto-luminescência. A Figura 1A mostra um exemplo deste efeito colateral, a qual se manifesta como imediatamente inespecíficas sinais luminescentes derivados a partir do tracto intestinal e não o tumor primário estabelecido. Normalmente, esses celenterazina inespecífica sinaliza transpirseguinte e falhou injecções intravenosas de este substrato Renilla luciferase. No entanto, uma vez que os sinais robustos primárias derivadas de tumor Renilla foram obtidos (Figura 1B, a imagem esquerda), é seguro para continuar a capturar as medições da via de sinalização específicos derivados de imagiologia luciferase de pirilampo (figura 1B, painel da direita), cuja D-luciferina substrato é altamente estável após a injecção IP e produz níveis negligenciáveis ​​de fundo auto-luminescência. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3245/3245fig1.jpg" /> Figura 1. Adquirir Renilla e firefly-derivado imagens bioluminescentes para calcular em RLRs in vivo. (A) Um exemplo de uma injecção IV de celenterazina falhou resultando em sinal não específico a partir do tracto intestinal. Círculo e PT indicar a localização aproximada do tumor primário. (B) A aquisição Renilla bem sucedida de um rato tendo um tumor primário e 4T1 pmetástases ulmonary (painel esquerdo; 4wk após enxerto almofada de gordura). A aquisição de pirilampo correspondente permite o cálculo de RLRs de ambos o tumor primário e as suas metástases pulmonares. (C) Representação gráfica do tumor primário e as metástases pulmonares RLRs calculado a partir de ratos mostrados no painel B (n = 4).

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Biomed. Opt. 13, 054035-054035 (2008).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O poder absoluto de técnicas de imagem de bioluminescência reside na sua capacidade de quantificar o crescimento de tumores e metástases em complexos estudos longitudinais, que aqui envolveu o uso de células de câncer agressivo 4T1 mama. Porque estes processos dependem da integração estável de ambos os constructos de repórter de luciferase, estas técnicas podem ser prontamente adaptada e traduzida para outras linhas de células cancerosas de diferentes latências tumorais metastáticas e capacidades. Similar aos resultados apresentados no presente documento, o cálculo RLRs específicos dentro lentamente a desenvolver os tumores primários e as suas metástases eventuais permite a identificação em tempo real spatiotemporal de eventos de sinalização específicos que ocorrem durante a progressão de tumores metastáticos, independentemente do seu tempo de latência. Após a identificação dos eventos específicos do promotor de regulação, é importante tanto para extirpar o tumor primário e as suas lesões metastáticas para o desempenho de imuno-histoquímica e padrão differentiaanálises de expressão de genes para verificar l regulação semelhante do gene endógeno e / ou proteína. Tecnicamente falando, o principal desafio da dupla análises bioluminescentes reside na duração relativamente curta dos sinais Renilla luciferase. Como tal, esta técnica de imagem requer optimização significativo do processo de injecção na veia da cauda, ​​bem como a criação de imagens imediato, de animais injectados individualmente, um processo que consome tempo e é relativamente pouco eficiente para imagiologia da luciferase do pirilampo. Recentemente, introduziu Promega &quot;Viviren&quot;, o qual representa um substrato de luciferase de segunda geração cujos locais de oxidação são bloqueados por esterificação até esta entrada ganhos molécula nas células, altura em que a molécula seja rapidamente des-esterificada. Colectivamente, este novo substrato reduz eficazmente modificação auto-luminescência e não específica e / ou acoplado a degradação induzida por Renilla 12 auto-luminescência. Ao fazer isso, esse novo renillum substrato de luciferase produz mais brilhantes sinais luminescentes, no entanto, os custos excessivos associados à aquisição e à utilização de &quot;Viviren&quot; tenha fornecido relativamente poucos estudos necessários para avaliar a utilidade geral deste substrato em duas análises bioluminescentes. Por fim, a sensibilidade de qualquer ensaio bioluminescente é criticamente dependente da câmara CCD operante em adquirir unidades de luz individuais. De fato, como estas tecnologias melhoram, prevemos um ponto no futuro onde a nossa capacidade de visualizar complexos luz reações mediadas bioluminescentes podem acontecer de forma eficiente em animais livres em movimento 13.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> pGL4.2-Puro [luc2 / Puro] Vetor </td><td> Promega </td><td> E6751 </td></tr><tr><td> Glomax sistema Mult-idection </td><td> Promega </td><td></td></tr><tr><td> IVIS série 200 </td><td> Caliper Life Sciences </td><td></td></tr><tr><td> Sistema de ensaio de luciferase duplo repórter </td><td> Promega </td><td> E1960 </td></tr><tr><td> Rediject celenterazina-h </td><td> Caliper Life Sciences </td><td> 760506 </td></tr><tr><td> D-luciferina K-Sal </td><td> Caliper Life Sciences </td><td> 122796 </td></tr></tbody></table>

in vivo dual substrate bioluminescent imaging

Nossa compreensão de como e quando as células do câncer de mama trânsito de tumores primários estabelecidos para locais metastáticos tem aumentado a um ritmo excepcional desde o advento da in vivo bioluminescente tecnologias de imagem 1-3. Com efeito, a capacidade de localizar e quantificar o crescimento do tumor longitudinalmente em uma única coorte de animais para a conclusão do estudo, em oposição a sacrificar a grupos individuais de animais em tempos de ensaio específicas revolucionou como os pesquisadores investigar a metástase do cancro da mama. Infelizmente, as metodologias actuais impede a avaliação em tempo real das alterações críticas que ocorrem em sistemas de sinalização celular, como as células do cancro da mama (i) evoluir dentro de tumores primários, (ii) disseminar por todo o corpo, e (iii) reiniciar programas proliferativas em locais de um metástase. No entanto, os recentes avanços na imagem de bioluminescência agora tornam possível quantificar simultaneamente spatiotempor específicaal mudanças na expressão de genes, como uma função do desenvolvimento do tumor e de progressão metastática, através do uso de reacções de luminescência dupla de substrato. Para fazer isso, os investigadores aproveitar para duas enzimas que produzem luz de luciferase isoladas do pirilampo (Photinus pyralis) e amor-perfeito do mar (Renilla reniformis), ambos os quais reagem a substratos que se excluem mutuamente, que anteriormente facilitada a sua utilização generalizada na célula em vitro baseados em ensaios de gene repórter 4. Aqui demonstramos a utilidade in vivo das duas enzimas tais que uma reacção luminescente especificamente marca o tamanho e local de um tumor em desenvolvimento, enquanto que a segunda reacção luminescente serve como um meio para visualizar o estado de activação de determinados sistemas de sinalização durante os estágios distintos de tumor e desenvolvimento de metástases. Assim, os objetivos deste estudo são duas vezes. Primeiro, vamos descrever os passos necessários para a construção de linha de celular dual bioluminescente repórters, bem como os necessários para facilitar a sua utilização na visualização da regulação da expressão do gene spatiotemporal durante os passos específicos da cascata metastática. Utilizando o modelo de 4T1 de metástases do cancro da mama, que mostram que a actividade in vivo de um elemento de ligação sintético Smad (SBE) promotor diminuiu dramaticamente em metástase pulmonar em comparação com a medida em que o tumor primário 4-6. Recentemente, a metástase do cancro da mama demonstrou ser regulada por alterações no microambiente do tumor primário e estroma reactivo, incluindo aqueles que ocorrem em fibroblastos e células infiltrantes imunes 7-9. Assim, o nosso segundo objectivo será o de demonstrar a utilidade de duas técnicas de bioluminescência no controlo do crescimento e da localização das duas populações de células únicas abrigado dentro de um único animal durante o crescimento do cancro da mama e metástases.

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In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

Aqui, descrevemos os métodos para construir, visualizar e quantificar as reações bioluminescentes de ambos vagalume e Renilla enzimas luciferase expressos em células de câncer de mama metastático durante o seu crescimento e metástase<em&gt; In vivo</em&gt;.

In vivo dupla Substrato Bioluminescent imagem

Our understanding of how and when breast cancer cells transit from established primary tumors to metastatic sites has increased at an exceptional rate ...

in-vivo-dual-substrate-bioluminescent-imaging

Research

JoVE Journal

Medicine

In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

15.3K visualizações.  Case Western Reserve University. Aqui, descrevemos os métodos para construir, visualizar e quantificar as reações bioluminescentes de ambos vagalume e Renilla enzimas luciferase expressos em células de câncer de mama metastático durante o seu crescimento e metástase In vivo.

Vídeo: In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

Murine Bioluminescent Hepatic Tumour Model

This video describes the establishment of liver metastases in a mouse model that can be subsequently analysed by bioluminescent imaging. Tumour cells are administered specifically to the liver to induce a localised liver tumour, via mobilisation of the spleen and splitting into two, leaving intact the vascular pedicle for each half of the spleen. Lewis lung carcinoma cells that constitutively express the firefly luciferase gene (luc1) are inoculated into one hemi-spleen which is then resected 10 minutes later. The other hemi-spleen is left intact and returned to the abdomen. Liver tumour growth can be monitored by bioluminescence imaging using the IVIS whole body imaging system. Quantitative imaging of tumour growth using IVIS provides precise quantitation of viable tumour cells. Tumour cell death and necrosis due to drug treatment is indicated early by a reduction in the bioluminescent signal. This mouse model allows for investigating the mechanisms underlying metastatic tumour-cell survival and growth and can be used for the evaluation of therapeutics of liver metastasis. 

This article describes a procedure for the induction of orthotopic bioluminescent liver tumours in mice, and subsequent analysis of tumour growth confined to the liver using live whole body luminescence imaging.

Modelo de tumor hepático murino Bioluminescent

This video describes the establishment of liver metastases in a mouse model that can be subsequently analysed by bioluminescent imaging. Tumour cells are ...

Medicina

Dual-mode Imaging of Cutaneous Tissue Oxygenation and Vascular Function

Accurate assessment of cutaneous tissue oxygenation and vascular function is important for appropriate detection, staging, and treatment of many health disorders such as chronic wounds. We report the development of a dual-mode imaging system for non-invasive and non-contact imaging of cutaneous tissue oxygenation and vascular function. The imaging system integrated an infrared camera, a CCD camera, a liquid crystal tunable filter and a high intensity fiber light source. A Labview interface was programmed for equipment control, synchronization, image acquisition, processing, and visualization. Multispectral images captured by the CCD camera were used to reconstruct the tissue oxygenation map. Dynamic thermographic images captured by the infrared camera were used to reconstruct the vascular function map. Cutaneous tissue oxygenation and vascular function images were co-registered through fiduciary markers. The performance characteristics of the dual-mode image system were tested in humans.

A dual-mode imaging system was developed for non-contact assessment of cutaneous tissue oxygenation and vascular function.

Dual-mode de imagem de oxigenação dos tecidos cutâneos e Função Vascular

Accurate assessment of cutaneous tissue oxygenation and vascular function is important for appropriate detection, staging, and treatment of many health ...

Intracranial Implantation with Subsequent 3D In Vivo Bioluminescent Imaging of Murine Gliomas

The mouse glioma 261 (GL261) is recognized as an in vivo model system that recapitulates many of the features of human glioblastoma multiforme (GBM). The cell line was originally induced by intracranial injection of 3-methyl-cholantrene into a C57BL/6 syngeneic mouse strain 1; therefore, immunologically competent C57BL/6 mice can be used. While we use GL261, the following protocol can be used for the implantation and monitoring of any intracranial mouse tumor model. GL261 cells were engineered to stably express firefly luciferase (GL261-luc). We also created the brighter GL261-luc2 cell line by stable transfection of the luc2 gene expressed from the CMV promoter. C57BL/6-cBrd/cBrd/Cr mice (albino variant of C57BL/6) from the National Cancer Institute, Frederick, MD were used to eliminate the light attenuation caused by black skin and fur. With the use of albino C57BL/6 mice; in vivo imaging using the IVIS Spectrum in vivo imaging system is possible from the day of implantation (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA). The GL261-luc and GL261-luc2 cell lines showed the same in vivo behavior as the parental GL261 cells. Some of the shared histological features present in human GBMs and this mouse model include: tumor necrosis, pseudopalisades, neovascularization, invasion, hypercellularity, and inflammation 1.
Prior to implantation animals were anesthetized by an intraperitoneal injection of ketamine (50 mg/kg), xylazine (5 mg/kg) and buprenorphine (0.05 mg/kg), placed in a stereotactic apparatus and an incision was made with a scalpel over the cranial midline. A burrhole was made 0.1mm posterior to the bregma and 2.3mm to the right of the midline. A needle was inserted to a depth of 3mm and withdrawn 0.4mm to a depth of 2.6mm. Two &mu;l of GL261-luc or GL261-luc2 cells (107 cells/ml) were infused over the course of 3 minutes. The burrhole was closed with bonewax and the incision was sutured.
Following stereotactic implantation the bioluminescent cells are detectable from the day of implantation and the tumor can be analyzed using the 3D image reconstruction feature of the IVIS Spectrum instrument. Animals receive a subcutaneous injection of 150&mu;g luciferin /kg body weight 20 min prior to imaging. Tumor burden is quantified using mean tumor bioluminescence over time. Tumor-bearing mice were observed daily to assess morbidity and were euthanized when one or more of the following symptoms are present: lethargy, failure to ambulate, hunched posture, failure to groom, anorexia resulting in &gt;10% loss of weight. Tumors were evident in all of the animals on necropsy.

Intracranial Implantation with Subsequent 3D In Vivo Bioluminescent Imaging of Murine Gliomas

Intracranial implantation of GL261 cells into C57BL/6 mice produces malignant gliomas that recapitulate many of the hallmarks of human glioblastoma multiforme. We used GL261 cells stably expressing luciferase to allow us to use in vivo imaging to follow tumor progression. The surgery and 3D in vivo imaging are demonstrated.

Implantação intracraniana com 3D subseqüentes In Vivo Bioluminescent imagem de Gliomas murino

The mouse glioma 261 (GL261) is recognized as an in vivo model system that recapitulates many of the features of human glioblastoma multiforme (GBM). The ...

Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

Glioblastoma multiforme (GBM) is a high-grade primary brain cancer with a median survival of only 14.6 months in humans despite standard tri-modality treatment consisting of surgical resection, post-operative radiation therapy and temozolomide chemotherapy 1. New therapeutic approaches are clearly needed to improve patient survival and quality of life. The development of more effective treatment strategies would be aided by animal models of GBM that recapitulate human disease yet allow serial imaging to monitor tumor growth and treatment response. In this paper, we describe our technique for the precise stereotactic implantation of bio-imageable GBM cancer cells into the brains of nude mice resulting in tumor xenografts that recapitulate key clinical features of GBM 2. This method yields tumors that are reproducible and are located in precise anatomic locations while allowing in vivo bioluminescent imaging to serially monitor intracranial xenograft growth and response to treatments 3-5. This method is also well-tolerated by the animals with low perioperative morbidity and mortality.

Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

We describe an integrated method for the precise, stereotactic implantation of human glioblastoma multiforme cells into the brains of nude mice and subsequent serial in vivo imaging to monitor growth and response to treatment of the resultant xenografts.

Implantação estereotáxica intracraniana e<em&gt; Em vivo</em&gt; Imaging Bioluminescent de xenoenxertos de tumores em um Sistema Modelo de Rato Glioblastoma Multiforme

Glioblastoma multiforme (GBM) is a high-grade primary brain cancer with a median survival of only 14.6 months in humans despite standard tri-modality ...

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite fluorescent in situ elements through the optical fibers, and then record some of the emitted photons, via the same optical fibers. The light source is a laser that sends the exciting light through an element within the fiber bundle and as it scans over the sample, recreates an image pixel by pixel. As this scan is very fast, by combining it with dedicated image processing software, images in real time with a frequency of 12 frames/sec can be obtained.
We developed a technique to quantitatively characterize capillary morphology and function, using a confocal fluorescence videomicroscopy device. The first step in our experiment was to record 5 sec movies in the four quadrants of the tumor to visualize the capillary network. All movies were processed using software (ImageCell, Mauna Kea Technology, Paris France) that performs an automated segmentation of vessels around a chosen diameter (10 &mu;m in our case). Thus, we could quantify the 'functional capillary density', which is the ratio between the total vessel area and the total area of the image. This parameter was a surrogate marker for microvascular density, usually measured using pathology tools.
The second step was to record movies of the tumor over 20 min to quantify leakage of the macromolecular contrast agent through the capillary wall into the interstitium. By measuring the ratio of signal intensity in the interstitium over that in the vessels, an 'index leakage' was obtained, acting as a surrogate marker for capillary permeability.

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

In this paper, we present a method to analyze tumor microvessels in vivo using dynamic contrast-enhanced fluorescence videomicroscopy. Two quantitative parameters were acquired: functional capillary density reflecting the vascularity of the tumor, and index leakage reflecting the leakiness of the endothelial wall.

Imagem in vivo da angiogênese tumoral utilizando fluorescência confocal Videomicroscopia

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite ...

Bioluminescent Orthotopic Model of Pancreatic Cancer Progression

Pancreatic cancer has an extremely poor five-year survival rate of 4-6%. New therapeutic options are critically needed and depend on improved understanding of pancreatic cancer biology. To better understand the interaction of cancer cells with the pancreatic microenvironment, we demonstrate an orthotopic model of pancreatic cancer that permits non-invasive monitoring of cancer progression. Luciferase-tagged pancreatic cancer cells are resuspended in Matrigel and delivered into the pancreatic tail during laparotomy. Matrigel solidifies at body temperature to prevent leakage of cancer cells during injection. Primary tumor growth and metastasis to distant organs are monitored following injection of the luciferase substrate luciferin, using in vivo imaging of bioluminescence emission from the cancer cells. In vivo imaging also may be used to track primary tumor recurrence after resection. This orthotopic model is suited to both syngeneic and xenograft models and may be used in pre-clinical trials to investigate the impact of novel anti-cancer therapeutics on the growth of the primary pancreatic tumor and metastasis.

Improved understanding of pancreatic cancer biology is critically needed to enable the development of better therapeutic options to treat pancreatic cancer. To address this need, we demonstrate an orthotopic model of pancreatic cancer that permits non-invasive monitoring of cancer progression using in vivo bioluminescence imaging.

Modelo ortotópico bioluminescente de progressão do câncer de pâncreas

Pancreatic cancer has an extremely poor five-year survival rate of 4-6%.  New therapeutic options are critically needed and depend on improved ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

In vivo 19 F MRI para Rastreamento celular

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

Neuroplasticity is an inherent feature of the enteric nervous system and gastrointestinal (GI) innervation under pathological conditions. However, the pathophysiological role of neuroplasticity in GI disorders remains unknown. Novel experimental models which allow simulation and modulation of GI neuroplasticity may enable enhanced appreciation of the contribution of neuroplasticity in particular GI diseases such as pancreatic cancer (PCa) and chronic pancreatitis (CP). Here, we present a protocol for simulation of pancreatic neuroplasticity under in vitro conditions using newborn rat dorsal root ganglia (DRG) and myenteric plexus (MP) neurons. This dual-neuron approach not only permits monitoring of both organ-intrinsic and -extrinsic neuroplasticity, but also represents a valuable tool to assess neuronal and glial morphology and electrophysiology. Moreover, it allows functional modulation of supplied microenvironmental contents for studying their impact on neuroplasticity. Once established, the present neuroplasticity assay bears the potential of being applicable to the study of neuroplasticity in any GI organ.

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

Neuronal plasticity is an increasingly recognized, but insufficiently understood feature of the gastrointestinal (GI) tract. Here, in the example of human pancreatic disorders, we present an in vitro neuroplasticity assay for the study of neuronal plasticity in the GI tract at both morphological and functional level.

Simulando pâncreas Neuroplasticidade:<em&gt; In Vitro</em&gt; Dual-neurônio Plasticidade Assay

Neuroplasticity is an inherent feature of the enteric nervous system and gastrointestinal (GI) innervation under pathological conditions. However, the ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

Seqüente<em&gt; In vivo</em&gt; Imagem de osteogênicas células-tronco / progenitoras durante o reparo de fratura

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

Certain classes of chemotherapies may exert acute vascular changes that may progress into long-term conditions that may predispose the patient to an increased risk of vascular morbidity.&#160;Yet, albeit&#160;the mounting clinical evidence, there is a paucity of clear studies of vascular toxicity and therefore the etiology of a heterogeneous group of vascular/cardiovascular disorders remains to be elucidated. Moreover, the mechanism that may underlie vascular toxicity can completely differ from the principles of chemotherapy-induced cardiotoxicity, which is related to direct myocyte injury. We have established a real-time, in vivo molecular imaging platform&#160;to evaluate&#160;the potential&#160;acute&#160;vascular toxicity of anti-cancer therapies.
We have set up a platform of in vivo, high-resolution molecular imaging&#160;in mice,&#160;suitable for visualizing vasculature within confined organs and reference blood vessels within the same individuals whereas each individual serve as its own control. Blood vessel walls were impaired after doxorubicin administration, representing a unique mechanism of vascular toxicity that may be the early event in end-organ injury. Herein, the method of fibered confocal fluorescent microscopy (FCFM) based imaging is described, which provides an innovative mode to understand physiological phenomena at the cellular and sub-cellular levels in animal subjects.

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

We herein describe the method of fibered confocal fluorescent microscopy (FCFM) based imaging, which provides an innovative mode to understand physiological phenomena at the cellular and sub-cellular levels in animal subjects.

Induzida pela quimioterapia Vascular Toxicidade - em tempo real<em&gt; In vivo</em&gt; Imagem de Impairment Vessel

Certain classes of chemotherapies may exert acute vascular changes that may progress into long-term conditions that may predispose the patient to an ...